Name: detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige at Robert Gennis fra University of Illinois og Christoph von Ballmoos fra Berns universitet for at give et plasmid og en stamme at udtrykke bo3-oxidase. Projektet blev støttet af BBSRC give R.I. og R.B. BB/L01985X/1

<ol>
	<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).</li><li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins+by+reconstitution+through+dialysis.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.</a> Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).</li><li>Dezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Girard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Angelova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Giant+Vesicles+by+External+Ac+Electric-Fields+-+Kinetics+and+Applications.">Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).</li><li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil.">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li><li>Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Like+Printed+Material.">A Tissue-Like Printed Material.</a> Science. 340 (6128), 48-52 (2013).</li><li>Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+applications+come+of+age.">Synthetic biology: applications come of age.</a> Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Church, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+synthetic+biology.">Realizing the potential of synthetic biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+reconstituted+neuronal+SNARE+complexes+zipper+in+three+distinct+stages.">Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages.</a> Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).</li><li>Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE-fusion+mediated+insertion+of+membrane+proteins+into+native+and+artificial+membranes.">SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes.</a> Nat Commun. 5, 4303 (2014).</li><li>Decout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+a+targeted+fusogenic+peptide.">Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).</li><li>Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+linker+sequences+on+vesicle+fusion+mediated+by+lipid-anchored+DNA+oligonucleotides.">Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).</li><li>Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+one-step+assembly+of+multi-component+membrane+systems+by+fusion+of+charged+proteoliposomes.">A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes.</a> Nat Commun. 7, 13025 (2016).</li><li>Biner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+membrane+proteins+into+small+and+giant+unilamellar+vesicles+by+charge-mediated+fusion.">Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion.</a> FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).</li><li>Bian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+SERCA+calcium+transport+and+small-molecule+inhibition+in+giant+unilamellar+vesicles.">Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).</li><li>Schuette, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+liposome+fusion+mediated+by+synaptic+SNARE+proteins.">Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).</li><li>Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encapsulation+of+cell-free+transcription+and+translation+machinery+in+vesicles+for+the+construction+of+cellular+mimics.">The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics.</a> J Vis Exp. (80), e51304 (2013).</li><li>Verchere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+the+MexAB+efflux+pump+from+Pseudomonas+aeruginosa.">In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Vis Exp. (84), e50894 (2014).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Microgram+Quantities+of+Protein+in+the+Presence+of+Milligram+Levels+of+Lipid+with+Amido+Black+B-10.">Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).</li><li>Rumbley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Taussky, H. H., Shorr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microcolorimetric+Method+for+the+Determination+of+Inorganic+Phosphorus.">A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).</li><li>Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+inactive,+cold-stabilized+form+of+the+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase.">A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).</li><li>Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+purification+and+reconstitution+of+His-tagged+cysteine-less+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase.">Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).</li><li>Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deltapsi+and+DeltapH+are+equivalent+driving+forces+for+proton+transport+through+isolated+F(0)+complexes+of+ATP+synthases.">Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).</li><li>Morein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+Escherichia+coli+cells+regulate+the+membrane+lipid+composition+in+a+&amp;#34;window&amp;#34;+between+gel+and+non-lamellar+structures.">Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a &amp;#34;window&amp;#34; between gel and non-lamellar structures.