Name: ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra NINDS til KMC (R01 NS086932). LMN blev støttet af en bevilling fra NIGMS IMSD program (R25 GM076419). Stammer, der anvendes i denne undersøgelse C. elegans genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi takke James Baker og Mason Klein til nyttige diskussioner.

1. stammer, kultur, medier, og montering af dyr
<ol><li>Vokse C. elegans orme ved 20 ° C på standard 60-mm Nematode vækst Medium (NGM) agar plader med OP50 E. coli bakterie mad19.</li>
	<li>Forbered to plasmider for hver celle-specifikke promotor af interesse: en kørsel udtryk for GCaMP5 at optage intracellulære Ca2 +og den anden, kører udtryk for mCherry at give mulighed for ratiometric kvantificering af GCaMP5 fluorescens ændringer og forenkle objekt konstatering og måling. Bemærk: GCaMP5:mCherry ratiometric imaging korrigerer for udsving i GCaMP5 fluorescens, der skyldes ændringer i fokus og dyrs bevægelse, ikke egentlige ændringer i intracellulære Ca2 +.</li>
	<li>Tilføre gonaderne af LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X mutant dyr udtryk for GCaMP5 og mCherry plasmider sammen med pL15EK synlig rescue markør plasmid og gendanne ikke-Muv lin-15(+) dyr udtryk for GCaMP5 og mCherry fra en høj-kopi transgen20,21,22. Bruge lite-1 mutant baggrunden til at reducere blåt-lys undgåelse adfærd23,24.</li>
	<li>Integrere transgener til kromosomer at reducere mosaicisme og forenkle generation af sammensatte mutantstammen25. Bemærk: Den LX2004 stamme beskrevet her bærer en integreret high-kopi transgen, der udtrykker GCaMP5 og mCherry i HSNs fra nlp-3 initiativtageren (Se Tabel af materialer)26,27, 28 , 29. nlp-3 promotor blev anset for at drive stærke udtryk i HSNs sent L4 og voksne dyr uden forårsager betydelig defekter i HSN udvikling eller æglægning adfærd i forhold til andre initiativtagere testet (e.g.,tph-1, EGL-6, og unc-86). Denne stamme og andre, der udtrykker GCaMP5 og mCherry i ventrale ledning (VC) motoriske neuroner, vulval muskler og uv1 neuroendokrine celler findes fra byens Caenorhabditis genetik og detaljer om deres konstruktion har været beskrevet 27.</li>
	<li>Anvende OP50 bakteriel mad fra en seedede NGM agar plade til bunden af en platin orm pick, og bruge det til at overføre ~ 20 sen L4 LX2004 dyr, der udtrykker GCaMP5 og mCherry i HSNs fra nlp-3 initiativtageren. Sikre, at udviklingslandene vulva vises i et stereomikroskop som en tydelig mørk plet omgivet af en hvid crescent. Inkuber dyr ved 20 ° C til 24-40 h.</li>
	<li>Efter inkubation, gælder OP50 for pick og overførsel ~ 3 af orme til en unseeded NGM plade, så en lille mængde af mad bag til orme til foder på under imaging. Sikre tilstrækkelig mad, da for lidt bakteriel mad vil tilskynde orme at vandre væk fra midten af pladen, mens alt for meget mad vil øge baggrunden fluorescens og forårsage iltmangel.</li>
	<li>Brug en flad afrundet spatel til at skære en ~ 20 mm x 20 mm luns fra pladen transporterer orme og overføre luns opad på midten af en ren 24 mm x 60 mm #1.5 coverslip (figur 1). Start programmet fra den ene side at holde bobler fra at være fanget under coverslip og interfererende med billedbehandling. 22 mm x 22 mm #1 dækglas til toppen af luns at reducere stikning og fordampning.</li>
</ol>2. hardware og Instrumentation Setup
<ol><li>Placer den iscenesatte, transgene orme på scenen af en inverteret mikroskop med en ≥ 0,7 numerisk blænde Plan-Apochromat 20 x objektive, motoriseret XY fase kan styres med et joystick, image splitter og fluorescens filtre for samtidige GCaMP5 og mCherry excitation og emission, kameraer til fluorescens og infrarød brightfield imaging, og et triggerable Light Emitting Diode (LED) belysning system (fig. 2A). Bemærk: En 80/20 stråledeler sender 80% af billedet signal til fluorescens kamera og 20% til brightfield kamera. En opretstående mikroskop kan også bruges, men NGM luns bør placeres i mellem et glas dias og den store coverslip i dette tilfælde.<ol>
<li>Brug kikkerten okularerne til at vælge en orm til billedbehandling. Når et dyr er valgt, skub den infrarød filter i sted over kondensatoren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transistor-transistor logic (TTL) udløser<ol>
<li>Vedhæfte koaksiale kabler fra hver af de tre TTL udløser output linjer på fluorescens kamera. Tilslut den første produktion til BNC input #3 af LED belysning system.</li>
		<li>Tilslut den anden udgang til en BNC 'banan' adapter med grøn og brun ledninger fra 8-pin GPIO connector kører til GPIO input #3 (pin 4) og jorden (pin 5) af den infrarøde kamera, henholdsvis.</li>
		<li>Tilslut den tredje udgang til en BNC 'banan' adapter med jumper ledninger kører til #8 digital indgang og jorden i digital erhvervelse enhed (fig. 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digital erhvervelse enhed (DAQ)<ol>
<li>Tilslut DAQ microcontroller board (Se Tabel af materialer) til pc'en via et USB-kabel. Opdatere firmware med standard Firmata protokol (Se Tabel af materialer) og konfigurere USB-porten til at kommunikere på 57600 baud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lysdioder<ol>
