Name: detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. at JoVE.com

Auteurs zijn dankbaar aan Robert Gennis van Universiteit van Illinois en Christoph von Ballmoos van de Universiteit van Bern voor het verstrekken van een plasmide en een soort uitspreken bo3-oxidase. Het project werd gesteund door BBSRC BB/L01985X/1 verlenen aan R.I. en R.B.

<ol>
	<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).</li><li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins+by+reconstitution+through+dialysis.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.</a> Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).</li><li>Dezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Girard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Angelova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Giant+Vesicles+by+External+Ac+Electric-Fields+-+Kinetics+and+Applications.">Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).</li><li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil.">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li><li>Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Like+Printed+Material.">A Tissue-Like Printed Material.</a> Science. 340 (6128), 48-52 (2013).</li><li>Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+applications+come+of+age.">Synthetic biology: applications come of age.</a> Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Church, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+synthetic+biology.">Realizing the potential of synthetic biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+reconstituted+neuronal+SNARE+complexes+zipper+in+three+distinct+stages.">Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages.</a> Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).</li><li>Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE-fusion+mediated+insertion+of+membrane+proteins+into+native+and+artificial+membranes.">SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes.</a> Nat Commun. 5, 4303 (2014).</li><li>Decout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+a+targeted+fusogenic+peptide.">Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).</li><li>Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+linker+sequences+on+vesicle+fusion+mediated+by+lipid-anchored+DNA+oligonucleotides.">Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).</li><li>Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+one-step+assembly+of+multi-component+membrane+systems+by+fusion+of+charged+proteoliposomes.">A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes.</a> Nat Commun. 7, 13025 (2016).</li><li>Biner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+membrane+proteins+into+small+and+giant+unilamellar+vesicles+by+charge-mediated+fusion.">Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion.</a> FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).</li><li>Bian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+SERCA+calcium+transport+and+small-molecule+inhibition+in+giant+unilamellar+vesicles.">Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).</li><li>Schuette, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+liposome+fusion+mediated+by+synaptic+SNARE+proteins.">Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).</li><li>Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encapsulation+of+cell-free+transcription+and+translation+machinery+in+vesicles+for+the+construction+of+cellular+mimics.">The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics.</a> J Vis Exp. (80), e51304 (2013).</li><li>Verchere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+the+MexAB+efflux+pump+from+Pseudomonas+aeruginosa.">In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Vis Exp. (84), e50894 (2014).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Microgram+Quantities+of+Protein+in+the+Presence+of+Milligram+Levels+of+Lipid+with+Amido+Black+B-10.">Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).</li><li>Rumbley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Taussky, H. H., Shorr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microcolorimetric+Method+for+the+Determination+of+Inorganic+Phosphorus.">A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).</li><li>Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+inactive,+cold-stabilized+form+of+the+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase.">A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).</li><li>Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+purification+and+reconstitution+of+His-tagged+cysteine-less+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase.">Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).</li><li>Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deltapsi+and+DeltapH+are+equivalent+driving+forces+for+proton+transport+through+isolated+F(0)+complexes+of+ATP+synthases.">Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).</li><li>Morein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+Escherichia+coli+cells+regulate+the+membrane+lipid+composition+in+a+&amp;#34;window&amp;#34;+between+gel+and+non-lamellar+structures.">Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a &amp;#34;window&amp;#34; between gel and non-lamellar structures.</a> J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).