Name: ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Эта работа финансировалась грант от NINDS на КМК (R01 NS086932). LMN была поддержана грант от программе КПУР NIGMS (R25 GM076419). Штаммы используемые в данном исследовании C. elegans центр генетики, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Мы благодарим Джеймса Бейкера и Мейсон Кляйна за полезные дискуссии.

Авторы заявляют, что существуют не конкурирующие интересы.

Центральная цель неврологии — понять, как Нейроны общаются в цепи для привода поведение животных. Нейронных цепей интегрировать широкий спектр разнообразных сенсорные сигналы с целью изменения схемы активности, таким образом управляя поведенческие изменения, необходимые для животных ответить на их условиях. Нематода, C. elegans, имеет простой нервной системы с 302 нейронов, чьи синаптических связей были полностью сопоставленных1. Кроме того гены, которые кодируют белки, участвующие в синапсах высоко консервируют между2 C. elegans и млекопитающих. Несмотря на анатомические простоту его нервной системы он отображает комплекс репертуар поведения сохраняется, предоставление плодородной платформы, чтобы понять, как нейроны регулировать поведение3.
C. elegans поддаются применению широкого круга подходов, таких как генетические манипуляции, лазерной абляции клеток, электрофизиологические методы, а также в vivo оптических изображений4,5. Недавние исследования подготовили подробные карты крупных нейромедиатора, сигнализации систем в C. elegans включая холинэргические и ГАМК нейронных сетей. Эти исследования, а также текущих исследований для сопоставления выражение всех нейронов рецепторов G-протеин место этой модели в уникальном положении, чтобы использовать весьма подробные структурные и функциональные нейрональных подключения карты в полной мере понять как эти различных нейромедиаторов сигнал через различные рецепторы и сроками для привода различных аспектов поведения животных.
С целью изучения моделей динамической активности нейронов в любой системе, необходимым условием является развитие надежной методологии для записи деятельности в отдельных нейронов или всей цепи во время поведения. Особенно важное значение имеет ответственность таких оптических подходов к визуализации Пресинаптический активность, что диски синтеза синаптических пузырьков. Быстро и чувствительный флуоресцентные Репортеры внутриклеточных Ca2 +, а также повышение доступности чувствительные фотодетекторы, революционизировали запись ячейки и синаптической активности в awake, живых животных во время поведение. Потому, что главным результатом синаптического электрической активности заключается в регулировании Ca2 + каналы, изменения в внутриклеточного Ca2 + считается добросовестно доклад поведенчески соответствующие изменения в активности клеток.
В этом исследовании мы представляем подход для выполнения ratiometric Ca2 + изображений в серотонинергической HSN двигательных нейронов, которые способствуют яйцекладка поведение в C. elegans6,7. Этот подход опирается на предыдущие усилия для визуализации Ca2 + активности в C. elegans и яйцекладка контура во время поведения5,8,9,10,11 . Метод позволяет соотнести одновременно наблюдаемые изменения в активности клеток/цепи с яйцекладка события, а также изменения в состоянии животных опорно. Хотя мы используем этот подход для изучения деятельности взрослых червей, неопубликованные работы от нашей лаборатории показывает, что этот подход может быть расширен для несовершеннолетних животных на четвертый личиночной стадии (L4) также. Вполне вероятно, что деятельность других C. elegans нейронов, которые функционируют в различных схем и поведение должно быть аналогичным образом доступны с этой техникой. Другие недавно разработал быстрый Ca2 + индикаторы с non перекроя выбросов спектры12,13,14,15,16, optogenetic инструменты17 и генетически закодированный оптических показателей мембраны напряжения18, должен позволить нам выполнять проникающая «все оптические» расследования как изменения в активности нейронные цепи привода различных поведение государств.

ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans

Она становится все более очевидным, что нейронные цепи деятельность в себя животных существенно отличается от видели на наркотизированных или подвижности животных. Высокочувствительный, генетически закодированный флуоресцентные Репортеры Ca2 + революционизировали записи ячейки и синаптической активности с помощью неинвазивных оптических подходов в поведения животных. При сочетании с генетические и молекулярные механизмы, optogenetic методы, модулируют активность клеток и цепи во время государства могут быть определены по-разному.
Здесь мы описываем методы для ratiometric Ca2 + изображений одного нейронов в свободно себя червей Caenorhabditis elegans . Мы демонстрируем простой монтаж технику, которая мягко оверлеи червей, растущих на стандартных медиа роста нематода (НГМ) агар блок с coverslip стекла, позволяя животных регистрируется в с высоким разрешением во время неограниченное движение и поведение. С этой техникой мы используем чувствительных Ca2 + репортер GCaMP5 для записи изменений в внутриклеточного Ca2 + в серотонинергической гермафродита определенных нейронов (HSNs), как они управляют яйцекладка поведение. Выражением совместного mCherry, Ca2 +-нечувствительным флуоресцентный белок, мы можем отслеживать положение HSN в течение ~ 1 мкм и правильным для колебания в флуоресцировании, вызванных изменениями в фокус или движения. Синхронный, инфракрасный brightfield изображения позволяет для записи поведение и животных отслеживания с помощью моторизованного столика. Интегрируя эти микроскопические методы и потоки данных, мы можем записать Ca2 + деятельность в C. elegans яйцекладка цепи мере между государствами активные и неактивные поведение более десятки минут.