<li>Køre LED Controller-software (Se Tabel af materialer). Skifte tilstanden udløser fra 'Løbende til 'Gated' og vælg udløser kanal ' 3' til begge 470 og 590 nm lysdioder.</li>
		<li>Aktivere og angive LED power for hver LED (f.eks. sæt 470 nm LED til 20% og Lysdioden 590 nm til 40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Køre serie-fase kommunikation script "XY-fase-finalen" i Bonsai (Se Tabel af materialer)30. Klik på noden grå 'CsvWriter' og vælg en mappe til at gemme den optagede X og Y stage oplysninger (figur 3). Tryk på den grønne pilespids på værktøjslinjen for at initialisere DAQ. Bemærk: Scriptet starter optagelse af X og Y stage position når fluorescens kameraet sender et signal om TTL. Dette script output fire kolonner af data: ramme antallet, X-position (µm), Y position (µm), og intervallet mellem rammer (s).</li>
	<li>I den infrarøde kamera optagelse software (Se Tabel af materialer) under 'Custom Video Modes,' Vælg "Mode 1" (2 x 2 binning; 1.024 x 1.024 pixel), og "Pixel Format Raw 8". Under ' Trigger / Strobe', udløser input-linie (GPIO) er indstillet til "3", polaritet til "Høj", "Mode" til "14". Skifte 'Aktiver' at stoppe ramme erhvervelse, indtil en TTL trigger signal modtages.<ol>
<li>Forlader dette vindue åbent, skal du klikke på den røde "Record"-knappen på værktøjslinjen hovedkameraet. Vælg mappen for billedsekvenser skal gemmes. Vælg "Buffered" optagetilstand, og gemme 'Billeder' i JPEG-format. Klik på "Start optagelse" for at initialisere erhvervelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluorescens kamera og image splitter Bemærk: GCaMP5 og mCherry fluorescens kanaler skal indsamles samtidig for at sikre korrekt billede registrering for ratiometric kvantificering. En image splitter giver to-kanals erhvervelse af GCaMP5 og mCherry fluorescens på en sensor.<ol>
<li>I fanen 'Fange' af image erhvervelse software (Se Tabel af materialer), sæt eksponeringstid til 10 ms, binning til at 4 x og billeddybde til 16-bit. Vælg en centreret kamera subarray på 512 pixel bred x 256 pixel høj. Klik på 'Vis Output udløser indstillinger' og sæt alle udløsere til 'Positive'. Bemærk: DAQ kan lejlighedsvis savner TTL udløser, hvis de er 10 ms eller mindre.</li>
		<li>Sikre at 'Udløser 1' og 'Udløser 2' er indstillet til «Engagementer», mens 'Udløser 3' er indstillet til "Programmerbar" med en "periode" af 25 ms. Under fanen 'Sequence', Vælg «Tid bortfalder» med et felt Delay1 af 50 ms til at indsamle billeder på 20 Hz. Vælg «Save til midlertidig Buffer.»</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMT gain og laser intensitet under tre kanal Konfokal imaging<ol>
<li>Indstille ydelse gevinst, så baggrunden Fluorescens er på et niveau lige over minimum (Sortniveau). Øge 561 nm (grøn) laser magt, indtil en enkelt mættede 12-bit eller 16-bit pixel er observeret på den præsynaptiske endestation i mCherry kanalen.</li>
		<li>Justere 488 nm (blå) laser intensitet, så GCaMP5 Fluorescens er kun synlige på den præsynaptiske terminus over baggrunden. Indstillingen lav forhindrer mætning af GCaMP5 pixels når fluorescens øger svar på stærk Ca2 + transienter. Åbn Konfokal pinhole hele vejen til at maksimere lys capture.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ratiometric Ca2 + Imaging og adfærd optagelse
<ol><li>Klik på "Start" for at begynde optagelse under fanen 'Sequence' i fluorescens erhvervelse software. Spore orm med joystick, holder cellerne og synapser af interesse i fokus og i midten af field of view (FOV). Klik på knappen 'Statistik' i vinduet histogram at vise pixel statistik for hver kanal.</li>
	<li>Justere LED beføjelse til at sikre en maksimal enkelt pixel mCherry fluorescens på den præsynaptiske endestation på ≥ 8.000 tæller (~ 4.000 photoelectrons), giver en ~ 12-bit dynamikområde over baggrunden (~ 100 photoelectrons). GCaMP5 signaler på den præsynaptiske terminus under hvile (lav) Ca2 + bør være omkring ~ 2.500 tæller - netop synlig over baggrund.</li>
	<li>Optage indtil en æglægning aktiv tilstand er nået; Dette sker typisk hver 20-30 min i en vildtype orm7. Gemme en 10-min delmængde (12,001 rammer), 6.000 billeder før og efter den første æglægning begivenhed (frame 6,001). Sørg for at holde den samme delmængde af brightfield billeder af orm, adfærd og timepoints af XY fase holdning, eller den præcise synkronisering af data-streams vil gå tabt.</li>
	<li>Bruge ImageJ og BioFormats plugin (Se Tabel af materialer) at konvertere billedsekvenser til billede flowcytometri Standard (.ics) format, så det kan importeres til Ratiometric kvantitering software.</li>
</ol>4. billede segmentering og kvantitativ analyse
<ol><li>Importere billedsekvenser til Ratiometric kvantitering software (Se Tabel af materialer). Klik på 'Auto kontrast' i menuen 'Funktioner', og Juster kontrasten for hver kanal at etablere passende sort (~ 1.800) og hvid niveauer (10.000). Vælg 'Skift farver...' i menuen Funktioner for at bekræfte, at mCherry og GCaMP5 kanal Farvetildelinger er korrekt (figur 4A - C).<ol>
