Name: metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00
Duration: 10 min 56 s
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이 작업을 지원 했다 사우스 캐롤라이나 INBRE 교부 금에서 국립 연구소의 종합 의료 과학-NIH에 의해 (립에 P20GM103499) 국립 암 연구소에서 P.H.H. CA555536 및 CA154664를 부여 이 프로그램 지원 부분에서 전 대학 & 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 차 알 스턴의 대학에 교부 금에 의해 그리고 국립 센터에서 교부 금에 의해 연구 자원 (P20 RR016461 5) 그리고 국립 연구소의 일반 의료 과학 (8 P20 GM103499) 건강의 국가 학회에서.

1. 문화 및 대사 라벨
<ol><li>적절 한 환기를 허용 하도록 18 게이지 바늘 한 번 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 뚜껑의 중심 찌른. 보충된 살 균 7 H 9의 500 µ L를 접종 선발에서 M. smegmatis 의 5 µ L로 국물 문화 성장된 하룻밤12. 참고: 7 H 9의 1 리터에 대 한 제조 법 국물은: 4.7 g 상업 7 H 9 분말, 2 mL 글리세롤, 1 mL 트윈 80, 0.85 g NaCl, 5 g 알 부 민, 2 g 포도 당, H2O (1 l 총 볼륨 려).<ol>
<li>
(주의) 표준 radioprotection 관행에 따라 스파이크 [32P] 나2HPO420 µCi/mL와 함께 문화 미디어. 9 m m 두꺼운 아크릴 방패 뒤에 흔드는 인큐베이터에서 37 ° C와 1200 rpm 동요에서 박테리아 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Midlog 단계 (O.D.600 nm ~ 0.5)에서 전체 문화 2 mL 스크류 캡 튜브에 전송과 centrifuging 여 실 온에서 방사성 박테리아 작은 공의 10000 x g. 2 분 수집 표면에 뜨는 포함 비법 인된 방사성 orthophosphate에 대 한 적절 한 폐기물 컨테이너입니다.</li>
</ol>2입니다. 총 RNAs의 준비
참고: 총 RNAs (guanidinium 안산, 페 놀, 클로 프롬 포함) 상업적인 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 세균성 알갱이에서 추출 제조 업체의 프로토콜을 따르고.
<ol><li>상업적인 RNA 추출 시 약의 1 mL 및 펠 릿에 유리 구슬의 약 200 µ L를 추가 합니다. 튜브를 안전 하 게 뚜껑과 최대 교 반, 아래 2 분 동안 균질 화기에 박테리아를 방해 (번호 5 선택한 악기에 설정 ( 재료의 표참조)).</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 샘플 새로운 2 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬을 적절 하 게 삭제. 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 15 s. 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어</li>
	<li>낚시 튜브 45 °에 의해 새로운 관으로 샘플의 수성 단계를 수집 합니다. Interphase 또는 유기 레이어 그리기 하지 마십시오. 2 컬러 비례적의 µ L, 100% 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에 5 미 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어</li>
	<li>상쾌한 튜브에서 제거 하 고 적절 하 게 폐기 액체 분수 방사능의 흔적을 포함 수 있습니다. 공기 건조 펠 렛 5 분 후 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 마지막 X 2의 200 µ L에서 resuspend. 참고: 구성 주식 20 X SSC는 3.0 M NaCl, 0.3 M 나트륨 구 연산 염, pH 7.0.</li>
</ol>3입니다. 96 잘 프린터 접시의 준비
참고: tRNA microarrays 40 2 70-메 르 DNA oligonucleotides 8 핀 arrayer를 사용 하 여 각 M. smegmatis tRNA (터미널 CCA 제외)의 3' 끝에 보완 수동으로 인쇄 됩니다. DNA oligonucleotide 조사 잘 판에 배열 프로브 레이아웃의 시퀀스 제공 됩니다 (추가 파일 1-시트 1 ~ 3 각각).
