Name: detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. at JoVE.com

המחברים מודים רוברט Gennis אוניברסיטת אילינוי, כריסטוף פון Ballmoos מ אוניברסיטת ברן עבור מתן של פלסמיד זן לבטא בו3-אוקסידאז. הפרויקט נתמך על ידי BBSRC להעניק BB/L01985X/1 מהיסודות, R.B.

<ol>
	<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).</li><li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins+by+reconstitution+through+dialysis.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.</a> Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).</li><li>Dezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Girard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Angelova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Giant+Vesicles+by+External+Ac+Electric-Fields+-+Kinetics+and+Applications.">Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).</li><li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil.">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li><li>Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Like+Printed+Material.">A Tissue-Like Printed Material.</a> Science. 340 (6128), 48-52 (2013).</li><li>Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+applications+come+of+age.">Synthetic biology: applications come of age.</a> Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Church, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+synthetic+biology.">Realizing the potential of synthetic biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+reconstituted+neuronal+SNARE+complexes+zipper+in+three+distinct+stages.">Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages.</a> Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).</li><li>Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE-fusion+mediated+insertion+of+membrane+proteins+into+native+and+artificial+membranes.">SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes.</a> Nat Commun. 5, 4303 (2014).</li><li>Decout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+a+targeted+fusogenic+peptide.">Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).</li><li>Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+linker+sequences+on+vesicle+fusion+mediated+by+lipid-anchored+DNA+oligonucleotides.">Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).</li><li>Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+one-step+assembly+of+multi-component+membrane+systems+by+fusion+of+charged+proteoliposomes.">A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes.</a> Nat Commun. 7, 13025 (2016).</li><li>Biner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+membrane+proteins+into+small+and+giant+unilamellar+vesicles+by+charge-mediated+fusion.">Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion.</a> FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).</li><li>Bian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+SERCA+calcium+transport+and+small-molecule+inhibition+in+giant+unilamellar+vesicles.">Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).</li><li>Schuette, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+liposome+fusion+mediated+by+synaptic+SNARE+proteins.">Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).</li><li>Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encapsulation+of+cell-free+transcription+and+translation+machinery+in+vesicles+for+the+construction+of+cellular+mimics.">The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics.</a> J Vis Exp. (80), e51304 (2013).</li><li>Verchere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+the+MexAB+efflux+pump+from+Pseudomonas+aeruginosa.">In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Vis Exp. (84), e50894 (2014).</li><li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Microgram+Quantities+of+Protein+in+the+Presence+of+Milligram+Levels+of+Lipid+with+Amido+Black+B-10.">Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).</li><li>Rumbley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase.">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).</li><li>Taussky, H. H., Shorr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microcolorimetric+Method+for+the+Determination+of+Inorganic+Phosphorus.">A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).</li><li>Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+inactive,+cold-stabilized+form+of+the+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase.">A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).