</li><li>Zinser, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+and+lipid+composition+of+subcellular+membranes+in+the+unicellular+eukaryote+Saccharomyces+cerevisiae.">Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).</li><li>Daum, G., Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+lipids+into+mitochondria.">Import of lipids into mitochondria.</a> Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).</li><li>Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+observed+membrane+fusion+between+oppositely+charged+phospholipid+bilayers.">Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers.</a> J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).</li><li>Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+mixing,+fusion,+and+lysis+following+the+interaction+of+populations+of+cationic+and+anionic+phospholipid+bilayer+vesicles.">Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles.</a> J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+association+and+fusion+of+giant+vesicles+using+a+fluorescence-activated+cell+sorter.">Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter.</a> Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).</li><li>Memoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surfactants+on+the+spectral+behaviour+of+calcein+(II):+a+method+of+evaluation.">Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De volgende paar kwesties moeten worden overwogen voor het succes van deze experimentele aanpak:
Keuze voor proteoliposomes- en het doeldomein bilayers kosteloos lipide: Kationogene lipiden zijn niet gevonden in de natuur, terwijl anionogene lipiden overvloedig in biologische membranen bereiken zijn, bijvoorbeeld, ~ 25, 35 en 20% in de binnenste membraan van E. coli, plasmamembraan van gist S. cerevisiaeen innerlijke mitochondriale membranen van vele soorten, respectievelijk27,28,29. Het zou redelijk te verwachten dat de functionaliteit van membraaneiwitten in PL+ kan worden beïnvloed door de kracht van een positieve lading van het dubbelgelaagde, die op zijn beurt van een relatieve inhoud van kationische lipide in de dubbelgelaagde en externe Ionische afhangen zou sterkte. Het is daarom belangrijk om te pakken experimenteel in hoeverre functionaliteit van membraaneiwitten van belang zou afhangen van de lading van het kationische lipide-milieu. Hier, laten we zien dat zowel F1Fo ATP synthase en bo3-oxidase zijn gevoelig voor kationogene lipide milieu, maar we erin geslaagd te moduleren en dit effect door eerste plaatsen van de eiwitten in PL+ en leveren ze in de omgekeerde volgorde anionogene aanvaarding van bilayers, en vervolgens toename van de Ionische sterkte van het medium van de reactie na fusie is voltooid.
Keuze van een bepaalde kationische lipide: De meeste commercieel beschikbare kationische lipiden zijn van niet-triglyceride aard; Daarom moet een potentiële kandidaat-lipide worden getest op compatibiliteit met membraaneiwitten van belang. Eerder vonden we15 die de ATP-synthase gebruikt in deze studie toonde dat de beste prestaties in PL+ gevormd van ethyl-PC, die heeft de hoogste structurele gelijkenis met de natuurlijke triglyceride lipiden, terwijl in de DOTAP (niet-triglyceride lipide) PL+ dit eiwit was minder actief.
Blaasje fusion testen: Ware vesikel fusion (wanneer intravesicular vloeibare inhoud mengen) moet worden onderscheiden van tussenliggende hemi-fusion Staten, als blaasjes zonder hun waterige inhoud mengen met elkaar houden, maar gemakkelijk inhoud van hun externe of beide lipide mengen folders30. In geval van suboptimaal lipide mengsels of bepaalde voorwaarden, blaasjes ook laten zien dat uitgesproken vloeibare inhoud lekkage tijdens fusion31. Minimale concentraties van geladen lipiden in fusogenic mengsels waar fusion inschakelen moeten experimenteel worden gevonden voor elke soort lipide, maar in het algemeen, het komt voor dat membranen met minder dan 10% betalen lipiden niet-fusogenic 32worden weergegeven.
Terwijl fusogenic SUV in aanwezigheid van multi-valent ionen vormen, is het belangrijk niet te mengen tegengesteld geladen componenten, zoals dit onmiddellijke samendoen en aggregatie van lipiden door deze ionen veroorzaken kan. Bijvoorbeeld, terwijl de voorbereiding SUV van het kobalt-calceïne-EDTA-methode, is het belangrijk om te voorkomen dat een mengsel van kationische lipide mengen met EDTA ter voorkoming van verstopping van het filter polycarbonaat door geklonterd componenten.
Het is ook belangrijk om te vermelden dat de kobalt-calceïne-EDTA-methode, terwijl het zeer gevoelige en geschikt voor real-time fusion monitoring, nog steeds dat de omvang van de fusie wegens 1 onderschatten kan) zelf blussen van fluorescentie gratis calceïne binnen postfusion blaasjes, die naar verwachting bereiken van 1 mM, terwijl de zelf blussen drempel is gemeld dat ongeveer 20 µM33, en 2) oppervlakte-gebonden kobalt-calceïne, die gebonden aan SUV+ blijft zelfs na het passeren van de gel-filtratie-hars en de kleuren van blaasjes tot een fel oranje kleur, terwijl SUV0 hebben een bleke oranje kleur. Merk ook op dat release van de afhankelijke kobalt-calceïne op toevoeging van wasmiddel Triton X-100 in aanwezigheid van EDTA veel sterkere signalen voor SUV+ (Figuur 3 c, rode trace) dan SUV0 (grijs trace genereert).