<li>Højreklik på tidsserier i fanen 'Sequence' og sæt den til 20 rammer/s og 1,25 µm/pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg 'Ratio' fra menuen 'Funktioner' og vælg "GCaMP5" til "A-kanal" og "mCherry" til 'Kanal B'. Klik på "Beregn" ved siden af 'Threshold' trække baggrund fra hver enkelt billedsekvens. Vælg "Anvend en regnbue LUT på forholdet kanal". Bemærk: For en optagelse med en gennemsnitlige baseline forholdet mellem 0,3 (lav Ca2 +) og en max forholdet mellem 2-3 (høj Ca2 +), en egnet opslagstabel ville være fra 0 (blå) til 1 (rød).</li>
	<li>Generere en intensitet moduleret forholdet kanal ved hjælp af mCherry kanalen (figur 4D). Intensitet moduleret forholdet kanal er en millioner af farver billede hvor forholdet farve er kortlagt på lysstyrken af mCherry kanalen.</li>
	<li>Opret en objekt-finding protokol ved at trække værktøjet 'Finde objekter ved hjælp af intensitet' til ruden 'Protokollen' under fanen 'Målinger'. Klik på "Tandhjul" for at indstille vinduet af mCherry intensitetsværdierne og finde objekter.<ol>
<li>Vælg intensitet værdier ≥ 2 standardafvigelser (SD) over baggrunden (f.eks., nedre grænse af ~ 2.500, øvre grænse 65,535). Kontroller den præsynaptiske endestation er opdaget og der 'automatisk opdatere feedback"er valgt i menuen målinger. Bemærk: Softwaren kan også identificere objekter ved deres standardafvigelse fra baggrunden ved hjælp af en tilhørende protokol «SD intensitet.» Dog hvis et specielt lyse objekt træder FOV, kan det dramatisk ændre den gennemsnitlige intensitet under disse timepoints, der påvirker de intensitet cutoffs bruges til at finde HSN. Denne variabilitet vil ikke opstå, hvis rå intensitetsværdier bruges til at finde objekter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilføje ekstra filtre målretning kun mCherry kanalen (størrelse, Max intensitet, etc.), hvis det er nødvendigt at udelukke uønskede genstande som hoved, hale, og tarm fluorescens. Vælg 'Gøre måling vare' fra menuen målinger og vælge «Alle Timepoints.» Bemærk: Dette vil effektuere den protokol, skrives alle målinger til en kommaseparerede værdier (.csv) fil, der skal eksporteres ved hjælp af kommandoen 'Eksporter' i menuen filer.</li>
	<li>Åbne exported.csv fil og kopiere tidspunkt, område (µm2), betyde (Ratio kanal), barycentrum X (µm) og barycentrum Y (µm) data i et nyt ark. Eksport a.csv filen uden kolonneoverskrifter. Ratiometric kvantitering software kan klassificere en celle af interesse som et eller flere objekter pr. tidspunkt.<ol>
<li>For at forene disse objekter, kan bruge et brugerdefineret script 'AnalzyeGCaMP_2017.m'. Bemærk: Scriptet også identificerer Ca2 + (ratio) toppe i data, og gemmer a.csv af deres timepoints, peak amplituder og peak bredder. Den genererer også PostScript-filer til raw og kommenteret forholdet spor. Med denne information fastsættes Ca2 + forbigående amplitude og indbyrdes forbigående interval.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilføje output X og Y barycentrum værdier fra hver fluorescens objekt til X og Y værdierne registreres af scriptet XY-scenen fra Bonsai. Bruge net XY position til at generere en orm locomotion spor og til at beregne celle fortrængning og hastighed, der ledsager forskellige adfærd stater31.</li>
	<li>Importere registrerede brightfield billeder til ImageJ som en virtuel stak. Anmærke æglægning begivenheder og andre adfærd. Sammenlign timing af disse begivenheder for Ca2 + toppe fra sporingen af forholdet.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at ingen konkurrerende interesser findes.

Transgener:
Fordi mCherry udtryk er blevet forbedret gennem codon-optimering og intron indsættelse (og mest tilgængelige GCaMP journalister har ikke), injicere ~ 4 x mængden af GCaMP5-udtrykker plasmid at sikre sammenlignelige niveauer af GCaMP5 fluorescens under stærk Ca 2 + transienter. Redning af lin-15(n765ts) -mutationen giver mulighed for facile inddrivelse af transgene dyr med minimal effekt på ægproduktion og andre adfærd35. Transgener skal integreres for at sikre ensartet udtryk og imaging forhold mellem forskellige dyr25. Valgbare markører herunder antibiotikaresistens36,37 og redning af temperatur-følsomme lethals38 bør også arbejde, men fordi ikke-transgene dyr er døde, bekræftelse af transgenet integration og homozygocitet er vanskeligere i forhold til markører, der præsenterer en synlig fænotype25. Dominerende markører, at forstyrre normale bevægelse og mindske fitness, såsom rol-6(dm), bør undgås39. Imaging i lite-1 er mutant baggrund vigtigt at reducere blå lys undslippe svar under imaging23,40,41. Yderligere mutation af gur-3, som fungerer parallelt til lite-1, kan yderligere minimere resterende adfærd og fysiologiske ændringer forårsaget af blå lys42. Bekvemt, gur-3, lite-1og lin-15 er alle beliggende på den højre halvdel af kromosom X, som bør forenkle opbygningen af nye stammer til Ca2 + billedbehandling og optogenetic eksperimenter.
