Name: combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par la National base Research Programme of China (2012CB825504), Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (91232720 et 9163210042), Chinese Academy of Sciences (CAS) (GJHZ201302 et QYZDY-SSW-SMC015), Bill et Melinda Gates Programme de Fondation (OPP1119434) et 100-Talents d’autorités de certification à Zhu Y..

1. préparation de la chambre d’alimentation
Remarque : La chambre d’alimentation pour marquage colorant alimentaire test se compose de deux parties : le conteneur extérieur (comme un couvercle) et l’intérieur conteneur (comme source de nourriture).
<ol><li>Modifier le conteneur à l’extérieur d’un flacon de verre pour la culture des Drosophila (d’un diamètre intérieur de 31,8 mm) et une hauteur de 80 mm (Figure 1 a, ...

<ol>
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Ce rapport met l’accent sur le processus technique de tests alimentation colorant-étiquetage de la consommation alimentaire dans le contexte de thermogenetic et optogenetic activation pour manipuler des neurones contrôlant l’alimentation. Ce protocole simple et fiable vous aidera à élucider la fonction des neurones de candidat dans l’alimentation de contrôle, pour mesurer les préférences alimentaires des mouches et d’identifier de nouveaux joueurs dans l’alimentation des circuits de contrôle via écrans...

Quantifier la quantité de nourriture ingérée est importante pour évaluer les aspects multiples de l’alimentation des contrôles par le cerveau pour répondre aux besoins internes (tels que les États de la faim) et facteurs externes (tels que la qualité des aliments et la palatabilité)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. ces dernières années, les efforts de déchiffrage les substrats neurones de contrôle d’alimentation chez la drosophile mener à l’élaboration de multiples essais pour quantifier la quantité de nourriture ingérée directement ou de servir d’indicateur de l’alimentation de motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Le FEeder capillaire (CAFE) dosage12,13 a été développé pour mesurer la quantité de consommation d’aliments liquides dans un verre microcapillaire. Le dosage du café est très sensible et reproductible17 et simplifie la mesure de la consommation alimentaire, notamment pour quantifier l' alimentation à long terme18. Toutefois, ce test nécessite les mouches de grimper jusqu'à l’extrémité de la microcapillaire et nourrir la tête en bas, qui n’est pas approprié pour toutes les souches. En outre, parce que les mouches à tester à l’aide du test CAFE doivent être élevés sur la nourriture liquide, l’effet de ces conditions sur l’état du métabolisme ou la malnutrition potentielle d’élevage reste encore à déterminer.
Le Proboscis Extension réponse (PER) dosage11,14 compte la fréquence des réponses extension trompe vers douce touche de gouttes de nourriture. PAR test s’est révélé comme un excellent moyen d’évaluer l’alimentation motivation des mouche individuelle et des ânes l’influence de la palatabilité et le contenu des aliments18,19. Cependant, il n’est pas une quantification directe du montant de l’apport.
Récemment, une méthode semi-automatique, le manuel d’alimentation15de dosage (maltais), a été mis au point. En maltais, une seule mouche immobilisée est alimentée manuellement avec un microcapillaire contenant de la nourriture. Étant donné que les réponses d’extension de trompe et la consommation d’aliments peuvent être surveillés en même temps, MAFE est pertinente pour évaluer les valeurs nutritives et les effets des manipulations pharmacologiques. Cependant, immobiliser une mouche aurait un impact négatif sur sa performance comportementale, y compris l’alimentation.
En outre, fly Proboscis et détecteur d’activité (FlyPAD)10 a été développé pour mesurer automatiquement le comportement alimentaire. En utilisant les méthodes de machine vision, FlyPAD enregistre des interactions physiques entre une mouche et les aliments à quantifier la fréquence et la durée des extensions trompe comme un indicateur de l’alimentation de motivation. FlyPAD fournit une approche de haut-débit pour surveiller les comportements alimentaires d’une mouche de mouvement libre, même si la sensibilité et la robustesse de ce système reste à être confirmée par plusieurs études12.
Stratégies de marquage sont fréquemment utilisés pour estimer l’ingestion alimentaire chez les mouches. Il est fréquent d’étiqueter les aliments avec des traceurs chimiques et, après s’être nourries, mesurer la quantité de traceur ingéré pour calculer la quantité de nourriture absorbée. Permettre à traceurs radioactifs16,17,20,21,22,23,24,25 pour la détection à travers la cuticule sans homogénéisation des mouches. Cette méthode fournit remarquablement faible variabilité et une sensibilité élevée18et il serait possible d’étude à long terme de la prise alimentaire. Cependant, la disponibilité des radio-isotopes utilisables et différents taux d’absorption et d’excrétion devraient prendre en considération lorsque vous travaillez avec ce test.
Étiquetage et le traçage de la prise alimentaire avec les colorants alimentaires non toxiques est un plus sûr et plus simple variante2,3,26,27,28. Les mouches sont homogénéisés après s’être nourries avec des aliments contenant des colorants solubles et non résorbables, et le colorant ingéré plus tard doser à l’aide d’un spectrophotomètre3,24,28,29 . La stratégie d’étiquetage est facile à exécuter et fournit le rendement élevé, mais avec une mise en garde. Le volume de l’apport alimentaire estimé à partir de la teinture ingérée est plus petit que le volume réel parce que l’excrétion commence dès 15 min après le démarrage de mouches alimentation17. En outre, le test évalue ingestion alimentaire généralement dans un délai de 60 minutes, qui est conçu uniquement pour l’enquête de court terme alimentation comportement24,28. En outre, plusieurs facteurs internes et externes, tels que le génotype17, genre17, accouplés état17, élevage de densité30, rythme circadien31,32et nourriture de qualité3 , 8 , 16, influence la prise alimentaire. Par conséquent, la durée d’alimentation devrez peut-être être ajustée en fonction des conditions expérimentales spécifiques. En plus de faciliter la quantification de l’apport alimentaire, colorants alimentaires sont également utilisés pour évaluer la nourriture choix2,19,27et de visualiser le ménisque dans un microcapillaire CAFE test12.