Vooruitzichten: We verwachten dat de snelle benaderingen die hier beschreven aanzienlijk kunnen vergemakkelijken en versnellen van de assemblage van complexe membranen voor de behoeften van de opkomende synthetische biologie toepassingen. Onze membraan eiwit reconstitutie protocol duurt slechts een half uur voor de reconstructie van breekbaar Groot membraaneiwitten bekend te zijn gevoelig voor langdurige dialyse gebaseerde reconstitutie technieken, terwijl deze aanpak fusogenic slechts 5-10 min duurt te leveren dergelijke eiwitten in grote lipide bilayers. Hier tonen we de voordelen van deze benaderingen door het manipuleren van E. coli F1Fo ATP synthase, die een voorbeeld van een fragiele eiwit is. Het bestaat uit 23 subeenheden en is gekend om zijn integriteit gemakkelijk verliezen indien blootgesteld aan suboptimaal voorwaarden (bijvoorbeeld warmte) tijdens/na de solubilisatie, maar wordt gebruikt in deze procedures, het eiwit toont reproducibly hoogactieve in proton pompen.

Functionalization van kunstmatige lipide bilayers met membraaneiwitten is een belangrijke stap in de assemblage van membraan modelsystemen. Het eenvoudigste model, proteoliposomes (PL), bestaat uit kleine (30-200 nm diameter) unilamellar blaasjes (SUV), ook genaamd liposomen, met eiwitten geïntegreerd in hun membranen. PL traditioneel worden gevormd in twee stappen1. Eerste, voorgevormde SUV worden vermengd met een membraan eiwit van belang en een wasmiddel met een concentratie boven de kritische micel concentratie (CMC). Ten tweede, het wasmiddel wordt verwijderd met verschillende dialyse, "bio-kralen" of gel filtratie technieken, waardoor de eiwitten in het membraan. De laatste benadering is veel sneller (~ 30 min1) en daarom beter voor reconstructie van kwetsbare en gevoelige membraaneiwitten, terwijl de eerste twee benaderingen worden beperkt door wasmiddel verwijdering snelheid, die vele uren duurt en kan leiden tot een aanzienlijk verlies van activiteit en verlies van de structurele integriteit van de eiwitten. Functionalization van grotere blaasjes (grote unilamellar blaasjes, LUV, tot 1 µm) door deze aanpak is moeilijker, als het blaasje na verwijdering van het wasmiddel wordt verkleind en het is niet mogelijk voor de gigantische unilamellar blaasjes (GUV, > 1 µm), zoals ze zijn gedestabiliseerd door detergentia (maar zie Johnson et al. 2 voor langzame 2D-kristallisatie van membraaneiwitten in grote bilayers). Alternatieve benaderingen voor GUV membraan functionalization3,4,5 bestaan maar moeizaam, tijdrovend zijn en vereisen nog enkele wasmiddel bij concentraties onder CMC. Meer complexe of kwetsbare lipide modellen (bijvoorbeeld Droplet Hydrogel Bilayers6 en7van de 3D printbare Droplet Interface dubbelgelaagde gebaseerde artificiële weefsels) tolereren niet detergentia. Snel opkomende synthetische biologie toepassingen8,afhankelijk9,10 kritisch functionalization van dergelijke complexe membraan structuren. Daarom is een gemakkelijke en robuuste methode waardoor snel en zachte bezorging van membraaneiwitten binnen de doelgroep kwetsbare bilayers hoogst gezocht in het veld.
Alternatief, wasmiddel-vrije eiwit leveringsmethode is vesikel fusion, waar interactie blaasjes membranen verenigen in de intacte postfusion dubbelgelaagde, terwijl hun intravesicular waterige inhoud krijgen gemengd, zonder wordt vrijgegeven in de externe milieu. Vesikel fusion is ingeschakeld en gedreven door conformationele herschikkingen binnen de complementaire fusogenic agenten (Sommige eiwitten11,12 en peptiden13 of speciaal gemodificeerde DNA14) gelegen in het contact met bilayers, of Coulombic interacties tussen lipiden-bilayers gevormd van complementair geladen kationische en anionische lipiden15,16, of kationische bilayers en negatief geladen eiwitten17.