<ol><li>디자인 DNA 프로브 검색 첫 번째 tRNA 시퀀스 또는 tRNA 인코딩 유전자 게놈 tRNA 등 tRNA 데이터베이스에서 데이터베이스13제공 합니다. 트림 보존 3' 끝 CCA 인코딩된 경우입니다. 보완 결과 시퀀스를 역방향. 주문 조사 처음 70 뉴클레오티드에 따라입니다.</li>
	<li>Resuspend는 DNA 프로브 물에 건조. 100 µ m 프로브 농도 조정 합니다. 96 잘 접시에서 3 X SSC, 0.01% (w/v) SDS 최종 (희석 60 µ L에 개별 잘 재고 프로브와 6 X SSC, 0.01% (w/v) SDS의 60 µ L에서에서 50 µ M oligos의 120 µ L를 준비.</li>
	<li>증발 또는 오염 방지 즉시 동결 하 고, 필요할 때까지-20 ° C에서 유지 하도록 깡통 호 일 접시 커버.</li>
</ol>4. 배열 인쇄
<ol><li>상 온 (약 20 분 소요)에서 96 잘 접시 녹여</li>
	<li>다이아몬드 펜 아민 코팅 유리 슬라이드 레이블. 슬라이드 인덱싱 장치에 놓습니다. 그리드 배치를 수행 하 고 다음과 같이 할.<ol>
<li>신중 하 게 우물에 복제기 핀 수영.</li>
		<li>부드럽게 인쇄 (작은 저항을 느낄 것 이다) 최소한의 압력을 사용 하 여 유리 슬라이드에 배열. Arrayer 블록 a 완료 될 때까지 청소 하지 않고 인쇄를 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 블록을 이동할 준비를 하는 경우 아래 설명 된 세척 절차를 따릅니다.<ol>
<li>5% 표 백제에 복제기와 부드럽게 악수.</li>
		<li>흡수 성 종이에 복제기를 누릅니다.</li>
		<li>복제기는 증류수에 찍어 부드럽게 흔들, 하 고 종이에 누릅니다. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>소 프로 파 놀에 복제기, 부드럽게 흔들어와 종이에 눌러.</li>
		<li>건조 한 약 20 팬에 복제기 96 잘 접시의 다음 블록을 이동 하기 전에 s. 인쇄의 원하는 번호를 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조 후 crosslink 254 nm UV crosslinker를 사용 하 여 슬라이드에 oligos 슬라이드 수 있습니다.<ol>
<li>999,990 µ / c m2에 에너지 레벨을 설정 합니다.</li>
		<li>crosslinker에 깨끗 한 표면에 슬라이드 얼굴을 올려. "시작"을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차단 차단 솔루션 자력, 실내 온도에 그리고 느린 동요의 밑에 450 mL에서 하룻밤 배열. 수집 및 재사용 차단 솔루션 최대 4 배. 참고: 차단 솔루션에 대 한 제조 법은: 125 m m 인산 버퍼 (NaH2포4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %SDS (w/v), 0.5 m m EDTA, 0.5 X SSC, 1 %BSA (w/v).</li>
	<li>500 mL의 증류수에 실 온에서 2 시간 5 분 대 한 슬라이드를 씻어. 슬라이드 10 centrifuging 여 건조 실내 온도 microarray 원심 분리기 s. 최대 6 개월까지 건조 하 고 어두운 장소에서 저장소 배열입니다.</li>
</ol>5. 배열 교 잡
<ol><li>교 잡 하기 전에 끓는 물에 슬라이드를 헹 구 고 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.</li>
	<li>교 잡 카세트 안에 배열을 놓고 방사선된 RNA 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>최대 재현성에 대 한 자동화 된 세척 교 잡 역을 실행 합니다.<ol>
<li>다음으로 프로그램 단계입니다. 75 ° c.에서 2 분에 대 한 조건 가스 켓 60 ° c.에 프로브를 소개 프로브 및 샘플 90 ° c.에서 5 분 변성 60 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 교배<ol>
<li>20 두 번 0.1 X SSC, 0.1 %SDS, 흐름 10 s와 42 ° C에 세척 슬라이드 s. 누르고 0.1로 두 번 42 ° C에서 20 미 세척 슬라이드 슬라이드 2 X SSC, 0.1% (w/v) SDS 흐름 10 s로 두 번 50 ° C에 세척 누르고 X SSC 흐름 10 s와 홀드 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.</li>
</ol>6. 배열 정량화
<ol><li>얇은 플라스틱 필름을 사용 하 여 슬라이드를 감싸 줍니다. 그것의 가장 중요 한 설정에가 거 카운터를 사용 하 여 방사성 신호에 대 한 슬라이드를 확인 합니다. 신호 강도 따라 10 ~ 90 h에 대 한 실내 온도에 노출 카세트에 저장 인광 체 스크린에 슬라이드를 표시 합니다. 참고:가 거 카운터의 감도 다른 하나의 장비에서 다, 노출 시간 낙관 되어야 한다 실험적으로.</li>
	<li>50 µ m 해상도 phosphorimager를 사용 하 여 슬라이드를 검사 합니다. 계량 하 고 배경 빼기 microarray 프로파일러와 함께 업그레이드 무료 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 각 조사 현장에서 방사능 농도.</li>
	<li>구성 하 고 전자 스프레드 시트를 사용 하 여 데이터를 처리 합니다. 조건부 서식 도구를 사용 하 여 열 맵을 생성 합니다. 대표 예 각 프로브 신호 (‰로 표현) 부분으로 총 프로브 신호.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

그러나 베타 입자 배출 시험된 범위에 방사선 셀 체력에 큰 영향을 주지 않습니다 bacteriostatic 및 살 균 에이전트14,으로 알려져 있습니다. 섬광 계산 보여주었다 방사능의 총 세포 추출 물 25% 및 그 후, 정제 총 RNAs의 1%에 통합 됩니다.