</li><li>Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+purification+and+reconstitution+of+His-tagged+cysteine-less+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase.">Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).</li><li>Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deltapsi+and+DeltapH+are+equivalent+driving+forces+for+proton+transport+through+isolated+F(0)+complexes+of+ATP+synthases.">Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).</li><li>Morein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+Escherichia+coli+cells+regulate+the+membrane+lipid+composition+in+a+&amp;#34;window&amp;#34;+between+gel+and+non-lamellar+structures.">Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a &amp;#34;window&amp;#34; between gel and non-lamellar structures.</a> J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).</li><li>Zinser, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+and+lipid+composition+of+subcellular+membranes+in+the+unicellular+eukaryote+Saccharomyces+cerevisiae.">Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).</li><li>Daum, G., Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+lipids+into+mitochondria.">Import of lipids into mitochondria.</a> Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).</li><li>Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+observed+membrane+fusion+between+oppositely+charged+phospholipid+bilayers.">Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers.</a> J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).</li><li>Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+mixing,+fusion,+and+lysis+following+the+interaction+of+populations+of+cationic+and+anionic+phospholipid+bilayer+vesicles.">Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles.</a> J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+association+and+fusion+of+giant+vesicles+using+a+fluorescence-activated+cell+sorter.">Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter.</a> Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).</li><li>Memoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surfactants+on+the+spectral+behaviour+of+calcein+(II):+a+method+of+evaluation.">Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

להלן כמה בעיות צריך להיחשב להצלחה של גישה זו ניסיוני:
הבחירה של השומנים תשלום עבור bilayers proteoliposomes ואת היעד: ליפידים cationic לא יימצאו בטבע, ואילו שומנים anionic הם בשפע מחקר ביולוגי, להגיע, לדוגמה, ~ 25, 35 ו- 20% בקרום הפנימי של e. coli, קרום פלזמה של שמרים cerevisiae סולאחר הממברנות מיטוכונדריאלי הפנימי של מינים רבים, בהתאמה27,28,29. זה יהיה סביר לצפות כי הפונקציונליות של חלבוני ממברנה ב PL+ עשוי להיות מושפע הכוח של מטען חיובי של bilayer, אשר בתורו תלוי תוכן היחסי של cationic השומנים את bilayer וחיצוניים יוניים כוח. לכן, חשוב להתייחס השפעול באיזו מידה הפונקציונליות של חלבוני ממברנה עניין תלוי המטען של הסביבה cationic השומנים. . הנה, אנחנו מראים כי שני F1Fo ATP סינתאז ובו3-אוקסידאז רגישים לסביבה cationic השומנים, אבל הצלחנו לווסת, להפוך את האפקט הזה על-ידי הצבת את החלבונים PL+ הראשונה, להעביר אותם לתוך anionic קבלת bilayers ולאחר מכן העלאת החוזק יוניים של המדיום התגובה לאחר היתוך הוא סיים.
הבחירה של ליפופרוטאין cationic מסוים: ליפידים cationic הנמכרים ביותר הם של הטבע הלא-triacylglyceride; לכן ליפופרוטאין המועמד הפוטנציאלי חייב להיבדק לתאימות עם קרום חלבונים עניין. מצאנו קודם לכן15 ATP סינתאז השתמשו במחקר זה הראה שאת הביצועים הטובים ביותר שלה ב- PL+ יצרו של אתיל-PC, שבו יש את קווי הדמיון המבני הגבוהה ליפידים triacylglyceride טבעי, בעוד DOTAP (הלא-triacylglyceride השומנים) PL+ חלבון זה היה פחות פעיל.
שלפוחית פיוז'ן מבחני: פיוז'ן אמיתי שלפוחית (כאשר תוכן נוזלי intravesicular לערבב) צריך להיות מבודלים ממדינות המי-fusion ביניים, כאשר שלפוחית לדבוק אחד בשני ללא ערבוב תוכנם מימית, אבל ברצון לערבב תוכן החיצוני שלהם או שניהם שומנים בדם כרוזים30. במקרה של השומנים שיוצרת תערובות או בתנאים מסוימים, שלפוחית גם להוכיח בולטת זליגת תוכן נוזלי במהלך פיוז'ן31. ריכוז מינימלי של ליפידים טעון ב תערובות fusogenic המאפשרים פיוז'ן אמיתי צריך להימצא השפעול עבור כל המינים השומנים, אבל באופן כללי, הוא נמצא כי ממברנות עם פחות מ- 10% מחויב ליפידים מעובדים שאינם fusogenic 32.
תוך יצירת fusogenic SUV בנוכחות של רב-עמודים ולנטיין יונים, חשוב לא לערבב רכיבים טעונים הפוך, כמו זו עלולה לגרום clumping מיידית, צבירה של שומנים על ידי יונים אלה. לדוגמה, בעת הכנת רכב שטח עבור שיטת קובלט-calcein-EDTA, חשוב למנוע ערבוב את תערובת השומנים cationic עם EDTA כדי למנוע סתימת של המסנן פוליקרבונט על-ידי רכיבי גושית.
