Name: detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00
Duration: 11 min 10 s
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저자는 감사 로버트 Genn 일리노이 대학에서 크리스토프 폰 Ballmoos 베른 대학에서에서 제공 하는 플라스 미드와 보3를 표현 하는 스트레인-산화 효소. 프로젝트 BBSRC에 의해 지원 되었다 제공 RI와 R.B. BB/L01985X/1을 부여

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저자는 공개 없다.

다음과 같은 몇 가지 문제가이 실험 방법의 성공을 위해 고려해 야 할:
의 지질 bilayers proteoliposomes 및 대상에 대 한 선택: 양이온 지질에에서 없는 자연, 음이온 지질은 풍부한 생물 막 도달, 예를 들어, 25, 35, 대장균, 효 모 S. cerevisiae, 원형질 막 및의 안 미토 콘 드리 아 막의 내부 막에서 20%에 많은 종, 각각27,,2829. 그것은 합리적인 pl+ 막 단백질의 기능 양이온 지질 bilayer는에서 및 외부 이온의 상대적인 내용에 따라 차례로 bilayer의 포지티브 차지의 강도 의해 영향을 받을 수 있습니다 기대 하는 것 강도입니다. 따라서, 그것은 어느 정도 관심의 막 단백질의 기능에 따라 다르죠 양이온 지질 환경의 실험적으로 해결 하는 것이 중요. 여기, 우리는 둘 다 F1Fo ATP synthase와 보3보여줍니다-산화 효소 양이온 지질 환경에 민감 하지만 우리가 조절 하 고 관리 하 첫 pl+ 단백질을 배치 하 고에 그들을 제공 하 여이 효과 역방향 음이온 bilayers, 수락 하 고 다음 퓨전 후 반응 매체의 이온 강도 증가 완료.
특정 양이온 지질의 선택: 대부분 상용 양이온 지질은 비 triacylglyceride 자연; 따라서 잠재적인 후보 지질 막 단백질의 호환성에 대 한 테스트 되어야 한다. 우리가15 는이 연구에 사용 된 ATP synthase PL+ 에서 최상의 성능을 에틸-PC, DOTAP (triacylglyceride에에서 자연 triacylglyceride 지질 하 높은 구조 유사 했다의 형성 이전에 발견 지질) PL+ 이 단백질이 덜 활성화 했다.
소포 융해 분석 실험: 진정한 기 퓨전 (intravesicular 액체 내용을 믹스) 때 소포 그들의 수성 콘텐츠를 혼합 하지 않고 서로 준수 하지만 쉽게 그들의 외부 또는 둘 다 지질의 내용을 혼합 중간 hemi-퓨전 상태에서 분화 될 필요가 전단지30. 차선의 지질 혼합물 또는 특정 조건, 소포는 또한 퓨전31동안 발음된 액체 내용 누설을 보여줍니다. 진정한 퓨전을 사용 하는 fusogenic 혼합물에 충전된 지질의 최소 농도 각 지질 종족에 대 한 실험적으로 발견 될 필요가 있지만 일반적으로, 그것은 10% 미만으로 세포 막 지질은 비 fusogenic 32렌더링 청구 발견.
멀티-발렌타인 이온의 존재에 fusogenic SUV를 형성 하는 동안 그것은 중요 하다 반대로 충전된 구성 요소, 혼합에 아닙니다이 이온에 의해 즉시 응집 및 지질 집계 될 수 있습니다. 예를 들어 코발트-calcein-EDTA 메서드에 대 한 SUV를 준비 하는 동안 이멀전의 구성 요소 폴 리 카보 네이트 필터의 막힘을 방지 하기 위해 EDTA와 양이온 지질 혼합물을 혼합 하지 마십시오 중요 하다.
그것은 또한 그 코발트-calcein-EDTA 방법 매우 민감하고 실시간 퓨전 모니터링, 편리 하면서 수 여전히 과소 평가 1 인 융합의 범위를 언급 하는 것이 중요) 자체 내부 무료 calcein의 형광의 냉각 postfusion 소포, 자체 냉각 임계값은 약 20 µ M33, 고 2 보고 하는 동안 1 m m를 도달할 것으로 예상 되는) 표면 바인딩된 코발트-calcein, 젤 여과 지를 통과 후에 SUV+ 에 바인딩된 남아 있는 고 반면 SUV0 창백한 오렌지 색상 밝은 오렌지 색 소포를 색상. 또한 세제 Triton X-100 EDTA 존재의 추가에 바인딩된 코발트 calcein의 출시 SUV0 (회색 추적) 보다 SUV+ (그림 3C, 빨간 추적)에 대 한 훨씬 더 강력한 신호 생성 note.
관점: 우리는 여기에 설명 된 빠른 접근 수 있습니다 크게 용이 하 게 하 고 속도 신흥 합성 생물학 응용 프로그램의 요구에 대 한 복잡 한 막의 어셈블리를 기대. 우리의 막 단백질 재구성 프로토콜은 깨지기 쉬운 큰 막 단백질의 재구성에 대 한만 30 분이 fusogenic 접근 제공에 5-10 분 동안 긴 투 석 기반 재구성 기술에 민감한 것으로 알려져 큰 지질 bilayers에 같은 단백질. 여기, 대장균 F1Fo ATP synthase, 깨지기 쉬운 단백질의 예로 조작 하 여 이러한 접근 방법의 이점을 설명 합니다. 그것은 23 subunits 고 중/후 가용 화, 차선 조건 (예: 열)에 노출 하는 경우의 무결성을 쉽게 잃게 알려져 있다 하지만이 절차에서 사용 되 고, 단백질 양성자 펌프에 reproducibly 높은 활동을 보여줍니다.

