Name: combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional pesquisa básica programa da China (2012CB825504), Nacional Natural Science Foundation da China (91232720 e 9163210042), da Academia Chinesa de Ciências (CAS) (GJHZ201302 e SMC015-QYZDY-SSW), Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1119434) e 100-talentos programa de CAS para Y. Zhu.

1. preparar a câmara de alimentação
Nota: A câmara de alimentação para criação de etiquetas de corante alimentar ensaio consiste de duas partes: o recipiente externo (como uma capa) e o interior contêiner (como fonte de alimento).
<ol><li>Modificar o recipiente externo de um frasco de vidro para o cultivo da drosófila com (diâmetro interno de 31,8 mm) e uma altura de 80 mm (figura 1A, 1C). Cobrir o fundo do r...

<ol>
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Este relatório concentra-se no processo técnico de ensaios de alimentação corante-rotulagem de consumo de alimentos no contexto de thermogenetic e ativação de optogenetic para manipular os neurônios controlando a alimentação. Este protocolo simples e de confiança vai ajudar a elucidar a função dos neurônios do candidato na alimentação de controle, para medir a preferência alimentar de moscas e para identificar novos jogadores nos circuitos de controle de alimentação através de telas de genética basead...

Quantificar a quantidade de comida ingerida é importante para avaliar vários aspectos da alimentação controles pelo cérebro em responder às necessidades internas (tais como Estados de fome) e fatores externos (como a qualidade dos alimentos e palatabilidade)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. nos últimos anos, os esforços de decifrar os substratos neurais de controle de alimentação em Drosophila levam ao desenvolvimento de vários ensaios para diretamente a quantificar a quantidade de comida ingerida ou servir como um indicador de alimentação motivação 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
O ensaio de alimentador capilar (CAFE)12,13 foi desenvolvido para medir a quantidade de consumo de alimentos líquidos em uma conta de vidro. O ensaio CAFE é altamente sensível e reprodutível17 e simplifica a medição do consumo de alimentos, especialmente para quantificação de alimentação a longo prazo18. No entanto, este ensaio requer as moscas para subir até a ponta da conta e alimentar de ponta-cabeça, que não é adequado para todas as estirpes. Além disso, porque as moscas a ser testado usando o ensaio de café têm de ser criados no alimento líquido, o efeito destas condições no status de metabolismo ou desnutrição a potencial de criação permanece ser determinado.
O ensaio de Proboscis extensão resposta (PER)11,14 conta a frequência de respostas de extensão narigudo em direção a toques suaves de gotas de comida. POR ensaio provado-se como uma excelente maneira de avaliar alimentação motivação de mosca individual e bundas a influência de palatabilidade e conteúdo de alimentos18,19. No entanto, não é uma quantificação directa da quantidade de ingestão.
Recentemente, foi desenvolvido um método semiautomático, manual do ensaio (MAFE)15, de alimentação. Em MAFE, uma única mosca imobilizada é alimentada manualmente com uma conta que contém o alimento. Dado que as respostas de extensão de narigudo e consumo de alimentos podem ser monitorados simultaneamente, MAFE é adequado para avaliar valores de nutrientes e os efeitos da manipulação farmacológica. No entanto, imobilizando uma mosca pode afetar negativamente seu desempenho comportamental, incluindo a alimentação.
Além disso, voar Proboscis e atividade Detector (FlyPAD)10 foi desenvolvido para quantificar automaticamente o comportamento alimentar. Usando métodos de visão de máquina, FlyPAD registros de interações físicas entre uma mosca e comida para quantificar a frequência e duração das extensões de tromba como um indicador de alimentação motivação. FlyPAD fornece uma abordagem de alto rendimento para monitorar os comportamentos de alimentação de uma mosca em movimento livre, embora a sensibilidade e a robustez deste sistema continua a ser confirmada por mais de12estudos.
Estratégias de rotulagem são frequentemente usadas para estimar a ingestão de alimentos em moscas. É comum de rotular os alimentos com traçadores químicos e, após a alimentação, medir a quantidade de traçador ingerido para calcular a quantidade de ingestão de alimentos. Traçadores radioativos,16,17,20,21,22,23,24,25 permitir a detecção através da cutícula sem homogeneização das moscas. Este método fornece notavelmente baixa variabilidade e alta sensibilidade18e é viável para o estudo de longo prazo da ingestão de alimentos. No entanto, a disponibilidade de radioisótopos utilizáveis e diferentes taxas de absorção e excreção devem ser tida em conta quando se trabalha com este ensaio.
Rotulagem e rastreamento de ingestão de alimentos com cores de alimentos tóxicos é um mais simples e mais segura alternativa2,3,26,,27,28. Moscas são homogeneizadas após a alimentação com alimentos que contenham corantes solúveis e não absorvível, e a quantidade do corante ingerido mais tarde é quantificada utilizando um espectrofotômetro3,24,28,29 . A estratégia de rotulagem é fácil de executar e fornece alta eficiência, mas com uma ressalva. O volume de ingestão de alimentos, estimado a partir da tintura ingerida é menor que o volume real porque excreção começa tão cedo quanto 15 min depois moscas Iniciar alimentação17. Além disso, o ensaio avalia a ingestão de comida tipicamente dentro de um período de 60 min, que só é adequado para investigação do comportamento alimentar a curto prazo24,28. Além disso, vários fatores internos e externos, tais como o genótipo17, gênero17, acasalou estado17, criação de densidade30, ritmo circadiano31,32e comida de qualidade3 , 8 , 16, ingestão de alimentos de influência. Portanto, a alimentação duração talvez precise ser ajustado de acordo com as condições experimentais específicas. Além de facilitar a quantificação da ingestão de alimentos, cores de alimentos também são usadas para avaliar opções de comida a2,19,27e visualizar o menisco em uma conta no CAFE ensaio12.