חשוב גם לציין כי שיטת קובלט-calcein-EDTA, בעת היותו רגיש מאוד ונוח לניטור היתוך בזמן אמת, ייתכן עדיין להמעיט את היקף פיוז'ן בשל 1) שכבתה עצמית של זריחה של calcein חינם בתוך שלפוחית postfusion, אשר צפוי להגיע 1 מ"מ, ואילו הסף quenching עצמית הוא דיווח כי בסביבות 20 מיקרומטר33, ו- 2) משטח מכורך קובלט-calcein, אשר נשאר מאוגד ל SUV+ אפילו אחרי שעברו דרך השרף ג'ל-סינון ו צבעים שלפוחית לצבע כתום בהיר, כל רכב שטח0 יש צבע כתום חיוור. שימו לב גם כי שחרורו של קובלט מאוגד-calcein עם תוספת של דטרגנט טריטון X-100 בנוכחות EDTA יוצר אותות הרבה יותר חזק עבור רכב שטח+ (איור 3C, מעקב אדום) מרכב שטח0 (אפורה מעקב).
פרספקטיבות: אנו מצפים כי הגישות מהר המתוארים כאן יכול מאוד להקל ולהאיץ הרכבה של ממברנות מורכבות לצרכי המתעוררים יישומים בביולוגיה סינתטית. פרוטוקול למפת שלנו חלבון ממברנה לוקח רק חצי שעה בשביל שיחזור של חלבונים שבירים רפידה גדול ידוע להיות רגישים טכניקות שיחזור מבוסס-דיאליזה ארוך, בעוד גישה fusogenic זו לוקח רק 5-10 דקות כדי לספק חלבונים כאלה לתוך השומנים גדול bilayers. . הנה, נדגים את היתרונות של גישות אלה על-ידי מניפולציה e. coli F1Fo ATP סינתאז, המהווה דוגמה של חלבון שביר. זה עשוי 23 subunits, ידוע בקלות לאבד את תקינותו אם חשופים לתנאי שיוצרת (לדוגמה, חום) במהלך/אחרי solubilization, אך נעשה שימוש בהליכים אלה, החלבון מדגים פעילות reproducibly גבוה שאיבת פרוטון.

Functionalization של bilayers שומנים בדם מלאכותי עם קרום חלבונים היא צעד המפתח בהרכבה של קרום דגם מערכות. הדגם הפשוט ביותר, proteoliposomes (PL), מורכבת קטנים (30-200 ננומטר קוטר) unilamellar שלפוחית (רכב שטח, גם בשם ליפוזומים), עם חלבונים משולבים הקרומים שלהם. PL נוצרות באופן מסורתי בשני שלבים1. רכב שטח ראשון, preformed מעורבבים עם חלבון ממברנה של עניין חומר ניקוי-ריכוז מעל שלה ריכוז קריטי מיצלה (CMC). שנית, הנוזל מוסר עם דיאליזה, "ביו-חרוזים" או ג'ל סינון בטכניקות שונות, עוזב את החלבון ממברנה. הגישה השנייה היא הרבה יותר מהר (~ 30 דקות1), ולכן עדיף שיחזור של חלבוני ממברנה שברירי ורגיש, בעוד קודם שתי הגישות מוגבלים על ידי הסרת דטרגנט מהירות, אשר לוקח שעות רבות, עלולה לגרום אובדן משמעותי של הפעילות ואובדן השלמות המבנית של החלבונים. Functionalization של גדול שלפוחית (unilamellar גדול שלפוחית, אהובי, עד קוטר 1 מיקרומטר) לפי גישה זו הוא יותר מאתגרת, כמו שלפוחית בגודל מקבל מופחת לאחר הסרת דטרגנט, זה בלתי אפשרי עבור שלפוחית unilamellar ענק (בוס, > 1 מיקרומטר), כפי שהם גרם אולי לפגיעה ביציבות על ידי חומרי ניקוי (אך ראה ג'ונסון. et al. 2 עבור דו-ממדי-התגבשות איטית של חלבוני ממברנה ב bilayers גדול). גישות חלופיות עבור בוס ממברנה functionalization3,4,5 קיים אבל הם מפרך, זמן רב, עדיין דורשים נוזל כביסה בריכוזים מתחת CMC. יותר מורכבים או שביר השומנים מודלים (לדוגמה, Bilayers הידרוג Droplet6 ו- 3D להדפסה מבוסס-Droplet ממשק Bilayer מלאכותי רקמות7) לא יכול לסבול דטרגנטים. מתעוררים במהירות יישומים בביולוגיה סינתטית8,9,10 אנושות תלויים functionalization של מבנים מורכבים קרום כזה. לכן, שיטת קל וחזק המאפשר משלוח מהיר, עדין של קרום חלבונים לתוך bilayers שברירי היעד הוא ביקש מאוד בשטח.