막 단백질을 함께 인공 지질 bilayers의 기능화 막 모델 시스템의 어셈블리에서 핵심적인 단계입니다. 가장 간단한 모델, proteoliposomes (PL), 소형 (30-200 nm 직경)의 구성 단백질 unilamellar 소포 (SUV, 또한 전화 리), 그들의 막에 통합. PL은 전통적으로 형성 된 2 단계1. 첫째, 미리 형성한 SUV는 막 단백질의 관심, 임계 micelle 농도 (CMC)의 위 농도에 세제와 혼합 됩니다. 둘째, 세제는 다양 한 투 석, "바이오-비즈" 또는 젤 여과 기법, 막에 있는 단백질을 떠나 함께 제거 됩니다. 후자의 접근 방식을 훨씬 빠른 (~ 30 분1) 이며 따라서 연 약하고 민감한 막 단백질의 재구성 하는 것이 좋습니다 동안 처음 두 가지 방법 많은 시간을 소요 하 고 발생할 수 있습니다 세제 제거 속도 의해 제한 되는 활동 및 단백질의 구조적 무결성의 손실의 상당한 손실. 더 큰의 기능화 소포 (큰 unilamellar 소포, LUV, 1 µ m 직경까지)이이 접근에 의해 더 도전 소포 크기 세제 제거 후 감소 되 면 이며, 그것은 거 대 한 unilamellar 소포 불가능 (우두머리, > 1 µ m), 그들은 세제 (하지만 참조 존슨 그 외 여러분 에 의해 불안정 2 큰 bilayers에 있는 막 단백질의 느린 2D-결정에 대 한). 우두머리 막 기능화3,,45 에 대 한 대체 방법을 존재 하지만 힘 드는, 시간 소모, 그리고 일부 세제 농도 CMC 아래에서 해야. 더 복잡 한 또는 허약한 지질 모델 (예를 들어 물방울 히드로 Bilayers6 및 3D 인쇄 방울 인터페이스 Bilayer 기반 인공 조직7) 세제를 참을 수 없습니다. 신속 하 게 합성 생물학 응용 프로그램8,신흥9,10 비판적으로 의존 같은 복잡 한 막 구조의 기능화. 따라서, 대상 연약한 bilayers에 막 단백질의 신속 하 고 부드러운 배달 수 있도록 쉽고 강력한 방법 높은 필드에 전과 있다.
대신, 세제 무료 단백질 전달 방법이 이다 소포 융해, 어디 상호 작용 소포 막 단결 그대로 postfusion bilayer에 그들의 intravesicular 수성 내용, 외부에 발표 되 고 없이 혼합 하는 동안 환경입니다. 소포 융해 활성화는 연락에 있는 보완 fusogenic 에이전트 (일부 단백질11,12 , 펩 티 드13 또는 특별히 수정 된 DNA14) 내에서 구조적 재배열에 의해 구동 bilayers, 또는 지질 bilayers 간의 Coulombic 상호 작용 complementarily 충전된 양이온 및 음이온 지질15,16또는 양이온 bilayers 및 부정 청구 단백질17의 형성.
전 접근 필요 퓨전, 이전 상호 작용 세포 막의 fusogenic 요원의 존재 이지만 상대적으로 느린 (~ 30 분 퓨전12,18의 절반 최대에 도달), 모두 자연과 인공에 적용할 수 있습니다. 막입니다.
Fusogenic 지질 (그림 1)를 사용 하 여 접근의 장점은 훨씬 빠른 막 융합 (반-최대, 및 반응 완료 5-10 분 ~ 1 분)는 이다. 또한, 융합의 범위 i) 하기 쉬운 상대 콘텐츠 청구 지질 bilayers fusogenic, 및 ii) 이온의 일반, 삼투성 강도 50 m m 및, 예를 들어, 자당15 위 (소금에서 반응 매체의 공식화에 의해 통제 될 수 있다 같습니다 퓨전 중지), 또는 둘 다의 조합. 퓨전을 시작 하려면 반대로 충전된 fusogenic 소포는 5-10 분에 대 한 낮은 (일반적으로 10-20 밀리미터 소금) 이온 강도 매체에 혼합 됩니다. 한 상대는 방법의 단점은 양이온 지질 양이온 proteoliposomes 퓨전, 특히 낮은 이온 강도에서 이전에 막 단백질의 기능에 부정적인 영향을 발휘할 수 있습니다 하지만이 효과 가역과 자연에 의해 완화 융해 후 막과 정상 이온 강도 매체에 그것의 반환의 지질 구성.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DOPC neutral lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPA anionic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-PC cationic lipid</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C3927MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50, Super Fine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400, Type 400-DL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10411523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Insight Biotechnology</td>
			<td>sc-202090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrusion system</td>
			<td>Avanti Extruder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single tube luminometer, model Sirius L</td>
			<td>Titertek Berthold</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter, D19 mm</td>
			<td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes</td>
			<td>WHA800309, WHA800284</td>
			<td>100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers used in the paper</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM MOPS pH 7.4 
			Various concentrations of KCl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-free ultrafast reconstitution of membrane proteins into lipid bilayers using fusogenic complementary-charged proteoliposomes.