Aqui, apresentamos uma protocolo combinado manipulação da atividade neuronal com abordagem de criação de etiquetas de tintura. Esta estratégia tem sido provada útil em nosso estudo neurogenetic alimentando o controle em adultos de moscas de fruta24. O método de Pontuação visual permite uma rápida estimativa do consumo de alimentos; assim, é útil para o rastreio através de um grande número de estirpes em tempo hábil. Os candidatos a partir da tela são então analisados em detalhe, usando um método colorimétrico para fornecer objectivas e quantificação exacta em estudo adicional.
Além de ensaios de alimentação, também descrevemos o thermogenetic27,33,34,35 e optogenetic36 métodos forçosamente ativando neurônios alvo em Drosophila. Para ativar os neurônios por thermogenetic a operação é simples e conveniente com Drosophila transitória do Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que é um canal de cação de temperatura e voltagem-dependente que aumenta a excitabilidade neuronal quando a temperatura ambiente temperatura se eleva acima de 23 ° C33,,37; no entanto, testes com animais em altas temperaturas podem produzir efeitos adversos sobre o comportamento. Outra abordagem eficaz para ativar os neurônios em Drosophila é usando o optogenetics com CsChrimson36, que é uma variante avermelhado do channelrhodopsin que aumenta a excitabilidade dos neurônios quando expostos à luz. Optogenetics oferece a maior resolução temporal e a menor perturbação de comportamentos do que thermogenetics. Combinando a medição quantitativa de ingestão de alimentos com a manipulação da atividade neuronal representa uma abordagem eficaz para estudar os mecanismos neurais de alimentação.
Descrevemos em detalhe a preparação da câmara de alimentação e as moscas a ser testado. Usando moscas Taotie-Gal4 como um modelo24, descrevemos ativando neurônios por thermogenetics e optogenetics. Dois ensaios de quantificação do consumo de alimento com comida tingir-etiquetados são também descritos no protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">UAS-CsChrimson</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td style="width:176px;">55135</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">UAS-dTrpA1</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td>26263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDC1-GAL4&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td style="width:176px;">9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">TDC2-GAL4</td>
			<td style="width:163px;">Bloomintoon</td>
			<td style="width:176px;">9313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">sNPF-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Z. Zhao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NPF-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TH-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-HT-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AKH-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:272px;">Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dip2-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Y. Rao</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Taotie-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by J. Carlson</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Agarose</td>
			<td>Biowest</td>
			<td style="width:176px;">G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:176px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erioglaucine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">all-trans-retinal&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:176px;">R2500</td>
			<td>stored in darkness</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:163px;">Amresco</td>
			<td>9002-93-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="146">
			<td height="146" style="height:146px;width:332px;">Fly food</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:176px;">1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;">&#160;1x PBS buffer&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:176px;">1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">PBST buffer</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td colspan="2">1X PBS with 1% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Grinding mill</td>
			<td style="width:163px;">Shang Hai Jing Xin</td>
			<td>Tissuelyser-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Incubator</td>
			<td style="width:163px;">Ning Bo Jiang Nan</td>
			<td>HWS-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stirrer with a heat plate</td>
			<td style="width:163px;">Chang Zhou Bo Yuan</td>
			<td style="width:176px;">CJJ 78-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:176px;">CCS200/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence stereo microscope&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:176px;">&#160;M205FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:176px;">S6E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:332px;">Outside container</td>
			<td>Jiang Su Hai Men</td>
			<td style="width:176px;">glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:332px;">Inside container&#160;</td>
			<td>Beijing Yi Ran machinery factory</td>
			<td style="width:176px;">plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:163px;">Hai Men Ning Mong</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;96 well plate</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Costar 3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">LEDs</td>
			<td style="width:163px;">Xin Xing Yuan Guangdian</td>
			<td style="width:176px;">607 nm, 3W&#160;</td>
			<td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila

Consumo de alimentos está sob o controle apertado do cérebro, que integra o estado fisiológico, palatabilidade e conteúdo nutricional dos alimentos e questões de comandos para iniciar ou parar a alimentação. Decifrando os processos subjacentes a tomada de decisão oportuna e moderada alimentação traz implicações importantes em nossa compreensão de distúrbios fisiológicos e psicológicos relacionados ao controle de alimentação. Métodos quantitativos, simples e robustos são necessários para mensurar a ingestão de alimentos de animais após manipulação experimental, como à força, aumentando as atividades de certos neurônios do alvo. Aqui, nós introduzimos a ensaios de alimentação corante-rotulagem-based para facilitar o estudo neurogenetic de controle de alimentação em adultos de moscas de fruta. Podemos rever ensaios de alimentação disponíveis e em seguida descrever nossos métodos passo a passo da configuração para análise, que combinam thermogenetic e manipulação de optogenetic de neurônios controlando alimentação motivação com ensaio de ingestão de alimentos tingir-etiquetados. Também discutimos as vantagens e limitações dos nossos métodos, em comparação com outros ensaios de alimentação, para ajudar os leitores a escolher um ensaio apropriado.

Thermogenetic tela.
Anormalmente, aumento do apetite faz com que a ingestão de alimentos elevados, independentemente de necessidades fisiológicas. Utilizamos este regime para projetar um elevado-throughput comportamental tela para obter alças genéticas de neurônios relacionados à fome e saciado Estados (Figura 1). A tela rendeu Taotie-Gal424. Quando os neurôni...

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Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Comportamento

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

Um procedimento para estudar o efeito da restrição alimentar prolongada em heroína Buscando em ratos abstinentes

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Descobrindo batida Surdez: Distúrbios Detecção de ritmo com o dedo Sincronizado Tapping e Tarefas de temporização da Percepção

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

Design and Implementation of an fMRI Study Examining Thought Suppression in Young Women with, and At-risk, for Depression

Design e Implementação de um Estudo de fMRI Examinar Pensei Suppression em mulheres jovens com, e em situação de risco, para a depressão

Ruminative brooding is associated with increased vulnerability to major depression. Individuals who regularly ruminate will often try to reduce the ...

Combining Multiple Data Acquisition Systems to Study Corticospinal Output and Multi-segment Biomechanics

Combinando Múltiplos Sistemas de Aquisição de Dados para o Estudo de saída Corticospinal e Multi-segmento Biomecânica

Transcranial magnetic stimulation techniques allow for an in-depth investigation into the neural mechanisms that underpin human behavior. To date, the use ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Feeding Experimentation Device FED: Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Alimentando Dispositivo Experimentação (FED): construção e validação de um dispositivo de código aberto para medição Food Intake em roedores

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversíveis induzida pelo resfriamento desativações para estudar Cortical contribuições para a memória do obstáculo o gato ambulante

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

In Vivo Protocol of Controlled Subconcussive Head Impacts for the Validation of Field Study Data

No protocolo Vivo dos impactos de cabeça Subconcussive controlado para a validação dos dados do estudo de campo

Subconcussive hits pose a threat to neuronal health as they have shown to induce neuronal structural damage and functional impairment without causing ...