חלופה, שיטת מסירה ללא אבקת חלבון היא היתוך שלפוחית, איפה יתאחדו הממברנות של שלפוחית שמעצבת bilayer postfusion, ללא פגע בעוד התוכן מימית intravesicular שלהם נקשרות, מבלי ששוחרר לתוך החיצוני סביבה. שלפוחית פיוז'ן מופעלת והוא מונע על-ידי rearrangements הסתגלותי בתוך סוכנים fusogenic משלימים (כמה חלבונים11,12 ופפטידים13 או דנ א שונה במיוחד14) ממוקם על פנייה bilayers, או Coulombic אינטראקציות בין השומנים bilayers יצרו של ליפידים cationic ו anionic טעון complementarily15,16, או cationic bilayers חלבונים טעונים שלילית17.
הגישה לשעבר דורש הנוכחות של סוכנים fusogenic בקרום שמעצבת לפני היתוך, יחסית איטי (~ 30 דקות להגיע חצי-מקסימום של פיוז'ן12,18), אך ניתן להחיל על טבעית ומלאכותית ממברנות.
היתרון של הגישה באמצעות fusogenic שומנים (איור 1) הוא שהם מאפשרים הרבה יותר מהר ממברנה פיוז'ן (~ 1 דקות כדי להגיע מקסימום חצי, ו 5-10 דקות כדי לסיים את התגובה). בנוסף, מידת פיוז'ן יכול להיות נשלט על ידי i) קל לגבש תוכן יחסית של שומנים טעון ב- fusogenic bilayers, ו- ii) יוניים, הכוח כלליות, osmotic של המדיום התגובה (מלחים-מעל 50 מ מ, לדוגמה, סוכרוז15 מוצגים להפסיק fusion), או שילוב של שניהם. ליזום פיוז'ן, שלפוחית fusogenic הפוך טעונה מעורבבים במדיום כוח יונית נמוך (בדרך כלל 10-20 מ מ מלח) למשך 5-10 דקות. חיסרון יחסי של השיטה היא שומנים cationic לנצל השפעה שלילית על הפונקציונליות של חלבוני ממברנה ב proteoliposomes cationic לפני היתוך, במיוחד באזור נמוך כוח יונית, אבל האפקט הזה הוא הפיך על ידי טבעי הרכב השומנים של קרום פוסט-פיוז'ן והחזרה שלו למדיום כוח יונית נורמלי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DOPC neutral lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPA anionic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-PC cationic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C3927MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50, Super Fine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400, Type 400-DL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10411523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Insight Biotechnology</td>
			<td>sc-202090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrusion system</td>
			<td>Avanti Extruder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single tube luminometer, model Sirius L</td>
			<td>Titertek Berthold</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter, D19 mm</td>
			<td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes</td>
			<td>WHA800309, WHA800284</td>
			<td>100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers used in the paper</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM MOPS pH 7.4 
			Various concentrations of KCl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.