</a> J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).</li><li>Zinser, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+and+lipid+composition+of+subcellular+membranes+in+the+unicellular+eukaryote+Saccharomyces+cerevisiae.">Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).</li><li>Daum, G., Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+lipids+into+mitochondria.">Import of lipids into mitochondria.</a> Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).</li><li>Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+observed+membrane+fusion+between+oppositely+charged+phospholipid+bilayers.">Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers.</a> J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).</li><li>Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+mixing,+fusion,+and+lysis+following+the+interaction+of+populations+of+cationic+and+anionic+phospholipid+bilayer+vesicles.">Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles.</a> J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+association+and+fusion+of+giant+vesicles+using+a+fluorescence-activated+cell+sorter.">Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter.</a> Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).</li><li>Memoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surfactants+on+the+spectral+behaviour+of+calcein+(II):+a+method+of+evaluation.">Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Følgende emner skal overvejes for succes af denne eksperimentelle tilgang:
Valg af lipid gebyr for proteoliposomes og target dobbeltlag: Kationiske lipider findes ikke i naturen, mens anioniske lipider er rigelige i biologiske membraner at nå f.eks ~ 25, 35 og 20% i indre membran af E. coli, plasma membran af gær S. cerevisiae, og indre mitokondrie membraner i mange arter, henholdsvis27,28,29. Det ville være rimeligt at forvente, at funktionaliteten af membranproteiner i PL+ kan blive påvirket af styrken af en positiv ladning af tolagede, som igen vil afhænge en relative indhold af kationiske lipid i tolagede og eksterne ionisk styrke. Det er derfor vigtigt at behandle eksperimentelt, i hvilket omfang funktionalitet af membranproteiner af interesse vil afhænge af afgiften af kationiske lipid miljø. Her viser vi, at begge F1Fo ATP syntase og bo3-oxidase er følsomme over for kationiske lipid miljø, men det lykkedes os at modulere og vende denne effekt ved første markedsføring proteinerne i PL+ og levere dem i anioniske accepterer dobbeltlag, og derefter øge den ioniske styrken af reaktion medium efter fusion er færdig.
Valg af en bestemt kationiske lipid: De fleste kommercielt tilgængelige kationiske lipider er af ikke-triacylglyceride karakter; Derfor skal en potentiel kandidat lipid være testet for kompatibilitet med Membranproteiner af interesse. Vi fandt tidligere15 ATPsyntase anvendes i denne undersøgelse viste sin bedste ydelse i PL+ dannet af ethyl-PC, der har den højeste strukturelle lighed med naturlige triacylglyceride lipider, mens i DOTAP (ikke-triacylglyceride lipid) PL+ dette protein var mindre aktive.
Vesikel fusion assays: Ægte vesikel fusion (når intravesicular flydende indholdet blandes) skal differentieres fra mellemliggende hemi-fusion stater, når vesikler overholde hinanden uden at blande deres vandige indhold, men let blande indholdet af deres eksterne eller begge lipid Småbladene er30. Suboptimal lipid blandinger eller visse betingelser påvise blærer også udtalt flydende indhold lækage under fusion31. Minimal koncentrationer af ladede lipider i fusogenic blandinger muliggør ægte fusion skal findes eksperimentelt for hver lipid arter, men generelt er det fundet at membraner med mindre end 10% opkrævet lipider gengives ikke-fusogenic 32.
Samtidig danner fusogenic SUV i tilstedeværelse af multi-valent ioner, er det vigtigt ikke at blande oppositely opladet komponenter, da dette kan medføre øjeblikkelig sammenklumpning og sammenlægning af lipider af disse ioner. For eksempel, mens forberede metoden kobolt-calcein-EDTA SUV, er det vigtigt at undgå at blande en kationiske lipid blanding med EDTA at forhindre tilstopning af filteret polycarbonat af klumpet komponenter.
Det er også vigtigt at nævne, at metoden kobolt-calcein-EDTA samtidig være meget følsomme og bekvemt for real-time fusion overvågning, stadig kan undervurdere omfanget af fusion på grund af 1) selvstændige quenching af fluorescens af gratis calcein inde postfusion vesikler, som forventes at nå 1 mM, mens de selvstændige quenching tærskel er rapporteret til at være omkring 20 µM33, og 2) overflade-bundet kobolt-calcein, som er forbundet med SUV+ selv efter at have passeret gennem gel-filtrering harpiks og farver vesikler til en lys orange farve, mens SUV0 har en bleg orange farve. Bemærk også, at frigivelsen af den bundne kobolt-calcein ved tilsætning af rengøringsmiddel Triton X-100 i nærværelse af EDTA genererer meget stærkere signaler for SUV+ (figur 3 c, røde spor) end SUV0 (grå trace).