Fordi eksponeringstider er kort og billeder er indsamlet på 20 Hz, skal GCaMP5 og mCherry signaler være lyse. Den mest sandsynlige forklaring for støjende Ca2 + optagelser er dim fluorescens forårsaget af svage reporter udtryk. Projektlederne bør også være rimeligt specifikke for regionen at blive afbildet. Fordi HSN cellen kroppen og synapser på vulval musklerne er i midten af kroppen, yderligere udtryk fra nlp-3 initiativtageren i hoved og hale er typisk uden for synsfeltet og kan udelukkes ved hjælp af ekstra filtre i den Ratiometric kvantitering software. For at sikre, at observeret ændringer i GCaMP5 fluorescens resultatet fra egentlige ændringer i intracellulære Ca2 +, kontrol transgener udtryk for normal god landbrugspraksis i stedet for GCaMP5 bør udarbejdes selvstændigt og analyseret26. Nyere Ca2 + journalister med forskellige Ca-2 + følsomheder, kinetik og farver har udvidet valg af billedbehandling værktøjer til rådighed, men hver ny reporter skal valideres ved hjælp af Ca2 +-ufølsom fluorescerende variant14 ,16.
Medier:
NGM plader til billeddannelse udarbejdes med høj kvalitet agar. Lavere kvalitet agar vil ikke opløses fuldstændigt ved autoklavering, forlader små partikler at scatter lys under imaging, og øge baggrunden fluorescens. Molekylær biologi klasse Agarosen kan bruges i stedet, men tilsatte mængde bør reduceres for at opretholde tilsvarende plade fasthed.
Sammenligninger med andre montering metoder:
Tidligere tilgange til billede aktivitet i æglægning adfærd kredsløb har brugt orme immobiliseret med lim til en Agarosen pad. Under disse betingelser, kredsløb aktivitet og æglægning adfærd er ikke stillede uden en reduktion i dyrkningsmedier osmolaritet8,10,44,45. Seneste tyder på, at flere orm adfærd er moduleret af locomotion stat, rejser spørgsmål om forholdet af celleaktivitet observeret i immobiliseret dyr til den, set i frit opfører dyr. Vi har for nylig vist, at æg-æglæggende kredsløb aktivitet uventet gradvis med locomotion26,27. På samme måde, opdelte Ca2 + signalering i RIA interneuron integrerer aktivitet fra sensoriske neuroner og hoved motoriske neuroner under fouragering bevægelser46. Defækation adfærd er også ledsaget af en præcis og stereotype ændring i bevægelse, der giver mulighed for dyr til at bevæge sig væk fra deres fouragering stedet før udvisning affald47. Sammen, tyder disse resultater på, at korte optagelser af kredsløb aktivitet fra immobiliseret dyr kan være fundamentalt forskellige fra dem, der opnås i frit opfører dyr.
Trods direkte under en coverslip, ligner den orm adfærd, set på standard NGM plader. Lagt æg vil gå at klække, og den lille mængde af mad deponeret tillader L1 larver til at vokse op til voksne (data ikke vist). Store agar bid størrelse giver mulighed for rimelige gasudveksling og modstår dehydrering, selv om alt for meget mad vil øge baggrunden fluorescens. Mens denne metode fungerer bedst for voksne, kan teknikken også bruges til billede L4 dyr. Tykkelsen af den vandige lag mellem luns og coverslip er imidlertid sådan, at mindre larver har svært ved at kravle, og ofte bliver fanget i kølvandet på en bevægende voksen.
En begrænsning af denne montering teknik er, at direkte mekaniske eller kemiske stimulation til præcise regioner af kroppen er vanskeligt. Den seneste udvikling i mønstrede belysning teknikker mulighed for separate excitation af hoved eller hale-udtrykt mikrobielle opsins med separat belysning og påvisning af GCaMP/mCherry fluorescens i midbody48,49. Som et resultat, kan det være muligt at løse problemet ved hjælp af optogenetic tilgange.
Sammenligninger til andre Ca 2 + Imaging tilgange:
Denne metode fungerer meget godt for registrering af ændringer i cytoplasmatisk Ca2 + fra enkelt, løst celler og deres synaptic regioner. Real-time, volumetriske billeddannelse af neuroner i hovedet har for nylig opnået ved hjælp af placeringen af cellekerner til celle identifikation og kvantificere ændringer i nucleoplasmic calcium50,51,52. Forholdet mellem nuklear og synaptic Ca2 + er fortsat uklart. Vores data tyder på den mest iøjnefaldende i HSN intracellulære Ca2 + sker ændringer på de præsynaptiske termini fra celle soma (figur 4D). De præsynaptiske termini HSN og VC neuroner er indlejret i det postsynaptiske vulval muskler26. Det er ikke klart, om der ville være tilstrækkelig opløsning i dimensionen Z engang med spinning disk eller lys ark teknikker til at tilskrive præsynaptiske Ca2 + signaler til bestemte celler uden at påberåbe på nogle måde somatiske calcium til celle identifikation . Ved hjælp af teknikkerne, der beskrives her, hver 10 min, to-kanals optagelse med 12,001 256 x 256 16-bit pixel TIFF billeder er ~ 4 GB. Forholdet og intensitet moduleret forholdet kanaler dobbelt filstørrelse til ~ 8 GB. En typisk eksperiment optagelse 10 dyr fra hver af to genotyper (wild-type og eksperimentel) genererer næsten 150 GB af primære data og kræver 20 h til at indsamle og analysere. Volumetrisk analyser med 10 Z skiver pr. tidspunkt ville kræve en størrelsesorden mere data og analytiske tid, forklarer, hvorfor så få sådanne undersøgelser er blevet gennemført.