Ici, nous introduisons une manipulation protocole combiné de l’activité neuronale avec colorant-étiquetage approche. Cette stratégie a été prouvée utile dans notre étude neurogénétique sur l’alimentation de contrôle dans la drosophile adulte24. La méthode de notation visuelle permet une estimation rapide de la consommation d’aliments ; ainsi, il est utile pour le dépistage par un grand nombre de souches en temps opportun. Les candidats de l’écran sont ensuite analysées en détail à l’aide d’une méthode colorimétrique pour fournir des objectifs et une quantification précise dans une autre étude.
Outre les tests alimentaires, nous décrivons également les thermogenetic27,33,34,35 optogenetic36 méthodes et d’activation par la force des neurones cibles chez la drosophile. Pour activer les neurones par thermogenetic opération est simple et pratique avec Drosophila Transient Receptor potentiels Ankyrin 1 (dTRPA1), qui est un canal cationique température - et voltage-dépendants qui augmente l’excitabilité neuronale lorsque la température ambiante la température s’élève au-dessus de 23 ° C33,37; Cependant, animaux à des températures élevées peut produire des effets indésirables sur le comportement. Une autre approche efficace pour activer les neurones chez la drosophile utilise optogenetics avec CsChrimson36, qui est une variante décalée vers le rouge de channelrhodopsin qui augmente l’excitabilité des neurones lorsqu’ils sont exposés à la lumière. Optogenetics offre la meilleure résolution temporelle et la moindre perturbation des comportements que thermogenetics. Combinant des mesures quantitatives de la prise alimentaire avec la manipulation de l’activité neuronale représente une approche efficace pour étudier les mécanismes neurones de l’alimentation.
Nous décrivons en détail la préparation de la chambre d’alimentation et les mouches à tester. À l’aide de mouches Taotie-Gal4 comme un modèle24, nous décrivons activation des neurones par thermogenetics et optogenetics. Deux essais de quantification de la consommation d’aliments avec marqués au colorant alimentaire sont également décrites dans le protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">UAS-CsChrimson</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td style="width:176px;">55135</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">UAS-dTrpA1</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td>26263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDC1-GAL4&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td style="width:176px;">9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">TDC2-GAL4</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td style="width:176px;">9313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">sNPF-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Z. Zhao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NPF-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TH-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-HT-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AKH-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dip2-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Taotie-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by J. Carlson</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Agarose</td>
			<td>Biowest</td>
			<td style="width:176px;">G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:176px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erioglaucine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">all-trans-retinal&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:176px;">R2500</td>
			<td>stored in darkness</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:163px;">Amresco</td>
			<td>9002-93-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="146">
			<td height="146" style="height:146px;width:332px;">Fly food</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:176px;">1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;">&#160;1x PBS buffer&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:176px;">1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">PBST buffer</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td colspan="2">1X PBS with 1% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Grinding mill</td>
			<td style="width:163px;">Shang Hai Jing Xin</td>
			<td>Tissuelyser-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Incubator</td>
			<td style="width:163px;">Ning Bo Jiang Nan</td>
			<td>HWS-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stirrer with a heat plate</td>
			<td style="width:163px;">Chang Zhou Bo Yuan</td>
			<td style="width:176px;">CJJ 78-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:176px;">CCS200/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence stereo microscope&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:176px;">&#160;M205FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:176px;">S6E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:332px;">Outside container</td>
			<td>Jiang Su Hai Men</td>
			<td style="width:176px;">glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:332px;">Inside container&#160;</td>
			<td>Beijing Yi Ran machinery factory</td>
			<td style="width:176px;">plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:163px;">Hai Men Ning Mong</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;96 well plate</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Costar 3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">LEDs</td>
			<td style="width:163px;">Xin Xing Yuan Guangdian</td>
			<td style="width:176px;">607 nm, 3W&#160;</td>
			<td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila

La consommation d’aliments est sous le contrôle étroit du cerveau, qui intègre l’état physiologique, la saveur et le contenu nutritionnel des aliments et des commandes de questions pour démarrer ou arrêter l’alimentation. Décrypter les mécanismes sous-jacents à la prise de décision en temps opportun et modérée l’alimentation comporte des implications majeures dans notre compréhension des troubles physiologiques et psychologiques liés au contrôle de l’alimentation. Méthodes quantitatives, simples et robustes sont nécessaires pour mesurer l’ingestion d’aliments des animaux après la manipulation expérimentale, tels que force augmentant les activités de certains neurones de la cible. Ici, nous avons introduit des tests alimentaires étiquetage-teintée pour faciliter l’étude neurogénétique de contrôle d’alimentation chez la drosophile adulte. Nous examinons les tests alimentaires et ensuite décrire nos méthodes étape par étape de l’installation d’analyse qui combine thermogenetic et optogenetic manipulation des neurones contrôlant l’alimentation motivation avec test d’admission marqués au colorant alimentaire. Nous discuterons les avantages et les limites de nos méthodes, par rapport aux autres tests alimentaires, pour aider les lecteurs à choisir un test approprié.

Écran thermogenetic.
Appétit anormalement élevé provoque la prise alimentaire élevée, indépendamment des besoins physiologiques. Nous avons utilisé ce régime à un haut débit de conception comportementale écran pour obtenir des handles génétiques des neurones liés à la faim et rassasiés des États (Figure 1). L’écran a donné Taotie-Gal424. Lorsque...

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Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Dosages quantitatifs-la prise alimentaire avec de la nourriture teint fournissent un robuste et haut débit moyens d’évaluer la motivation alimentation. Combinant le dosage de la consommation de nourriture avec thermogenetic et optogenetic écrans est une approche puissante pour enquêter sur les circuits neurones sous-tendant l’appétit chez les adultes Drosophila melanogaster.

Combinant les dosages quantitatifs-la prise alimentaire et activation par la force des neurones pour étudier l’appétit chez la drosophile

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Recherche

Sciences du comportement

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Une procédure d&#39;étudier l&#39;effet de la restriction alimentaire prolongée sur l&#39;héroïne cherche à rats abstinents

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

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Découvrir beat Surdité: détection des troubles du rythme avec le doigt taraudage synchronisé et tâches de temporisation perceptuelles

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

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Conception et mise en œuvre d&#39;une étude IRMf examen Pensée répression chez les jeunes femmes avec, et à risque, pour la dépression

Ruminative brooding is associated with increased vulnerability to major depression. Individuals who regularly ruminate will often try to reduce the ...

Combining Multiple Data Acquisition Systems to Study Corticospinal Output and Multi-segment Biomechanics

Association de plusieurs systèmes d&#39;acquisition de données pour étudier sortie cortico et Multi-segment Biomécanique

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En Vivo protocole des Impacts de la tête Subconcussive contrôlé pour la Validation des données de l’étude

Subconcussive hits pose a threat to neuronal health as they have shown to induce neuronal structural damage and functional impairment without causing ...