Perspektiver: vi forventer, at de hurtige tilgange beskrevet her høj grad kan lette og fremskynde forsamling af komplekse membraner til brug af nye syntetiske biologi applikationer. Vores membran protein rekonstituering protokol tager kun en halv time til rekonstitution af skrøbelige store Membranproteiner kendt for at være følsomme over for langvarige dialyse-baserede rekonstitution teknikker, mens denne fusogenic tilgang tager kun 5-10 min til at levere sådanne proteiner i store lipid dobbeltlag. Her, demonstrere vi fordelene ved disse tilgange ved at manipulere med E. coli F1Fo ATPsyntase, som er et eksempel på en skrøbelig protein. Det er lavet af 23 underenheder og kendes let mister sin integritet, hvis de udsættes for suboptimal betingelser (for eksempel, varme) under/efter oploesning, men bliver brugt i disse procedurer, proteinet viser reproducerbar høj aktivitet i proton pumpe.

Functionalization af kunstige lipid dobbeltlag med Membranproteiner er et vigtigt skridt i forsamlingen af membran modelsystemer. Den enkleste model, proteoliposomes (PL), består af lille (30-200 nm diameter) unilamellar vesikler (SUV, også kaldet Liposomer), med proteiner integreret i deres membraner. PL dannes traditionelt i to trin1. Første, præfabrikerede SUV er blandet med en membran protein af interesse og et rengøringsmiddel på en koncentration over sin kritiske micelle koncentration (CMC). For det andet er vaskemidlet fjernet med forskellige dialyse, "bio-perler" eller gel filtrering teknikker, forlader proteinet i membranen. Den sidstnævnte metode er meget hurtigere (~ 30 min1) og er derfor at foretrække til rekonstitution af skrøbelige og følsomme Membranproteiner, mens de første to tilgange er begrænset af vaskemiddel fjernelse hastighed, der tager mange timer og kan medføre en betydeligt tab af aktivitet og tab af strukturelle integritet af proteiner. Functionalization af større vesikler (store unilamellar vesikler, LUV, op til 1 µm diameter) af denne tilgang er mere udfordrende, som vesikel størrelse bliver reduceret efter vaskemiddel fjernelse, og det er ikke muligt for giant unilamellar vesikler (GUV, > 1 µm), som de er destabiliseret af vaske-og rengøringsmidler (men se Johnson et al. 2 for langsom 2D-krystallisering af membranproteiner i store dobbeltlag). Alternative tilgange til GUV membran functionalization3,4,5 findes men er besværligt, tidskrævende og kræver stadig nogle vaskemiddel ved koncentrationer under CMC. Mere komplicerede eller skrøbelige lipid modeller (for eksempel Droplet Hydrogel dobbeltlag6 og 3D printable Droplet Interface tolagede-baserede kunstige væv7) kan ikke tåle rengøringsmidler. Hurtigt opstå syntetisk biologi applikationer8,afhænger9,10 kritisk functionalization af sådanne komplekse membran strukturer. Derfor, en let og robust metode muliggør hurtig og skånsom levering af membranproteiner i target skrøbelige dobbeltlag er meget efterspurgt i feltet.
Et alternativ, vaskemiddel-fri protein leveringsmetode er vesikel fusion, hvor interagerende vesikler membraner forenes i den intakte postfusion tolagede, mens deres intravesicular vandige indhold får blandet, uden at blive frigivet i eksterne miljø. Vesikel fusion er aktiveret og drevet enten af konformationelle rearrangementer inden for supplerende fusogenic agenter (nogle proteiner11,12 og peptider13 eller specielt modificerede DNA14) placeret i den henvendelse dobbeltlag eller Coulombic interaktioner mellem lipid dobbeltlag dannet af supplerer opladet kation- og anionbyttere lipider15,16, eller kationiske dobbeltlag og negativt ladede proteiner17.