Hardware:
Vi registrere og analysere billedsekvenser på dual processor arbejdsstationer med høj ydeevne (fx gaming) grafikkort, 64 GB RAM, og højtydende solid state drev (Se Tabel af materialer). Data skal lagres på netværksbaserede redundant array af uafhængige diske (RAID) og bakkes op i skyen på en off-site datacenter.
Vi anbefaler brug af high-power kollimeret lysdioder for pulserende fluorescens excitation over metalhalogen eller kviksølv-baseret lyskilder. Flere kommercielt tilgængelige multi-farve LED-systemer er tilgængelig. Mens nogle af disse LED-systemer har en højere upfront omkostninger, kan de har en lang levetid (> 20.000 h), samtidig excite fire eller flere forskellige fluorophores og tilbyde præcis tidsmæssige kontrol bruge en seriel og/eller TTL interface med lav latency (10-300 µs skifte tid). Udløser sikrer, at prøven er kun belyst når data er faktisk opkræves. Vi bruger typisk en 10 ms eksponering hver 50 ms (20% sats). Dette reducerer fototoksicitet og Bevægelsessløring under billedoptagelse, som tidligere rapporteret43.
Vi bruger sCMOS kameraer for deres hastighed og bred vifte af små, følsomme pixels. En EM-CCD kamera er en dyrere alternativ, men 'flor' effekter kan resultere i erobrede photoelectrons breder i tilstødende pixel. Ny back-belyste sCMOS kameraer har lignende lysfølsomhed af EM-CCD'er ved betydeligt reduceret pris. Uanset skal hvilken sensor bruges, GCaMP5 og mCherry kanalerne indhentes samtidig. Sekventiel opsamling i flytter orme vil føre til dårligt registreret billeder uegnet for ratiometric kvantificering. Dual channel imaging kan udføres på et enkelt kamera efter opdeling af kanaler ved hjælp af et image splitter (figur 2) eller ved hjælp af to identiske kameraer. Det dynamiske område af 16-bit-billeder anbefales over 8-bit billeder for nøjagtig ratiometric kvantitering. For brightfield billeder af ormen adfærd fange vi ved hjælp af en 1 i. 4.1 MP nær-infrarødt USB3 kamera til at indfange store 2 x 2 arkiveret lodret 1.024 x 1.024 8-bit billedsekvenser efter JPEG-komprimering. Den større FOV tilgængelig på nyere mikroskop modeller tillader en voksne orm til visualiseres på 20 x efter 0.63 x demagnification med kun let vignettering (figur 4E).
Vi anbefaler at bruge standard TTL spænding signaler til at synkronisere belysning og ramme fange. På grund af potentielle ventetid i forskellige softwareprogrammer anbefaler vi brugere konfigurere fluorescens kamera med udløser udgange som master med TTL udgange køre alle andre enheder. På denne måde, vil blive indsamlet brightfield og fase positionsoplysninger for hver Ca2 + måling.
Slids- eller resonant punkt-scanning Konfokal mikroskoper typisk findes i Konfokal fællesfaciliteter også giver fremragende ydeevne under ratiometric Ca2 + billeddannelse. Sådanne instrumenter kan bruges til at fange to eller flere fluorescens kanaler sammen med brightfield24. I dette tilfælde Konfokal pinhole bør åbnes til sin maksimale diameter, og en spektral detektor skal anvendes til at adskille GCaMP5, mCherry og infrarød brightfield signaler. Dette maksimerer lys indsamling fra en tyk (~ 20 µm) skive mens det stadig tillader afvisning af out-of-fokus fluorescens. En ulempe er den mindre FOV og flere begrænsninger for tilpasning af hardware og software.
Software:
De fleste producenter leverer og installerer deres kameraer og mikroskoper med leverandørejet software, herunder konfiguration af udløser input og output. Funktioner og ydeevne af denne software under optagelsen kan variere. Fordi hurtigt flytte orme kan være udfordrende for at spore, image display under optagelse skal være jævn og stabil på 20 Hz. For at forbedre ydeevnen, kan billedsekvenser blive midlertidigt gemt i RAM med behaviorally relevante delmængder gemt i slutningen af forsøget. Disse to-kanals sekvens billedfiler kan konverteres til det åbne billedet flowcytometri Standard format (.ics) importeres til Ratiometric kvantitering software. OME-TIFF er en nyere open source billedformat, selv om forskellige installationer kan være afskåret fra opspare TIFF billedsekvenser større end 4 GB.
Et centralt element i kvantitering rørledningen er generation af forholdet kanal og derefter en upartisk billede segmentering procedure ved hjælp af mCherry fluorescens for at finde celler af interesse. Fra hver fundne objekt, objektstørrelse, XY barycentrum position og minimum, mener og maksimale fluorescens intensitetsværdierne for hver kanal (herunder forholdet kanal) beregnes. Sammen, bruges disse værdier til at kvantificere ændringer i intracellulære Ca2 + på hvert tidspunkt i optagelsen. Objektet målinger for hvert tidspunkt eksporteres derefter som a.csv fil for efterfølgende analyser.