דטרגנטים הן תנאי הכרחי עבור משלוח של קרום חלבונים לתוך שלפוחית קטנה unilamellar 30-100 ננומטר, בעוד bilayers השומנים מודל מורכב יותר, גדול יותר תואמים פחות חומרי ניקוי.
כאן נתאר אסטרטגיה לעקוף מגבלה זו יסוד באמצעות fusogenic הפוך טעונה ליפוזומים הנושאת חלבון ממברנה עניין. המיזוג בין שלפוחית כזה מתרחש בתוך 5 דקות במאגר עוצמת יוניים נמוכה. ליפוזומים fusogenic הטעון חיובית יכול לשמש כמו הסעות פשוטה וקטורים למסירה ללא חומרי ניקוי של קרום חלבונים לתוך ביונים היעד השומנים bilayers, אשר מחויב באופן שלילי. אנו גם מראים כיצד לשקם קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes עם פרוטוקול במהירות 30-מין.
שילוב שתי הגישות האלה, נדגים אסיפה מהיר בשרשרת האלקטרונים תחבורה בהיקף של שני חלבונים ממברנה מ- e. coli, משאבת פרוטון העיקרי בו3-אוקסידאז ו- F1Fo ATP סינתאז, ב הממברנות של שלפוחית בגדלים שונים, החל 0.1 > 10 מיקרון, כמו גם ייצור ATP על ידי שרשרת זו.

השימוש fusogenic משלימים טעונה proteoliposomes למסירה מהירה ללא חומרי ניקוי של קרום חלבונים לתוך היעד bilayer ממברנות כוללת שלושה שלבים (איור 1): A, היווצרות fusogenic SUV של השומנים תערובות עם גבוה התוכן של ליפידים טעונה; אלה רכב שטח יכול לשאת באופן אופציונלי של עומס intravesicular; B, המרה של fusogenic SUV לתוך PL באמצעות שיחזור חלבון ממברנה מהר שלנו; C, פיוז'ן של fusogenic PL עם היעד bilayers במדיום מלח נמוכה, ואחריו תוספת של מלח גבוהה כדי לעצור את תגובתיות. במקרה של שלפוחית גדול (D), אסטרטגיה עדיפה היא לספק חלבון ממברנלי לתוך bilayer היעד anionic, אשר מספק סביבה טובה יותר השומנים לפעילות של חלבוני ממברנה (שנדונו עוד יותר בתוך הטקסט).
פרוטוקול היווצרות בוס בשיטה הפוכה אמולסיה מודגשת בפירוט באיור2. אנחנו מעדיפים להשתמש hexadecane בתערובת שמן השומנים בשל שלה גבוה יחסית טמפרטורת הקיפאון (18 ° C), המאפשר הסרה קלה של שמן הקרושה לאחר בוס pelleting.
איור 3 מדגים פיוז'ן שלפוחית בשיטת קובלט-calcein-EDTA. פיוז'ן נתפסת רק כאשר משלימים שלפוחית טעונה משמשים במאגרי מלח נמוכה, תוך ריכוז המלח גבוה (> 50 מ מ14) או השימוש הלא-fusogenic שלפוחית להדגים אין פיוז'ן.
פרוטוקול זה מהיר של הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic SUV מודגם ב איור 4A. באמצעות פרוטוקול זה, נדגים מהר הכינון של פרוטון העיקרי לשאוב בו3-אוקסידאז ו- F1Fo ATP סינתאז לתוך PL, והערכה של פעילות מסוימת שלהם ממברנות אלה. חשוב לציין התשואה של חלבון שיחזור אינה תלויה המטען של השומנים נעשה שימוש15 הוא כ- 50-75%25,12, כי לאחר שיחזור לתוך PL, החלבון ניתן לאחסן לפחות שלושה ימים, אפילו בטמפרטורת החדר ללא הפסד ברור של פעילות החלבון. הליך זה מספק גם הכיוון חד כיווני של ATP סינתאז, שבו יותר מ 95% ממנה יש שלה הידרופילית moiety F1 אוריינטציה כלפי חוץ,15,26.