Den tidligere tilgang kræver tilstedeværelsen af fusogenic agenter i de vekselvirkende membraner før fusion, er relativt langsom (~ 30 min til nå halv-maksimalt fusion12,18), men kan anvendes til både naturlige og kunstige membraner.
En fordel ved metoden ved hjælp af fusogenic lipider (figur 1) er at det giver mulighed for meget hurtigere membran fusion (~ 1 min. at nå halv-maksimum, og 5-10 min til slut reaktionen). Derudover kan omfanget af fusion styres ved jeg) en nemt at formulere relative indhold af ladede lipider i fusogenic dobbeltlag, og ii) Ioniske og generelle, osmotisk styrken af reaktion medium (salte på over 50 mM, og for eksempel saccharose15 er vist at stoppe fusion), eller en kombination af begge. For at starte fusion, er oppositely ladede fusogenic vesikler blandet i en lav (typisk 10-20 mM salt) ionic styrke medium for 5-10 min. En relativ Ulempen ved metoden er at kationiske lipider kan øve en negativ indflydelse på funktionaliteten af membranproteiner i kationiske proteoliposomes før fusion, især i lav ionisk styrke, men denne virkning er reversible og blandet med en naturlig lipid sammensætning efter fusion membranen og vender tilbage til normal ionisk styrke medium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DOPC neutral lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPA anionic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-PC cationic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C3927MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50, Super Fine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400, Type 400-DL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10411523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Insight Biotechnology</td>
			<td>sc-202090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrusion system</td>
			<td>Avanti Extruder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single tube luminometer, model Sirius L</td>
			<td>Titertek Berthold</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter, D19 mm</td>
			<td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes</td>
			<td>WHA800309, WHA800284</td>
			<td>100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers used in the paper</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM MOPS pH 7.4 
			Various concentrations of KCl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.

Vaske-og rengøringsmidler er nødvendige for levering af membranproteiner i 30-100 nm små unilamellar vesikler, mens mere kompleks, større model lipid dobbeltlag er mindre kompatible med vaske-og rengøringsmidler.
Her beskriver vi en strategi for omgåelse denne grundlæggende begrænsning ved hjælp af fusogenic oppositely opkrævet Liposomer forsynet med en membran protein af interesse. Fusion mellem sådanne blærer opstår indenfor 5 min i en lav ionisk styrke buffer. Positivt ladede fusogenic Liposomer kan bruges som simple shuttle vektorer for vaskemiddel-gratis levering af membranproteiner i biomimetiske target lipid dobbeltlag, som er negativt ladede. Vi viser også hvordan du rekonstruere Membranproteiner i fusogenic proteoliposomes med en fast 30-min protokol.
Ved at kombinere disse to tilgange, vi viser en hurtig montage af en elektron transportkæde bestående af to Membranproteiner fra E. coli, en primær proton pumpe bo3-oxidase og F1Fo ATP syntase, i membraner i vesikler i forskellige størrelser, lige fra 0,1 til > 10 mikron, samt ATP produktion af denne kæde.

Brugen af fusogenic komplementære-opkrævet proteoliposomes for hurtig vaskemiddel-fri levering af membranproteiner i target tolagede membraner omfatter tre trin (figur 1): A, dannelsen af fusogenic SUV fra lipid blandinger med høj indhold af ladede lipider; disse SUV kan eventuelt foretage en intravesicular belastning; B, konvertering af fusogenic SUV i PL ved hjælp af vores hurtige membran protein rekonstitution; C, fusion af fusogenic PL med target dobbeltlag i et lavt saltindhold medium, efterfulgt af tilsætning af høje salt til at stoppe fusion reaktionen. I tilfælde af store vesikler (D), en bedre strategi er at levere membran protein i anioniske target tolagede, som giver en bedre lipid miljø for aktivitet på Membranproteiner (behandles yderligere i teksten).
GUV dannelse protokol med omvendt emulsion metode er fremhævet i detaljer i figur 2. Vi foretrækker at bruge hexadecane i lipid-olie blandingen på grund af sin relativt høj (18 ° C) indefrysning temperatur, som giver mulighed for nem fjernelse af størknet olie efter GUV pelleringsmidler.