De voormalige aanpak vereist de aanwezigheid van fusogenic agentia in de interactie membranen voorafgaand aan de fusie, is relatief traag (~ 30 min tot half-maximaal fusion12,18), maar kan worden toegepast op zowel natuurlijke als kunstmatige membranen.
Een voordeel van de aanpak met behulp van fusogenic lipiden (Figuur 1) is dat het in staat veel sneller membraan fusion (~ 1 min stelt tot half-maximum, en 5-10 min tot het einde van de reactie). Bovendien, kan de omvang van de fusie worden gecontroleerd door i) een makkelijk te formuleren van de relatieve inhoud van geladen lipiden in fusogenic de bilayers, en ii) ionogene en in het algemeen, osmotische kracht van de reactie medium (zouten op boven 50 mM, en, bijvoorbeeld, sacharose15 worden weergegeven om te stoppen met fusion), of een combinatie van beide. Om te beginnen fusion, zijn tegengesteld geladen fusogenic blaasjes gemengd in een laag (gewoonlijk 10-20 mM zout) Ionische sterkte medium voor 5-10 min. Een relatieve nadeel van de methode is dat kationische lipiden een negatief effect op de functionaliteit van membraaneiwitten in kationische proteoliposomes voorafgaand aan de fusie, vooral in lage Ionische sterkte uitoefenen kunnen, maar dit effect omkeerbaar en verholpen door een natuurlijke is lipide samenstelling van de post fusie membraan en de terugkeer naar het normale Ionische sterkte medium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DOPC neutral lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPA anionic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-PC cationic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C3927MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50, Super Fine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400, Type 400-DL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10411523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Insight Biotechnology</td>
			<td>sc-202090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrusion system</td>
			<td>Avanti Extruder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single tube luminometer, model Sirius L</td>
			<td>Titertek Berthold</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter, D19 mm</td>
			<td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes</td>
			<td>WHA800309, WHA800284</td>
			<td>100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers used in the paper</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM MOPS pH 7.4 
			Various concentrations of KCl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.

Wasmiddelen zijn onmisbaar voor de levering van membraaneiwitten in 30-100 nm kleine unilamellar blaasjes, terwijl de meer complexe, grotere model lipide bilayers zijn minder compatibel met detergenten.
Hier beschrijven we een strategie voor het omzeilen van deze fundamentele beperking met behulp van fusogenic tegengesteld geladen liposomen rekening houdend met een membraan eiwit van belang. Fusie tussen dergelijke blaasjes optreedt binnen 5 min in een lage Ionische sterkte buffer. Positief geladen fusogenic liposomen kunnen worden gebruikt als eenvoudige shuttle vectoren voor wasmiddel-gratis levering van membraaneiwitten in biomimetische doel lipide bilayers, die zijn negatief geladen. Ook laten we zien hoe membraaneiwitten reconstrueren in fusogenic proteoliposomes met een snel 30-min-protocol.
De combinatie van deze twee benaderingen, wij laten zien dat een snelle montage van een elektron vervoersketen, bestaande uit twee membraaneiwitten van E. coli, een primaire proton pomp bo3-oxidase en F-1F-o ATP-synthase, in membranen van blaasjes van verschillende grootte, variërend van 0.1 tot > 10 micron, evenals de ATP productie door deze keten.

Het gebruik van fusogenic aanvullende geladen proteoliposomes voor snelle wasmiddel-gratis levering van membraaneiwitten in doel dubbelgelaagde membranen omvat drie stappen (Figuur 1): A, vorming van fusogenic SUV uit lipide-mengsels met hoog inhoud van geladen lipiden; deze SUV kan optioneel belast een intravesicular; B, omzetting van fusogenic SUV in PL met behulp van onze snelle membraan eiwit reconstitutie; C, fusie van fusogenic PL met doel bilayers in lage-zout medium, gevolgd door toevoeging van hoge zout om te stoppen met de fusie-reactie. In het geval van grote blaasjes (D), een beter strategie is het leveren van membraan eiwit in de anionogene doel dubbelgelaagde, waardoor een betere omgeving van het lipide voor activiteit van membraaneiwitten (zie verder in de tekst).