Простой монтаж метод, описанный здесь (рис. 1) вызывает минимальные изменения в среде культуры L4 и взрослых C. elegans обеспечивая высокое разрешение записи в себя животных через стекло coverslip (рис. 4). Синхронизация Светодиодных источников света, этап контроллеров и экспозиции камеры позволяет для сбора данных из нескольких потоков на 20 кадров/сек до 1 ч. среднего масштаба (20 x) с высокой числовая апертура целей (0,7-0,8) обеспечивает хорошее пространственное разрешение синаптических региона яйцекладка поведение цепи, даже с 4 x 4 пикселя биннинга (1,25 мкм/пиксель). Одновременное приобретение сигналов флуоресценции GCaMP5 и mCherry (рис. 4A, B) используется для создания канала пиксель в пиксель соотношение, который компенсирует изменения в движение животных и фокус (рис. 4D). HSN Пресинаптический конечной как большой, как многие нейрональных клеток органов в C. elegansи изменения в пресинаптическом HSN Ca2 + может четко визуализируется. Большой ПЗ камеры инфракрасного brightfield позволяет червю вручную отслеживаться во время записи (Рисунок 4E). Для каждого животного изменения в внутриклеточного Ca2 + может быть соотнесена с поведение проявляется в brightfield изображений, включая выпуск яйцо и изменения в двигательный аппарат (Рисунок 4E).
Количественный HSN Ca2 + и скорость подтверждает, что черви изменить их передвижения, как они перехода к поведение яйцекладки. Существуют значительные различия в скорости червя до, во время и после откладки активное состояние (рис. 5A). Это не вызвано шума присущего изображений или системы отслеживания. Масштабирование в одно событие яйцекладки, мы наблюдаем сильные изменения в флуоресцировании (ΔF/F) GCaMP5 до яйцекладки события при mCherry флуоресценции относительно неизменными (рис. 5B). Измеренные изменения в соотношении GCaMP5:mCherry (ΔR/R) ясно показывают HSN Ca2 + переходных ~ 4 s перед яйцо релиз (рис. 5B). Совпадающих с вульвы мышц, ясно замедление червь локомоции происходит, что концы с яйцом освобождения. Предыдущие результаты показали, что холинергических VC двигательных нейронов, которые иннервируются HSNs, показать пик активности во время схватки сильные мышцы вульвы и яйцо релиз 8,10,27. Мы также показали, что optogenetic активации нейронов VC диски немедленное замедления передвижения, предполагая, что VC нейроны могут активироваться вульвы мышц, тем самым замедляя передвижения до получения обратной связи яйцо релиз27 .
Изображений и описывается система отслеживания позволяет визуализации пространственной организации яйцекладка поведения (рис. 5C). Как уже показано, червей введите устойчивый бежит вперед локомоции накануне в активное состояние32. Черви тратят большую часть своего времени нагула на бактерии в центре кусок агар. До вступления в активное состояние черви отказаться от пищи, которая совпадает с появлением редко HSN Ca2 + транзиентов. HSN активность, затем переходит в всплеска стрельбе, с нескольких близко расположенных HSN Ca2 + транзиентов, которые поддерживают яйцекладка события. Черви затем часто развернуться, возобновить вперед локомоции и откладывают яйца на пути обратно к их начальную позицию вблизи ОР50 бактерий. Мы предполагаем, что изменения в местных O2 и/или концентрации CO2 может влиять на где черви решили заложить яйца33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> Рисунок 1. C. elegans монтажная техника для изображений с высоким разрешением яйцекладка цепи деятельности и поведения. Топ, окончательный горе со стороны. Внизу, окончательный горе как просмотренные через нижнюю часть большой coverslip. Стрелки показывают, ОР50 бактериальных продуктов питания, черви нематоды Caenorhabditis elegans и яйца, зажатой между кусок агар НГМ и coverslip большой 24 x 60 мм. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> Рисунок 2 . Widefield ratiometric Ca2 + изображений и поведение, запись на Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа. (A) червь позицию и поведение фиксируется в brightfield через 20 x (0.8 NA) план-Апохромат цель с помощью инфракрасного (750-790 нм) свет (фиолетовые стрелки), излучаемый галогенная лампа через NGM кусок. Джойстик и моторизованных стадии контроллер используется для поддержания червя в поле зрения во время записи. Стадии позиции (Δx, Δy) отправляется на ПК, последовательный порт. GCaMP5 и mCherry белки, выраженные в червь рады с помощью 470 Нм (синие стрелки) и 590 Нм (Желтые стрелки) светодиодами диоды (LED). Излучаемого GCaMP5 (зеленые стрелки) и mCherry (оранжевые стрелки) флуоресценции наряду с инфракрасный свет проходит через многополосный дихроичное зеркало (см. Таблицу материалы). 