איור 5 מדגים את הפרוטונים שאיבה פעילות של F1Fo (פאנל A) ו- bo3-אוקסידאז (לוח ב') בליפידים cationic הוא מופחת ורגישה נמוך כוח יונית, לעומת הסביבה השומנים anionic ונייטרלי, אבל אפקט זה הוא לפתור בתוך ממברנות postfusion לאחר פיוזינג PL+ עם אהובה anionic–.
איור 6 מדגים משלוח של F1Fo ATP סינתאז לתוך הממברנות של שלפוחית גדול. הניסוי הזה, PL+ , 800 nm LUV– היו התמזגו ב 20 מ מ מתקרב, התחבאו במשך 5 דקות, ואת המוצר התגובה היה מגורען להסיר unfused PL+, resuspended, לבדיקה לשאיבת פרוטון. בקרת ניסויים הראו אין שאיבה פרוטון כאשר LUV0 במקום של סיגל גבעון– שימשו תגובתיות (trace שחור) או ריק LUV– לבד לבדיקה (כחול trace).
הרכבה מהירה בשרשרת האלקטרונים תחבורה מתפקדת הממברנות של שלפוחית גדול על-ידי fusogenic PL מוצג איור7. השתמשנו F1Fo רכב שטח+ בו3 רכב שטח+ עבור פיוז'ן עם 800 nm LUV-, הדגימו ייצור ATP על ידי זה קשור בשרשרת השלפוחיות המוגלתיות postfusion על-ידי הוספת ברצף קואנזים Q1 ל- DTT כדי להמריץ את ממברנות ולאחר מכן הוספת פוספט לעורר סינתזה ATP מאת F1Fo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> איור 1: תפיסת מרביים דטרגנט ללא מסירה של חלבוני ממברנה לתוך היעד bilayers שומנים בדם באמצעות היתוך של unilamellar שלפוחית יצרו של ליפידים טעונה משלימים. (א) היווצרות cationic ו anionic fusogenic unilamellar קטן שלפוחית (SUV+, רכב שטח–) לחלופין נטען עם מטענים intravesicular. (B) המרה של fusogenic SUV לתוך fusogenic proteoliposomes (PL) על ידי בנייתו מחדש של חלבוני ממברנה. (ג) דטרגנט ללא מסירה של חלבוני ממברנה לתוך ממברנות postfusion עם אסטרטגיה עדיפה PL. (ד) fusogenic למסירה של קרום חלבונים לתוך הממברנות של שלפוחית גדול, מאויר על ידי המיזוג בין 100 ננומטר PL+ 800 nm סיגל גבעון–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> איור 2: בוס פרוטוקול היווצרות עם שיטת אמולסיה הפוך. (א) היווצרות טפט השומנים על הגבול שבין תערובת שמן-השומנים והמים. -צורה של תחליב (מים בתוך שמן) הפוך (B). (ג) בוס צורה על-ידי העברת האמולסיה דרך הגבול שמן מים בעזרת צנטריפוגה. (ד) קירור של הצינור מתחת < 18 ° C כדי לחזק ולהסיר את השמן. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אי) A של בוס המכיל שומנים פלורסנט (1% משקל שבר cholesteryl-Bodipy-FL12) הממברנה שלו (ירוק), fluorophore הקוטב (1 מ מ Sulforhodamine 101) לומן של שלפוחית (אדום). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> איור 3: פיוז'ן שלפוחית השומנים למד את שיטת קובלט-calcein-EDTA. תיאור סכמטי של השיטה, איפה calcein חינם הוא שוחרר מן מתחם הלא-פלורסנט קובלט-calcein על ידי EDTA (A). (B) פיוז'ן של רכב שטח בריכוזים שונים של אשלגן כלורי. (ג) פרסום calcein intravesicular על ידי תוספת של EDTA, טריטון X-100 ניקוי postfusion שלפוחית שמוצג ב' כפי שמתואר