Het protocol van de vorming van GUV met omgekeerde emulsie methode is gemarkeerd in detail in Figuur 2. Wij bij voorkeur gebruik van hexadecaan in het lipide-olie mengsel te wijten aan de relatief hoge vriestemperatuur (18 ° C), waarmee gemakkelijk verwijderen van gestolde olie na GUV pillering.
Figuur 3 toont vesikel fusion kobalt-calceïne-EDTA methode. Fusion is gezien alleen als complementaire geladen blaasjes worden gebruikt in laag zout buffers, terwijl de hogere concentraties van zout (> 50 mM14) of het gebruik van niet-fusogenic blaasjes tonen geen fusie.
Deze snelle protocol van reconstitutie van membraaneiwitten in fusogenic SUV wordt geïllustreerd in figuur 4A. Met behulp van dit protocol, we laten zien snel reconstitutie van primaire proton pomp bo3-oxidase en F1Fo ATP-synthase in PL, en beoordeling van hun specifieke activiteiten in deze membranen. Het is belangrijk te vermelden dat het rendement van eiwit reconstitutie is niet afhankelijk van de lading van een lipide gebruikt15 en ongeveer 50-75 is %25,12, en dat na reconstitutie in PL, het eiwit kan worden opgeslagen voor ten minste drie dagen, zelfs bij kamertemperatuur zonder duidelijk verlies van eiwit activiteit. Deze procedure biedt ook unidirectionele oriëntatie van ATP-synthase, waar meer dan 95% daarvan de hydrofiele groep F1 gericht naar buiten15,26 heeft.
Figuur 5 blijkt dat de proton pompen activiteit van F1Fo (a-Panel) en bo3-oxidase (deelvenster B) in kationische lipiden is verminderd en gevoelig voor lage Ionische sterkte, in vergelijking met anionogene en neutrale lipide milieu, maar Dit effect is opgevangen in postfusion membranen na het smelten van PL+ met anionogene LUV-.
Figuur 6 toont aan de levering van F1Fo ATP-synthase in membranen van grote blaasjes. In dit experiment, PL+ en 800 nm LUV- waren gesmolten in 20 mM KCl gedurende 5 minuten, en het reactieproduct was Ingehuld Schakel al PL+, geresuspendeerde en vehiculumcontrolegroep proton pompen. Control-experimenten toonde geen proton pompen wanneer LUV0 in plaats daarvan van LUV- werden gebruikt in de fusie-reactie (zwarte sporen) of lege LUV- alleen werden getest (blauwe trace).
Snelle montage van een goed functionerende elektronentransport keten in de membranen van grote blaasjes door middel van fusogenic PL is afgebeeld in Figuur 7. We gebruikten F1Fo SUV+ en bo3 SUV+ voor fusion met 800 nm LUV-, en de ATP productie door deze keten in de postfusion vesikels aangetoond door sequentieel toevoeging van co-enzym Q1 en DTT om te activeren membranen en vervolgens toe te voegen fosfaat te activeren van de ATP-synthese door F1Fo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> Figuur 1: conceptie van ultrasnelle wasmiddel-gratis levering van membraaneiwitten in doel lipide bilayers via fusie van unilamellar blaasjes gevormd door complementaire geladen lipiden. (A) vorming van kationische en anionische fusogenic kleine unilamellar blaasjes (SUV+, SUV-) optioneel geladen met intravesicular lading. (B) conversie van fusogenic SUV in fusogenic proteoliposomes (PL) door reconstitutie van membraaneiwitten. (C) wasmiddel-gratis levering van membraaneiwitten in postfusion membranen met fusogenic PL. (D) voorkeur strategie voor levering van membraaneiwitten in membranen van grote blaasjes, geïllustreerd door de fusie tussen 100 nm PL+ en 800 nm LUV-. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> Figuur 2: GUV vorming protocol met een omgekeerde emulsie methode. (A) vorming van een lipide enkelgelaagde op de grens tussen de olie-lipide-mengsel en het water. (B) vorming van een omgekeerde emulsie (water-in-olie). (C) GUV vorming door het passeren van de emulsie via de olie-water-grens door middel van centrifugeren. (D) koeling van de tube hieronder < 18 ° C tot stollen en het verwijderen van de olie. (E) A fluorescent microscopie afbeelding van een GUV met fluorescerende lipide (1% gewicht breuk cholesteryl-Bodipy-FL12) in haar membraan (groen) en een polar fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) in het vesikel lumen (rood). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> Figuur 3: lipide blaasjes fusion studeerde bij de methode kobalt-calceïne-EDTA. (A) schema van de methode, waar gratis calceïne wordt vrijgelaten uit een niet-fluorescerende kobalt-calceïne complex door EDTA. (B) Fusion van SUV in verschillende concentraties van de KCl. (C) versie van de intravesicular calceïne door toevoeging van EDTA en Triton X-100 wasmiddel te postfusion blaasjes in B komt te staan, zoals beschreven in de tekst. De omvang van de fusie (%) voor rode tracering wordt berekend door het signaal maximale achtergrond-gecorrigeerde fusion (1 - 2) door de achtergrond-gecorrigeerde maximale signaal na de release van ingekapselde calceïne (3-2) en te vermenigvuldigen met 100. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> Figuur 4: Ultrasnelle reconstitutie van bo3-oxidase en F1Fo in fusogenic proteoliposomes en eiwit activiteit metingen in dergelijke proteoliposomes. (A) schema van de reconstitutie-protocol. (B) co-enzym Q1 oxidatie gedreven proton pompen door bo3-oxidase in PL gemeten met ACMA blussen (uitgelegd in tekst). (C) ATP hydrolyse-gedreven proton pompen door F1Fo in PL gemeten met ACMA blussen (uitgelegd in tekst). (D) ATP-hydrolyse door F1Fo in PL gemeten met ATP-regenereren systeem (uitgelegd in tekst), en het stimuleren van de uncoupler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> Figuur 5: invloed van de lipide milieu en Ionische sterkte op activiteit van membraaneiwitten. Proton pompen door F1Fo (A) en bo3-oxidase (B) in kationische PL (rode trace), anionogene PL (blauwe trace), neutrale PL (zwarte sporen) en kationogene PL gefuseerd met anionogene LUV (groene trace) in 20 en 100 mM (trace) KCl. Control grijs) wordt geen wijziging in de proton pompen door F-1Fo PL- bij mengen met SUV-. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> Figuur 6: Levering van F1Fo ATP-synthase in membranen van 800 nm LUV- via fusie met PL+. (A) Schematische voorstelling van het experiment: PL+ en 800 nm LUV- waren gesmolten in 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl voor 5 min, Ingehuld Schakel al PL en geresuspendeerde in de dezelfde buffer. (B) Proton pompen door de postfusion LUV (rode trace). Control-experimenten toonde geen ACMA blussen wanneer PL0 waren gemengd met LUV- (zwarte sporen), of lege LUV- alleen werden getest (blauwe trace). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> Figuur 7: 5-min wasmiddel-gratis montage van een keten van elektronentransport in membranen van 800 nm LUV- via fusie met PL+. (A) Schematische voorstelling van het experiment: 100 nm F1Fo PL+ en 100 nm bo3-oxidase PL+ waren gesmolten met LUV-, zoals beschreven in Figuur 6. Fusion werd tegengehouden door het toevoegen van KCl en MOPS tot 100 en 50 mM, respectievelijk. De membranen werden vermengd met ADP-luciferine-luciferase cocktail en energiek door toevoeging van DTT en Q1, zoals beschreven in de tekst. ATP productie werd ingeleid door toevoeging van 1 mM-fosfaat (Pik) en gecontroleerde real time met luciferine-luciferase systeem zoals beschreven in de tekst. (B) ATP-synthese door postfusion blaasjes (rode trace). Control-experimenten toonde geen ATP-productie bij PL+ waren gemengd met LUV- in hoog zout (grijs), of PL0 waren gemengd met LUV- (zwart). ATP synthese tarief werd berekend zoals uitgelegd in de tekst (in stappen van 8,8-8,9). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. at JoVE.com

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Hier presenteren we twee ultrasnelle protocollen voor reconstructie van membraaneiwitten in fusogenic proteoliposomes, en de fusie van dergelijke proteoliposomes met doel lipide bilayers voor wasmiddel-gratis bezorging van deze membraaneiwitten binnen de postfusion dubbelgelaagde. De combinatie van deze benaderingen kan snel en gemakkelijk-gecontroleerde vergadering van complexe multi-component membraan systemen.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...