Figur 3 viser vesikel fusion med kobolt-calcein-EDTA metode. Fusion ses kun når supplerende opladet vesikler bruges i lav salt buffere, mens højere salt koncentration (> 50 mM14) eller brug af ikke-fusogenic blærer viser ingen fusion.
Denne hurtige protokol af rekonstituering af membranproteiner i fusogenic SUV er illustreret i figur 4A. Ved hjælp af denne protokol, vi vise hurtig rekonstituering af primære proton pumpe bo3-oxidase og F1Fo ATP syntase i PL, og vurdering af deres specifikke aktivitet i disse membraner. Det er vigtigt at nævne, at udbyttet af protein rekonstitution afhænger ikke af afgiften af et lipid brugt15 og er ca. 50-75%25,12, og kan opbevares i mindst tre efter rekonstituering i PL, protein dage, selv ved stuetemperatur uden åbenlyse tab af protein aktivitet. Denne procedure giver også ensrettet orientering af ATPsyntase, hvor mere end 95% af det har sin hydrofile gruppe F1 orienterede udad15,26.
Figur 5 viser, at den proton pumpe aktivitet af F1Fo (Panel A) og bo3-oxidase (Panel B) i kationiske lipider er reduceret og følsom over for lave ionisk styrke, i forhold til anioniske og neutral lipid miljø, men denne effekt er mildnet i postfusion membraner efter fusing PL+ med anioniske LUV-.
Figur 6 viser levering af F1Fo ATPsyntase i membraner i store vesikler. I dette eksperiment, PL+ og 800 nm LUV- var smeltet i 20 mM KCl i 5 min, og reaktionsprodukt var pelleted for at fjerne billedet er ikke fikseret PL+, genopslemmes og analyseres for proton pumpe. Kontrol eksperimenter viste ingen proton pumpe når LUV0 i stedet for LUV- blev brugt i fusion reaktion (sort trace), eller tom LUV- alene var analyserede (blå trace).
Hurtig montage af en fungerende elektron transportkæde i membraner i store blærer ved fusogenic PL er vist i figur 7. Vi brugte F1Fo SUV+ og bo3 SUV+ til fusion med 800 nm LUV-, og vist ATP produktion af denne kæde i de postfusion blærer ved at tilføje fortløbende coenzym Q1 og DTT at energize membraner, og derefter tilføje fosfat for at udløse ATPsyntesen af F1Fo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> Figur 1: opfattelse af ultrahurtig vaskemiddel-gratis levering af membranproteiner i target lipid dobbeltlag via fusion af unilamellar vesikler dannet af supplerende opladet lipider. (A) dannelsen af kation- og anionbyttere fusogenic lille unilamellar vesikler (SUV+, SUV-) eventuelt læsset med intravesicular ladninger. (B) konvertering af fusogenic SUV i fusogenic proteoliposomes (PL) ved rekonstituering af membranproteiner. (C) vaskemiddel-gratis levering af membranproteiner i postfusion membraner med fusogenic PL. (D) at foretrække strategi for levering af membranproteiner i membraner i store vesikler, illustreret af fusion mellem 100 nm PL+ og 800 nm LUV-. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> Figur 2: GUV dannelse protokol med en inverteret emulsion metode. (A) dannelsen af en lipid éncellelag på grænsen mellem den olie-lipid blanding og vand. (B) dannelsen af en inverteret (vand-i-olie) emulsion. (C) GUV dannelsen af passerer gennem grænsen olie-vand emulsion ved centrifugering. (D) køling af røret nedenfor < 18 ° C til at størkne og fjerne olien. (E) A fluorescerende mikroskopi billede af en GUV, der indeholder fluorescerende lipid (1% vægt brøkdel cholesteryl-Bodipy-FL12) i sin membran (grøn) og en polar fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) i vesikels lumen (rød). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> Figur 3: Lipid vesikler fusion studerede med metoden kobolt-calcein-EDTA. (A) skematisk af metoden, hvor gratis calcein er frigivet fra en ikke-fluorescerende kobolt-calcein kompleks af EDTA. (B) Fusion af SUV i forskellige koncentrationer, KCl. (C) frigivelse af den intravesicular calcein ved tilsætning af EDTA og Triton X-100 vaskemiddel til postfusion vesikler vist i B som beskrevet i teksten. Fusion omfang (%) for røde spor beregnes ved at dividere maksimal baggrundskorrigeret fusion signalet (1 - 2) af de baggrundskorrigerede maksimal signal efter udgivelsen af indkapslede calcein (3-2) og gange med 100. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> Figur 4: Ultrahurtig rekonstituering af bo3-oxidase og F1Fo fusogenic proteoliposomes, og protein aktivitet målinger i sådanne proteoliposomes. (A) skematisk af rekonstituering protokol. (B) coenzym Q1 oxidation drevet proton pumpe af bo3-oxidase i PL målt med ACMA dæmper (forklaret i teksten). (C) ATP hydrolyse-drevet proton pumpe af F1Fo i PL målt med ACMA dæmper (forklaret i teksten). (D) ATP hydrolyse af F1Fo i PL målt med ATP-regenererende system (forklaret i tekst), og dens stimulering af uncoupler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> Figur 5: påvirkning af lipid miljø og ioniske styrke aktivitet af membranproteiner. Proton pumpe af F1Fo (A) og bo3-oxidase (B) i kationiske PL (røde spor), anioniske PL (blå trace), neutral PL (sort trace) og kationiske PL sammensmeltet med anioniske LUV (grønne spor) i 20 og 100 mM KCl. kontrol trace ( grå) viser ingen ændring i proton pumpe af F1Fo PL- ved blanding med SUV-. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> Figur 6: Levering af F1Fo ATP syntase i membraner af 800 nm LUV- via fusion med PL+. (A) skematisk af eksperimentet: PL+ og 800 nm LUV- var smeltet i 1 mM MOPPER (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl i 5 min, pelleted for at fjerne hvis PL, og genopslemmes i den samme buffer. (B) Proton pumpe af postfusion LUV (røde spor). Kontrol eksperimenter viste ingen ACMA quenching når PL0 blev blandet med LUV- (sort trace), eller tom LUV- alene var analyserede (blå trace). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> Figur 7: 5-min vaskemiddel-gratis samling af en elektron transportkæde i membraner af 800 nm LUV- via fusion med PL+. (A) skematisk af eksperimentet: 100 nm F1Fo PL+ og 100 nm bo3-oxidase PL+ blev sammensmeltet med LUV-, som beskrevet i figur 6. Fusion blev stoppet ved at tilføje KCl og MOPPER til 100 og 50 mM, henholdsvis. Membraner var blandet med ADP-luciferin-luciferase cocktail og energi ved tilsætning af DTT og Q1, som beskrevet i teksten. ATP produktion blev indledt ved tilsætning af 1 mM fosfat (Pjeg) og overvågede realtid med luciferase-luciferin system som beskrevet i teksten. (B) ATP syntesen af postfusion vesikler (røde spor). Kontrol eksperimenter viste ingen ATP produktion når PL+ blev blandet med LUV- i høje salt (grå), eller PL0 blev blandet med LUV- (sort). ATP proteinsyntese sats blev beregnet som beskrevet i teksten (skridt 8,8-8,9). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. at JoVE.com

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Her præsenterer vi to ultrahurtig protokoller til rekonstitution af membranproteiner i fusogenic proteoliposomes og fusion af sådanne proteoliposomes med target lipid dobbeltlag for vaskemiddel-gratis levering af disse Membranproteiner i den postfusion tolagede. Kombinationen af disse tilgange muliggør hurtig og let kontrolleret forsamling af komplekse multi-komponent membran systemer.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, et et-trins inkorporering af membran proteiner i Biotinylerede Peptiskiver for strømlinede protein bindende assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...