En stor begrænsning af protokollen beskrevet her er afhængigheden af omflytning data i forskellige former gennem et kludetæppe af softwareprodukter. En ekstra irritation er, at nogle af software er open source og gratis, mens andre er lukkede, dyre og ulige opdateret. En væsentlig forbedring ville være at bruge eller udvikle et stykke software (ideelt åbne-kilde), som giver tilsvarende niveauer af ydeevne og lethed i brug fra erhvervelse til analyse. Som nævnt ovenfor, fordobler ratiometric analyse både filstørrelse og tid kræves for at fuldføre et eksperiment. Generation af kamera-drivere, der kan integreres i brugerdefinerbare rammer som Bonsai ville tillade billeder og andre datastreams skal indsamles og analyseres i realtid, væsentligt forbedre overførselshastighed.
Fremtidsudsigter:
Mens vi typisk spore orm bevægelser manuelt, sporing af ormen barycentrum opdaget i infrarød lyse eller mørke felter optagelser bør give mulighed for yderligere billed oparbejdelse noder, der leverer lukket kredsløb justering fase holdning og automatiseret tracking (figur 3 og data ikke vist). Fleste af fluorescens optagelserne indhentet med denne metode er mørke og blottet for biologisk interessante data. På sensor eller real-time efter købet billedbehandling teknikker, beskære billedsekvenser til relevante objekter ville give mulighed for øget rumlige opløsning og fremskynde data analyse pipeline, især hvis yderligere Z-skiver er indsamlet for hver tidspunkt at visualisere aktivitet inden for alle præ- og postsynaptiske celler i kredsløbet.

Et centralt mål i neurovidenskab er at forstå, hvordan neuroner kommunikerer i kredsløb til at drive dyrs adfærd. Neurale kredsløb integrere en række forskellige sensoriske signaler for at ændre kredsløb aktivitet, dermed kørsel adfærdsmæssige ændringer nødvendige for dyr til at reagere på deres omgivelser. Fyrretræsnematoden, C. elegans, har en simpel nervesystemet med 302 neuroner hvis synaptiske forbindelser har været helt kortlagt1. Gener, der koder for proteiner involveret i neurotransmission bevares desuden meget mellem C. elegans og pattedyr2. Trods den anatomiske enkelheden i sit nervesystem viser det en kompleks repertoire af opbevaret adfærd giver en frugtbar platform for at forstå hvordan neuroner regulere adfærd3.
C. elegans er åbne over for anvendelsen af en bred vifte af tilgange såsom genmanipulation, laser celle ablation, elektrofysiologiske teknikker, såvel som i vivo optisk tænkelig4,5. Nylige undersøgelser har udarbejdet detaljerede kort over den store neurotransmitter signalering systemer i C. elegans herunder den kolinerge og GABAergic neuronal netværk. Disse undersøgelser, sammen med igangværende undersøgelser for at kortlægge udtryk for alle neuronal G-protein koblede receptorer placerer denne model i en unik position til at udnytte meget detaljerede strukturelle og funktionelle neuronal connectivity kort for fuldt ud at forstå, hvordan disse forskellige neurotransmittere signal gennem forskellige receptorer og tidshorisonter til at drive forskellige aspekter af dyrs adfærd.
For at studere dynamisk neuronal aktivitet mønstre i ethvert system, er en forudsætning at udvikle robuste metoder for at registrere aktivitet i individuelle neuroner eller hele kredsløb under opførsel. Særlig vigtigt er imødekommenhed af sådanne optiske tilgange til at visualisere præsynaptiske aktivitet, der driver synaptic vesikel fusion. Hurtig og meget følsomme fluorescerende indberettere af intracellulære Ca2 +, sammen med den øgede tilgængelighed af følsomme fotodetektor, har revolutioneret optagelse af celle og synaptic aktivitet i vågen, levende dyr under opførsel. Fordi et stort resultat af synaptic elektriske aktivitet er at regulere Ca2 + -kanaler, er ændringer i intracellulære Ca2 + tænkte trofast rapport behaviorally relevante ændringer i celleaktivitet.
I denne undersøgelse præsenterer vi en tilgang til at udføre ratiometric Ca2 + imaging i serotonerge HSN motoriske neuroner, der fremmer æglægning adfærd i C. elegans6,7. Denne tilgang bygger på tidligere bestræbelser på at visualisere Ca2 + aktivitet i C. elegans og æglægning kredsløbet under opførsel5,8,9,10,11 . Metoden giver mulighed for samtidig korrelere observerede ændringer i celle/kredsløb aktivitet med æglægning begivenheder, samt ændringer i animalsk bevægeapparatet tilstand. Selv om vi bruger denne fremgangsmåde til at undersøge aktivitet i voksne orme, viser upubliceret arbejde fra vores laboratorium denne tilgang kan udvides til at omfatte unge dyr på den fjerde larve (L4) fase samt. Det er sandsynligt, at aktiviteten af andre C. elegans neuroner, der fungerer i forskellige kredsløb og opførsel ligeledes tilgængelige med denne teknik. Anden nylig udviklet hurtigt Ca2 + indikatorer med ikke-overlappende emission spectra12,13,14,15,16, optogenetic værktøjer17 , og genetisk kodet optiske indikatorer membran spænding18, bør gøre det muligt for os at udføre gennemtrængende 'all-optisk' undersøgelser af hvordan ændringer i neurale kredsløb aktivitet drive forskellige adfærd stater.

ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans

Det er blevet stadig mere klart, at neurale kredsløb aktivitet i opfører dyr afviger betydeligt fra den, set i bedøvede eller immobiliseret dyr. Meget følsom, genetisk kodet fluorescerende indberettere af Ca2 + har revolutioneret optagelse af celle og synaptic aktivitet ved hjælp af ikke-invasive optisk tilgange i opfører dyr. Når det kombineres med genetiske og optogenetic teknikker, de molekylære mekanismer der modulere celle og kredsløb aktivitet under forskellige adfærd stater kan identificeres.
Her beskriver vi metoder for ratiometric Ca2 + billeddannelse af enkelt neuroner i frit opfører Caenorhabditis elegans orme. Vi demonstrere en enkel montering teknik, der forsigtigt overlays orme vokser på en standard Nematode vækst medier (NGM) agar blokere med et glas coverslip, tillader dyr registreres på høj opløsning under ubegrænset bevægelighed og adfærd. Med denne teknik bruger vi den følsomme Ca2 + reporter GCaMP5 til at registrere ændringer i intracellulære Ca2 + i den serotonerge hermafrodit specifikke neuroner (HSNs), som de kører æglægning adfærd. Co udtrykke mCherry, en Ca2 +-ufølsom fluorescerende proteiner, kan vi spore placeringen af HSN inden for ~ 1 µm og korrekt for udsving i fluorescens forårsaget af ændringer i fokus eller bevægelse. Samtidige, infrarød brightfield imaging giver mulighed for opførsel optagelse og animalske sporing ved hjælp af en motoriseret fase. Ved at integrere disse mikroskopiske teknikker og data-streams, kan vi registrere Ca2 + aktivitet i C. elegans æglægning kredsløb som det udvikler sig mellem inaktive og aktive adfærd stater over snese minutter.

Enkel montering teknik beskrevet her (figur 1) forårsager minimal ændringer af kultur miljøet L4 og voksen C. elegans knappanel high resolution optagelse i opfører dyr gennem et glas coverslip (figur 4). Synkronisering af LED lyskilder, fase controllere og kamera engagementer tillader for dataopsamling fra flere streams på 20 rammer/s for op til 1 h. mellemliggende forstørrelse (20 x) med høj numerisk blænde mål (0,7-0,8) giver god rumlige opløsning af synaptic regionen i æglægning adfærd kredsløb, selv med 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/pixel). Samtidige erhvervelse af GCaMP5 og mCherry fluorescens signaler (figur 4A, B) bruges til at generere en pixel for pixel forholdet kanal, der kompenserer for ændringer i flytning af dyr og fokus (figur 4D). HSN præsynaptiske terminus er så stor som mange neuronal celle organer i C. elegans, og ændringer i præsynaptiske HSN Ca2 + kan visualiseres tydeligt. Den store FOV af infrarød brightfield kameraet giver mulighed for orm skal spores manuelt under optagelse (figur 4E). For hvert dyr, kan ændringer i intracellulære Ca2 + være korreleret med adfærd tydeligt i brightfield imaging herunder æg løsladelse og ændringer i bevægelse (figur 4E).
Kvantitering af HSN Ca2 + og hurtighed bekræfter, at orme ændre deres bevægelse som de overgang til æglægning adfærd. Der er betydelige forskelle i orm hastighed før, under og efter æglægning aktive tilstand (figur 5A). Dette er ikke forårsaget af støj iboende imaging eller tracking system. Zoome ind på en æglægning begivenhed, vi observerer en stærk forandring i GCaMP5 fluorescens (ΔF/F) før hændelsen æglægning, mens mCherry Fluorescens er relativt uændret (figur 5B). Målt ændringer i GCaMP5:mCherry ratio (ΔR/R) klart viser en HSN Ca2 + forbigående ~ 4 s forud for æg release (figur 5B). Sammenfaldende med vulval muskelsammentrækning, en klar opbremsning af ormen locomotion opstår, ender med æg frigive. Tidligere resultater har vist, at de kolinerge VC motoriske neuroner, som innerveres af HSNs, viser peak aktivitet under stærk vulval muskelsammentrækninger og under æg løsladelse 8,10,27. Vi har også vist, at optogenetic aktivering af VC neuroner drev en umiddelbar opbremsning bevægelsesevne, antyder, at VC neuroner kan aktiveres af vulval muskelsammentrækning, derved opbremsning bevægelsesevne indtil modtage feedback om æg løsladelse27 .