80/20 splitter луча посылает 20% света через 0,63 x demagnifer для захвата на ИК чувствительных CMOS камера (фиолетовые стрелки). Оставшиеся 80% света отправляется через сторону порт микроскопа изображения разделителя, который отделяет GCaMP5 и mCherry флуоресцирования на отдельные половинки sCMOS камеры во время удаления brightfield инфракрасный свет. Данные из обеих камер передаются на ПК через кабели USB3. Порты триггера с флуоресценцией sCMOS камеры (синий) используются для отправки + 5В TTL запускает светодиодные системы освещения, камеры CMOS ИК brightfield и цифровой приобретения устройства (DAQ). (B) триггера 3 выходные сигналы TTL определяется DAQ на цифровой pin #8 и отправлены на компьютер через USB-соединение. Эти цифровые входы триггер ' где XY' серийный команду из сценария программного обеспечения Бонсай (XY-этап финал), который считывает X и Y этап позиции для каждого GCaMP5/mCherry флуоресценции и инфракрасного изображения захвачен. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> Рисунок 3 : Макет бонсай серийный стадия общения скрипта XY-этап финал. Топ DigitalInput узел (розовый) читает TTL триггеры, приходя в контакт #8 DAQ. Для каждого положительного напряжения TTL (зеленый) DAQ делает отметка (синий) и записывает строку «Где XY?» (розовый) на этапе контроллер через последовательный порт (серый). Узел SerialStringRead (розовый) читает ответ от стадии контроллера координат X и Y. Затем эта строка преобразуется в мкм и разделены на X и Y координаты этап. Наконец, эти четыре потоков объединяются с помощью zip узел (синий) и четыре column.csv файл записывается: рамка счетчик TTL сигналы (узел диапазона, розовый), координаты X и Y и интервал между последующими timepoints (обычно ~ 50 мс при запись при 20 Гц). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> Рисунок 4 : Представитель микроскопии флуоресцирования HSN и весь животных brightfield во время откладки поведение. (DA–) Одновременно ratiometric изображений GCaMP5 и mCherry флуоресценции в HSNs просто до выхода яйцеклетки. HSN Пресинаптический Термини указаны с наконечниками. (C) объединить GCaMP5 и mCherry флуоресценции. (D) модуляции интенсивности GCaMP5:mCherry отношение; высокий коэффициент (красный) указывает высоких внутриклеточных Ca2 + в пресинаптическом terminus. (E) Brightfield изображение всего червя только после того, как были заложены яйца. Стрелки указывают на передней и задней половинок вульвы, с которого яйца откладываются. Линейки для всех изображений является 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> Рисунок 5 : Запись HSN Ca2 + и передвижения скорости во время откладки поведение. (A) следы GCaMP5:mCherry коэффициент изменения в ответ на внутриклеточные Ca2 + транзиентов (ΔR/R; красный) наряду с мгновенной червь скорость (микрон/сек, синий). Яйцекладка события обозначаются наконечники стрел. (B) следы флуоресценции HSN GCaMP5 (зеленый; ΔF/F), mCherry флуоресценции (красный; ΔF/F), соотношение флуоресценции GCaMP5:mCherry (черный; ΔR/R) и червь скорость (синий) вокруг момента выхода яйцеклетки. (C) пространственной организации яйцекладки и локомоции поведения во время всей записи 10-мин. Трек червь был получен от XY этапе информацию, которая была добавлена на центроид позицию HSN, полученные из записи флуоресценции mCherry. Указаны сроки HSN транзиентов (красные круги), яйцекладка события (черные стрелки), начала и конца записи (зеленый и синий алмазы). Линейки-1 мм. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Этот протокол описывает использование генетически закодированный Ca2 + репортеров, чтобы записывать изменения в нервной деятельности в себя червей Caenorhabditis elegans .

Ratiometric кальция изображений отдельных нейронов в себя Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Крупномасштабные Запись нейронов Зонды Движимое кремния в Поведение грызунов

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Агарозные микрокамеры для долгосрочного Кальций изображений<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Успешная визуализация кальция In vivo с миниатюрным микроскопом Head-Mount в миндале свободно ведя себя мышью

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Визуализация дендритных шипов при Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In vivo Оценка динамики и ориентации микротрубочек в нейронах Caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Живая визуализация окислительно-восстановительного состояния митохондриального глутатиона в первичных нейронах с использованием ратиометрического индикатора

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Изучение влияния пестицидов на нейроны Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...