더 복잡 한, 더 큰 모델 지질 bilayers는 세제와 덜 호환 세제 30-100 nm 작은 unilamellar 소포에 막 단백질의 납품을 위한 불가결 하지 않습니다.
여기는 반대로 리 베어링의 막 단백질을 청구 하는 fusogenic를 사용 하 여이 근본적인 한계를 우회에 대 한 전략에 설명 합니다. 이러한 vesicles 사이의 융합 낮은 이온 강도 버퍼에서 5 분 이내에 발생합니다. 긍정적으로 위탁된 한 fusogenic 리 부정 청구 biomimetic 대상 지질 bilayers에 막 단백질의 세제 무료 배달에 대 한 간단한 셔틀 벡터로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 fusogenic proteoliposomes 빠른 30 분 프로토콜에 막 단백질을 다시 구성 하는 방법을 보여줍니다.
이러한 두 가지 방식을 결합 하 여, 대장균에서 두 막 단백질의 구성 하는 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리 설명, 기본 양성자 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase의 세포 막에서 0.1에서 배열 하는 다양 한 크기의 소포 >이 체인에 의해 ATP 생산 뿐 아니라 10 미크론.

Fusogenic 사용 하 여 무료 충전 3 단계 (그림 1)를 포함 하는 대상 bilayer 막으로 막 단백질의 빠른 세제 무료 배달에 대 한 proteoliposomes: A, fusogenic SUV 높은 지질 혼합물에서의 형성 충전된 지질;의 내용 이 SUV는 intravesicular 부하;을 선택적으로 있습니다. B, 우리의 빠른 막 단백질 재구성;를 사용 하 여 PL로 fusogenic SUV의 변환 C, fusogenic PL 대상 bilayers 낮은 소금 매체에서와 융합 융합 반응을 중지에 높은 소금의 추가 의해 따라. 큰 소포 (D) 일 경우 바람직 전략 음이온 대상 bilayer, 막 단백질의 활동에 대 한 더 나은 지질 환경 제공으로 막 단백질을 제공 하는 (토론 더 텍스트에서).
거꾸로 에멀젼 방법을 우두머리 형성 프로토콜은 그림 2에 자세히는 강조 표시 됩니다. 우리 때문에 상대적으로 높은 지질 오일 혼합물에 hexadecane를 사용 하는 것을 선호 판 우두머리 후 응고 기름 쉽게 제거 가능 (18 ° C) 냉동 온도.
그림 3 에서는 소포 융해를 코발트-calcein-EDTA 메서드를 사용 하 여 보여 줍니다. 퓨전 보완 청구 소포 높은 소금 농도 동안 낮은 소금 버퍼에 사용 됩니다 경우에 볼 수 있다 (> 50 m m14) 또는 비 fusogenic 소포를 사용 하 여 설명 없는 퓨전.
Fusogenic SUV로 막 단백질의 재구성의이 빠른 프로토콜은 그림 4A에 나와 있습니다. 우리 빨리 입증이 프로토콜을 사용 하 여 기본 양성자의 재구성 펌프 보3-산화 효소와 F1Fo ATP synthase PL, 그리고이 세포 막에 그들의 특정 활동의 평가에. 그것은 중요 한 단백질 재구성의 수익률 지질 사용15 의 책임에 의존 하지 않습니다 및 약 50-7525,12, 그리고 그 후에 PL로 재구성, 단백질 저장 될 수 있다 적어도 3 일 에서도 단백질 활동의 명백한 손실 없이 실내 온도. 이 절차는 또한 ATP synthase, 그것의 95%는 그것의 친수성 moiety F1 중심 바깥쪽15,26의 단방향 방향을 제공 합니다.
그림 5 는 F1Fo (패널 A)의 활동 및 보3를 양수 하는 양성자를 보여줍니다-양이온 지질에 산화 효소 (패널 B)은 감소 하 고 음이온과 중립 지질 환경에 비해 낮은 이온 강도에 민감 하지만 이 효과 음이온 LUV-+ PL 융합 후 postfusion 막에 완화 됩니다.