프로브 동일한 크기, 비교 용융 온도 및 GC 콘텐츠, macroarray 안보에 대 한 균일 한 프로토콜 함께 교 잡 및 정량화 자리 신호에서 직접 tRNA 레벨의 편견된 측정에 대 한 수 있습니다.
재현할 수 및 특정입니다. 그것의 넓은 동적 범위와 쉽게 조정 가능한 임계값 낮은 풍부한 종, tRNAs 배열 노출 시간9연장 하면 polysomes, 연관 프로 파일링 수 있습니다. 필요한 장비에 대 한 초기 투자 후 샘플, 소모품를 포함 하 여 당 비용 실행 샘플 당 $15를 평균 한다.
자리는 누구의 게놈은 프로브 디자인에 사용할 수 있는 모든 유기 체에 적용 됩니다. 생체 외에서 재배 되는 모델 생물 대사 라벨에 대 한 이상적인 후보자 이다. 포유류 게놈 종종 많은 isodecoders (동일한 anticodons를 공유 하지만 그들의 몸 시퀀스에서 작은 차이 표시 tRNAs) 인코딩으로 프로브 가까운 tRNA의 동종 하이브리드를 보존 하기 위해 부분적으로 퇴 화 될 필요가 있다. 마지막으로, 부착 포유류 세포에 M. smegmatis, 같은 문화 실질적으로 확장 될 필요가 성장 하는 유기 체에 비해 총 RNA의 일반적으로 낮은 금액을 산출 한다.

세포질 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스1,2,3등 조건에 따라 변동. 자리, tRNA, 관찰을 위한 효율적인 플랫폼 이며 원본, 신뢰할 수 있는, 실험실 성장 유기 체에서 전송 RNA 레벨의 신속 하 고 정확한 정량화를 허용 하는 간단 기술.
tRNAs 있다 현저 하 게 안정 된 2 차 및 3 차 구조4. 그들은 또한 수많은 post-transcriptional 수정5를 표시합니다. 이러한 기능은 중요 한 구조 및 시퀀스 검문소 바이어 싱 또는 때로는 직접적이 고 재현 tRNA 표준 벤치 마크 RNA 정량화 기법6을 사용 하 여 프로 파일링 방지를 나타냅니다. 전 세계 연구 단체 세포질 tRNA 수준을 평가 하 창조적인 하지만 종종 복잡 한 기술을 개발 하도록 강요 했다. 이러한 방법 중 일부를 포함: (1) 2 차원 전기 이동 별거 metabolically 레이블이 tRNAs의 조직적 자리 배정 북부 오 점1;에 의해 결합 (북부 여 2) 개별 정량화 되 신중 하 게 표준화 된 방사성 DNA 프로브7;를 사용 하 여 리 (microarray 분석3, 그리고 (4) 생체 외에서 의 tRNA 수정 반전 녹음 방송 결합 및 후속 재조합 demodification 효소를 사용 하 여 스트립 다음 cyanine 형광와 라벨 3) 게시물 추출 높 처리량 연속8.
자리는 2 개의 표준 및 간단 접근의 간단 하 고 원래의 조합: (1) RNA 몸, 성장 하는 유기 체, 방사성 총 RNAs tRNA (2) macroarrays, 체계적이 고 소형 게놈 도구의 합성에서으로 구성 된 tRNA 분리에 대 한 최적화.