בטקסט. היקף פיוז'ן (%) עבור מעקב אדום הוא מחושב על ידי חלוקת האות פיוז'ן מתוקן-רקע מקסימלי (1 - 2) ע י מתוקן-רקע מקסימלי האות בעקבות שחרורו של calcein שעברו אנקפסולציה (3-2) והכפלתם במאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> איור 4: מרביים להתחדשות ומבנה של bo3-אוקסידאז ו- F1Fo לתוך fusogenic proteoliposomes, חלבון מידות פעילות כזו proteoliposomes. תיאור סכמטי של פרוטוקול למפת (A). חמצון1 (B) קואנזים Q מונע פרוטון שאיבה ב- bo3-אוקסידאז ב PL נמדד עם ACMA שכבתה (הסביר בטקסט). (ג) ATP מונחה הידרוליזה פרוטון שאיבה מאת1F Fo ב- PL נמדד עם ACMA שכבתה (הסביר בטקסט). (ד) ATP הידרוליזה על ידי1F Fo ב- PL נמדד עם מערכת ATP-רגנרציה (הסביר בטקסט), גירוי שלה על ידי uncoupler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> איור 5: השפעתה של השומנים הסביבה ועל כוח יונית על הפעילות של קרום חלבונים. פרוטון שאיבה מאת F1Fo (A) ו- bo3-אוקסידאז (B) cationic PL (trace אדום), anionic PL (trace כחול), נייטרלי PL (שחור trace) ו cationic PL התמזגו עם אהובה anionic (ירוק trace) ב- 20 ו- 100 מ מ (מעקב בקרת אשלגן כלורי. אפור) מציג ללא שינוי פרוטון שאיבה ב- F1Fo PL– על ערבוב עם רכב–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> איור 6: מסירת F1Fo ATP סינתאז לתוך ממברנות של 800 nm LUV– באמצעות היתוך עם PL+. (א) תיאור סכמטי של הניסוי: PL+ ו-800 ננומטר LUV– היו התמזגו ב- 1 מ מ מגבים (pH 7.4), 1 מ MgCl2, 20 מ מ מתקרב, התחבאו במשך 5 דקות, מגורען להסיר unfused PL, resuspended במאגר אותו. פרוטון (B) שאיבה מאת אהובה postfusion (trace אדום). בקרת ניסויים הראו אין ACMA שכבתה PL0 , מעורבים עם אהובה– (סימן שחור), או ריק LUV– לבד היו לבדיקה (כחול trace). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> איור 7: 5-מין ללא דטרגנט הרכבה של שרשרת האלקטרונים תחבורה בתוך ממברנות של 800 nm LUV– באמצעות היתוך עם PL+. (א) תיאור סכמטי של הניסוי: 100 ננומטר F1Fo PL+ ו- 100 ננומטר בו3-אוקסידאז PL+ היו התמזגו עם אהובה-, כמתואר באיור 6. פיוז'ן הופסקה על-ידי הוספת אשלגן כלורי MOPS 100 ו- 50 מ מ, בהתאמה. הממברנות היו מעורבבים עם ADP-luciferin-לוציפראז קוקטייל, אנרגיות תוספת של DTT ו- Q1, כפי שתוארה בטקסט. ייצור ATP הופעל על-ידי תוספת של 1 מ מ פוספט (Pאני) תחת פיקוח בזמן אמת עם מערכת לוציפראז-luciferin כפי שתוארה בטקסט. סינתזה (B) ATP על ידי שלפוחית postfusion (trace אדום). בקרת ניסויים הראו אין ייצור ATP PL+ , מעורבים עם אהובה– במלח גבוהה (אפור), או PL0 , מעורבים עם אהובה– (שחור). קצב סינתזת ATP מחושב כפי שמוסבר בטקסט (שלבים 8.8-8.9). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. at JoVE.com

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז'ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...