그림 6 의 큰 소포 막으로 F1Fo ATP synthase의 납품을 보여 줍니다. 이 실험, PL+ 에 800 nm LUV- 20 m m KCl 5 분, 그리고 반응 제품에 융합 했다 수송과 들뜬된 PL+를 제거 하려면, resuspended 이었고 양성자 펌프에 대 한 분석. 제어 실험 아무 양성자 펌핑 LUV0 대신 LUV- 의에서 사용 된 융해 반응 (검은 추적), 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적) 하는 때 보였다.
Fusogenic PL에 의하여 큰 소포 막에 작동 전자 전송 체인의 빠른 어셈블리는 그림 7에 표시 됩니다. F1Fo SUV+ 를 사용 하는 우리 보3 SUV+ 융해 800 nm LUV-, 코엔자임 Q1 과 정력적으로 DTT 순차적으로 추가 하 여이 체인 postfusion 소포에 의해 ATP 생산을 증명 막, 고 인산 염 ATP 합성 F1Fo트리거 추가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> 그림 1: 개념의 초고속 세제 무료 배달 막 단백질의 unilamellar vesicles의 융합을 통해 대상 지질 bilayers에 보완 된 지질 형성. 선택적으로 intravesicular 화물 적재 양이온 및 음이온 fusogenic unilamellar 작은 소포 (+의 SUV, SUV-)의 (A) 형성. (B) fusogenic fusogenic proteoliposomes (PL) 막 단백질의 재구성에 의해에 SUV의 변환. (C) 세제 무료 큰 소포, 100 nm PL+ 사이의 융합에 의해 그림의 세포 막에 막 단백질의 배달에 대 한 fusogenic와 줘. (D) 바람직 전략 postfusion 막으로 막 단백질의 배달 그리고 800 nm LUV-입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> 그림 2: 우두머리 형성 프로토콜 거꾸로 에멀젼 방법. (A) 석유 지질 혼합물 및 물 사이 국경에 지질 단층의 형성. (B)는 거꾸로 (물에서 기름) 유제의 형성. 원심 분리에 의하여 기름-물 국경을 통해 유제를 전달 하 여 (C) 우두머리 형성. (D) 냉각 튜브 아래의 < 18 ° C 고형화 하 고 기름을 제거 ~. 그것의 막 (녹색)와 기의 루멘 (레드)에서 북극 fluorophore (1 m m Sulforhodamine 101) 형광 지질 (1% 무게 분수 cholesteryl-Bodipy-FL12)를 포함 하는 우두머리의 (E) A 형광 현미경 이미지. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> 그림 3: 지질 소포 융해 코발트-calcein-EDTA 방법으로 공부 했습니다. 어디 무료 calcein 릴리스입니다 비 형광 코발트-calcein 복합물에서 EDTA에 의해 방법의 (A) 회로도 (B) 융합의 SUV 다양 한 KCl 농도에서. 텍스트에 설명 된 대로 B 에서처럼 postfusion 소포를 EDTA와 트라이 톤 X-100 세제의 추가 의해 intravesicular calcein의 (C) 자료. 붉은 추적에 대 한 융합 정도 (%)은 최대한 배경 수정 퓨전 신호를 나누어 계산 (1-2) 신호에 의해 배경 수정 최대한 캡슐화 된 calcein (3-2)의 출시에 따라 고 100을 곱한. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> 그림 4: 보3의 초고속 재구성-산화 효소 및 fusogenic proteoliposomes와 같은 proteoliposomes에 단백질 활동 측정으로 F1Fo . (A) 도식 재구성 프로토콜의 (B) 코엔자임 Q1 산화 양성자 펌프 보3에 의해 구동-PL 산화 효소 (텍스트 설명)를 냉각 하는 ACMA로 측정. (C) ATP 가수분해 기반 양성자 펌핑 pl에서 F1Fo ACMA 냉각 (텍스트 설명)로 측정. F1Fo pl에서 (D) ATP 가수분해 ATP 회생 시스템 (텍스트 설명), 및 그것의 자극에는 uncoupler에 의해 측정. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> 그림 5: 막 단백질의 활동에 지질 환경 및 이온 강도 영향. 양성자 펌프 F1Fo (A) 및 보3-20, 100 m m KCl. 제어 추적 (음이온 LUV (녹색 추적)와 융합 하는 양이온 PL (빨간 추적), 음이온 PL (블루 추적), 중립 PL (검은 추적), 그리고 양이온 PL에 산화 효소 (B) 회색) Fo PL- 혼합 시 SUV-와 F1에 의해 양수 하는 양성자의 변화를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> 그림 6: 배달 F1Fo ATP synthase의 800의 세포 막에 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): PL+ 와 800 nm LUV- 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 m m MgCl2, 20 m m KCl 5 분, 제거 수송과 융합 했다 PL, 들뜬 및 동일한 버퍼에서 resuspended. (B) 양성자 postfusion LUV (빨간 추적)에 의해 펌핑. 제어 실험 때 PL0 luv- (검은 추적), 혼합 했다 또는 빈 LUV- 혼자 분석 (블루 추적)에 냉각 하는 아무 ACMA 보였다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> 그림 7: 5-분 세제 무료 조립 800의 세포 막에서 전자 전송 체인의 PL+와 융합을 통해 nm LUV- . 실험의 개략도 (A): 100 nm F1Fo PL+ 와 100 nm 보3- 그림 6에서 설명한 대로 산화 효소 PL+ -, LUV로 융합 했다. 퓨전은 KCl MOPS 100, 50 mM에 각각 추가 하 여 중지 되었습니다. 세포 막 ADP-소-luciferase 칵테일 혼합 되었고 텍스트에 설명 된 대로 DTT와 Q1의 추가 의해 활성화. ATP 생산은 1 m m 인산 염 (Pi) 및 모니터링된 실시간으로 텍스트에 설명 된 대로 luciferase 소 시스템의 추가 의해 시작 되었다. Postfusion 소포 (빨간 추적)에 의해 (B) ATP 종합. 제어 실험 때 PL+ 높은 소금 (회색), LUV- 와 함께 혼합 했다 또는 PL0 LUV- (블랙)와 함께 혼합 했다 아니 ATP 생산을 보였다. ATP 합성 속도 텍스트 (단계 8.8 8.9)에 설명 된 대로 계산 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

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생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

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스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

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Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

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Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...