샘플은 정량화 플랫폼에 살아있는 유기 체에서 간소화 됩니다. 그들은 직접 추출 후 분석 하 고 어떤 더 크게 증폭 후 추출 또는 효소 치료 기법에 비해 편견 제한 처리 되지 않습니다. 자리는 다양 하 고 식별 하 고 물리적으로 연결 된 리보솜 번역 tRNA 모집단 계량 polysome 분별에 쉽게 결합 될 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜은 진 균 smegmatis, 최적화 되어 있으며 그것은 또한 성공적으로 대장균9, Saccharomyces cerevisiae10, 마우스, 그리고 인간의 세포 배양11 프로필 tRNAs에 사용 되었다 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

전송 RNAs (tRNA)는 풍부한 짧은 비 코딩 RNA 종 일반적으로 76 ~ 90 뉴클레오티드 길이에서. tRNAs는 codons mRNA에 아미노산으로 변환 하 여 직접 단백질 합성에 대 한 책임이 있습니다. tRNAs 했다 긴 집 유지 분자 규제 기능 부족으로 간주 됩니다. 그러나, 증거의 성장 몸은 셀룰러 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스 등 다양 한 조건에 대응에 변동 나타냅니다. TRNA 식의 변동 진 번역을, 선호 또는 특정 단백질의 식을 억압에 직접 영향을 줍니다. 궁극적으로 단백질 합성의 동적 이해 높은-품질 tRNA 프로필을 제공할 수 있는 방법의 개발을 필요 합니다. 우리가 여기에 제시 하는 방법 자리 관찰 tRNA를 위한 간소화 된 플랫폼에 대 한 의미 하는 이름입니다. 자리 방사성 orthophosphate, guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 방사성 총 RNAs의 뒤와 세포 배양의 대사 라벨로 시작 하는 3 단계 구성 하 고 마지막으로 사내에 교 잡 인쇄 macroarrays입니다. tRNA 레벨은 각 조사 현장에서 방사능 농도 측정 하 여 견적 된다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리는 진 균 smegmatis mc2155, 결핵 연구에 모델 생물으로 자주 사용 nonpathogenic 박테리아에에서 tRNAs 프로필입니다.

3 개의 독립적인 생물 복제 쇼, 테스트 성장 조건, 모든 M. smegmatis tRNAs 배경 수준 (그림 1) 위에 표시 됩니다. 이 특정 실험에서 관찰 된 표준 편차 각 프로브에 대 한 2% (Arg (TCT)) 및 5% (그림 1)에서 평균 22% (Cys (GCA)) 사이 구성 됩니다. 복제 사이의 허위 변경 배열 준비 및 교 잡 같은 요인에 의해 크게 좌우 된다. 높은 재현성은 샘플 교 잡 자동화 뿐만 아니라 신중 하 고 일관성 있는 배열 인쇄를 통해 이루어집니다. TRNA 사이의 5 차이 Ile (GAT) 및 tRNA (발 (전술), 높고 낮은 풍부한 종 각각. 자리는 tRNA isoacceptors의 표현 유니폼을 보여줍니다. Isoacceptors는 동일한 아미노산을 개최 하지만 다른 anticodon 시퀀스를 표시 하 고 따라서 mRNAs에 다른 codons를 디코딩 종입니다. 반면 모든 알라닌 isoacceptors 비슷한 수준에서 표시 됩니다 예를 들어 수락 tRNAs 3-fold 다른 최고 및 최저 아르기닌.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> 그림 1: 대표적인 tRNA macroarray 결과. (A) Scanned 박테리아, 마우스 및 인간의 macroarrays M. smegmatis 배열 마우스 및 인간의 48 대신만 43 프로브를 사용합니다. 결과적으로, 세균성 배열 40 빈 관광 명소 (프로브는 각 배열에 8 번 복제 됩니다) 그 배경과 조화를 표시 합니다. 그들의 대부분 왼쪽된 상단 클러스터링 됩니다. 최적의 성장 조건 하에서 M. smegmatis 에 tRNA 프로필의 (B) 히스토그램 및 heatmap 표현. 프로브 신호 (를 포함 하 여 세균 성장, 신진 대사 라벨, 추출 및 배열 교 잡) 3 개의 독립적인 실험의 평균 이며, 총 tRNAs의 천 값에 의하여 표현 됩니다. 3 복제에 대 한 표준 편차는 각각 오차 막대와 막대 그래프와 heatmap에 오렌지의 음영으로 표시 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

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