Imaging og tracking system beskrevet giver mulighed for visualisering af den rumlige organisering af æglægning adfærd (figur 5C). Som tidligere vist, orme Angiv vedvarende kører fremad bevægelsesevne lige før aktiv tilstand32. Orme tilbringe størstedelen af deres tid på at fouragere på bakterier i midten af agar luns. Før indrejse i den aktive tilstand flytte orme fra den mad, som er sammenfaldende med udseendet af sjældne HSN Ca2 + transienter. HSN aktivitet derefter overgange i burst fyring, med flere tætliggende HSN Ca2 + transienter, der opretholder æglægning begivenheder. Ormene derefter ofte vende rundt, genoptage fremadrettet bevægelse, og lægger æg på vej tilbage mod deres udgangsposition i nærheden af OP50 bakterier. Vi formoder, at ændringer i lokale O2 og/eller CO2 koncentration kan påvirke hvor ormene beslutte at lægge æg33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> Figur 1. C. elegans montering teknik for højopløselig billeddannelse af æglægning kredsløb aktivitet og opførsel. Top, den endelige mount fra siden. Bunden, den endelige mount som ses gennem bunden af den store coverslip. Pilene angiver, OP50 bakteriel mad, C. elegans orme og æg, klemt inde mellem NGM agar luns og store 24 mm x 60 mm coverslip. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> Figur 2 . Widefield ratiometric Ca2 + imaging og adfærd optagelse på en inverteret epifluorescensmikroskop. (A) orm holdning og adfærd er fanget i brightfield via en 20 x (0,8 NA) Plan-Apochromat mål ved hjælp af infrarød (750-790 nm) lys (lilla pile) udsendes fra en halogenlampe gennem NGM luns. En joystick og motoriserede Stadium controller bruges til at opretholde orm i synsfelt under optagelsen. Fase position (Δx, Δy) er sendt hen til Datamaskine af den serielle port. GCaMP5 og mCherry proteiner udtrykt i ormen er begejstrede ved hjælp af 470 nm (blå pile) og 590 nm (gule pile) Light Emitting dioder (LED). Udsendes GCaMP5 (grønne pile) og mCherry (orange pil) Fluorescens sammen med det infrarøde lys passerer gennem en multi-band dichroic spejl (Se Tabel af materialer). En 80/20 stråledeler sender 20% af lys gennem en 0.63 x demagnifer til opsamling på en infrarød-følsom CMOS kamera (lilla pil). De resterende 80% af lyset sendes gennem mikroskop side-port til en image splitter, der adskiller GCaMP5 og mCherry fluorescens på separate halvdele af et sCMOS kamera samtidig at fjerne infrarød brightfield lys. Data fra begge kameraer, overføres til en PC via USB3 kabler. Trigger-porte fra fluorescens sCMOS kamera (blå) bruges til at sende + 5V TTL udløser til LED belysning system, infrarød brightfield CMOS kamera og Digital erhvervelse enhed (DAQ). (B) udløser 3 output TTL signaler registreres af DAQ på digital pin #8 og sendes til pc'en via en USB-forbindelse. Disse digitale indgange udløse en ' hvor XY' seriel kommando fra en Bonsai software script (XY-fase-endelig), som læser X og Y stage holdning for hver GCaMP5/mCherry fluorescens/infrarød billed fanget. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> Figur 3 : Layout af Bonsai serie-fase kommunikation script XY-fase-finalen. Top DigitalInput node (pink) læser TTL udløser kommer ind pin #8 af DAQ. For hver positiv TTL spænding (grøn), DAQ gør et timestamp (blå) og skriver en 'Hvor XY?' streng (pink) til fase controlleren via den serielle port (grå). Den SerialStringRead node (pink) læser X og Y koordinere svaret fra scenen controller. Denne streng er derefter omdannes til mikron og opdelt i X og Y stage koordinater. Endelig, disse fire vandløb er kombineret med en zip node (blå) og en fire column.csv fil er skrevet: ramme greve af TTL signaler modtages (Range node, pink), X og Y-koordinaterne og intervallet mellem efterfølgende timepoints (typisk ~ 50 ms når optagelse på 20 Hz). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> Figur 4 : Repræsentant micrographs af HSN fluorescens og hele dyr brightfield under æglægning opførsel. (En-D) Samtidige ratiometric billeddannelse af GCaMP5 og mCherry fluorescens i HSNs lige inden ægget frigivelse. HSN præsynaptiske termini er angivet med pilespidser. (C) flette af GCaMP5 og mCherry fluorescens. (D) intensitet-moduleret GCaMP5:mCherry forhold; en høj ratio (rød) angiver høje intracellulære Ca2 + på den præsynaptiske terminus. (E) Brightfield billede for hele orm lige efter at æggene er lagt. Pilespidser angive de anteriore og posteriore halvdele af vulva hvorfra æg er lagt. Skalalinjen for alle billeder er 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> Figur 5 : Optagelse af HSN Ca2 + og bevægelse hastighed under æglægning opførsel. (A) spor af GCaMP5:mCherry ratio ændringer som reaktion på intracellulære Ca2 + transienter (ΔR/R, red) sammen med øjeblikkelige orm hastighed (µm/s, blå). Æglægning begivenheder er angivet med pilespidser. (B) spor HSN GCaMP5 fluorescens (grøn, ΔF/F), mCherry fluorescens (red; ΔF/F), GCaMP5:mCherry fluorescens ratio (black; ΔR/R) og ormen hastighed (blå) omkring tidspunktet for æg løsladelse. (C) rumlige organisering af æglægning og locomotion adfærd under hele 10-min optagelsen. Ormen spor blev indhentet fra de XY fase oplysninger, som blev tilføjet til barycentrum stilling HSN fremstillet af mCherry fluorescens optagelse. Timingen af HSN transienter (røde cirkler), æglægning begivenheder (sort pilespidser), og start og slutningen af optagelsen (grøn og blå diamanter) er angivet. Skalalinjen er 1 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Denne protokol beskriver brugen af genetisk kodet Ca2 + journalister til at registrere ændringer i neurale aktivitet i opfører sig Caenorhabditis elegans orme.

Ratiometric Calcium billeddannelse af enkelte neuroner i opfører sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Storstilet Registrering af neuroner ved Flytbare Silicon Probes at opføre sig Gnavere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Langsigtet Calcium Imaging af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Vellykket In vivo Calcium Imaging med en Head-Mount Miniaturized Mikroskop i Amygdala af frit opfører Mus

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Billeddannelse Dendritiske rygsøjler i Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In vivo Vurdering af Microtubule Dynamics og Orientering i Caenorhabditis elegans Neuroner

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Live Imaging af Mitokondrie Glutathione Redox tilstand i primære neuroner ved hjælp af en ratiometrisk indikator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Undersøgelse af virkningen af pesticider på Caenorhabditis elegans neuroner

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...