Name: ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una subvención de NINDS de KMC (R01 NS086932). LMN fue apoyado por una subvención del programa NIGMS IMSD (R25 GM076419). Las cepas utilizadas en este estudio C. elegans centro de genética, que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Agradecemos a James Baker y Mason Klein para discusiones útiles.

1. cepas, de la cultura los medios de comunicación y montaje de animales
<ol><li>Crecer gusanos C. elegans a 20 ° C en placas de agar medio de crecimiento de nematodos (NGM) de 60 mm estándar con OP50 e. coli bacterias alimentos19.</li>
	<li>Preparar dos plásmidos para cada promotor de célula-específica de interés: una expresión de GCaMP5 de registro intracelular Ca2 +y la segunda, expresión de mCherry para permitir la cuantificación proporcionales de los cambios de fluorescencia de GCaMP5 de conducción de conducción y simplificar la medición y la búsqueda de objeto. Nota: la proyección de imagen radiométrica GCaMP5:mCherry corrige las fluctuaciones en la fluorescencia GCaMP5 que resultan de cambios en el movimiento animal y el enfoque, los cambios no reales en intracelular Ca2 +.</li>
	<li>Inyectar plásmidos GCaMP5 y mCherry expresar junto con el plásmido de marcador pL15EK rescate visibles en las gónadas de animales mutantes lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X de LX1832 y recuperar no Muv lin-15(+) animales expresando GCaMP5 y mCherry de un transgen alta-copia20,21,22. Utilizar el fondo mutante lite-1 para reducir el comportamiento de evitación de la luz azul23,24.</li>
	<li>Integración de los transgenes a los cromosomas mosaicism de reducir y simplificar la generación de estirpes mutantes compuesto25. Nota: La cepa LX2004 descrita aquí lleva un integrado alta copia del transgén que expresa GCaMP5 y mCherry de las HSNs de la promotora de PNL-3 (véase Tabla de materiales)26,27, 28 , 29. el promotor de PNL-3 fue encontrado para coche fuerte expresión en las HSNs L4 finales y animales adultos sin causando defectos importantes en el desarrollo de HSN o comportamiento de puesta de huevos en comparación con otros promotores probado (e.g.,tph-1, EGL-6y unc-86). Esta variedad y otros que expresan GCaMP5 y mCherry en las neuronas motoras de la médula ventral (VC), músculos vulvares y células neuroendocrinas uv1 están disponibles desde el centro de genética de Caenorhabditis y detalles de su construcción se han descrito 27.</li>
	<li>Aplicar OP50 alimentaria bacteriana de una placa de agar sembrada de NGM en la parte inferior de un gusano platino recoger y utilizar para transferir ~ 20 animales L4 LX2004 finales que expresan GCaMP5 y mCherry de las HSNs de la promotora de PNL-3 . Asegúrese de que la vulva en desarrollo aparece en un estereomicroscopio como punto claro oscuro rodeado por una media luna blanca. Incubar a 20 ° C durante 24-40 h los animales.</li>
	<li>Después de la incubación, se aplican OP50 a la selección y transferencia de ~ 3 de los gusanos a una placa NGM no sembrada, dejando una pequeña cantidad de comida detrás de los gusanos que se alimentan durante proyección de imagen. Asegurar una alimentación suficiente, como escasez de alimentos bacteriana animará a los gusanos a vagar lejos del centro de la placa mientras que demasiada cantidad de alimentos aumentará la fluorescencia del fondo y provocar hipoxia.</li>
	<li>Espátula plana redondeada para cortar un ~ 20 mm x 20 m pedazo de la placa con los gusanos y transferir el campo boca abajo en el centro de un cubreobjetos limpio 24 x 60 mm #1.5 (figura 1). Iniciar la aplicación de un lado para evitar que las burbujas están atrapados bajo el cubreobjetos y que interfieren con la proyección de imagen. Aplica un cubreobjetos de 22 x 22 mm #1 a la parte superior de la parte para reducir la evaporación o se peguen.</li>
</ol>2. hardware y configuración de instrumentación
<ol><li>Lugar las etapas, gusanos transgénicos en el escenario de un microscopio invertido con una ≥ 0,7 numérica apertura Plan-Apochromat 20 x objetivo motorizado XY fase controlable con un joystick, un divisor de imagen y fluorescencia filtros para GCaMP5 simultánea y mCherry excitación y emisión, cámaras para el brightfield fluorescencia e infrarrojo la proyección de imagen y un sistema de iluminación de diodos emisores de luz (LED)-triggerable (figura 2A). Nota: Un divisor de viga de 80/20 envía 80% de la señal de imagen a la cámara de fluorescencia y un 20% a la cámara de brightfield. También se puede utilizar un microscopio vertical, pero el pedazo NGM debe colocarse entre un vidrio portaobjetos y el cubreobjetos grande en este caso.<ol>
<li>Utilice los oculares binoculares para seleccionar un gusano para la proyección de imagen. Cuando se selecciona un animal, deslice el filtro de infrarrojos en lugar sobre el condensador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lógica del transistor-transistor (TTL) desencadena<ol>
<li>Conecte los cables coaxiales de cada una de las tres líneas de salida de disparo TTL en la cámara de fluorescencia. Conecte la salida primera a la entrada BNC #3 del sistema de iluminación LED.</li>
		<li>Conectar la salida del segundo a un adaptador BNC 'plátano' con verde y marrón cables desde el conector de 8 pines GPIO a GPIO de entrada #3 (pin 4) y tierra (pin 5) de la cámara infrarroja, respectivamente.</li>
		<li>Conectar la salida tercera a un adaptador BNC 'plátano' con los cables de puente a la entrada digital #8 y en el dispositivo de adquisición digital (figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispositivo digital de adquisición (DAQ)<ol>
<li>El tablero del microcontrolador DAQ (véase Tabla de materiales) a la PC mediante un cable USB. Actualizar el firmware con el estándar una firmado el protocolo (véase Tabla de materiales) y configurar el puerto USB para comunicarse a 57600 baudios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LED<ol>
<li>Ejecutar el software de controlador de LED (véase Tabla de materiales). Cambiar el modo de disparador de 'Continuo 'Privada' y seleccione el canal gatillo 3' para los LEDs nm 470 y 590.</li>
		<li>Encienda y entre energía del LED para cada LED (p. ej., conjunto el 470 nm LED al 20% y los 590 nm LED 40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar la etapa de la serie comunicación script 'XY-fase-final' en Bonsai (véase Tabla de materiales)30. Haga clic en el nodo 'CsvWriter' gris y seleccione una carpeta para guardar las grabaciones X y Y la etapa de información (figura 3). Presione la flecha verde en la barra de herramientas para inicializar la DAQ. Nota: El script comenzará a grabar la posición X e Y cuando la cámara de fluorescencia envía una señal TTL. Este script salidas de cuatro columnas de datos: número, posición (μm), Y posición (μm) Y el intervalo entre fotogramas (s) de cuadro.</li>
	<li>En la cámara infrarroja, software de grabación (véase Tabla de materiales) bajo 'Modos de vídeo personalizado' seleccionar "Modo 1" (2 x 2 binning; 1.024 x 1.024 píxeles), y "Pixel formato primas 8". Bajo ' gatillo / Strobe', la línea de entrada de disparo (GPIO) la posición "3", la polaridad "Alto", el "modo" a "14". Seleccionar 'Activar' para detener la adquisición de marco hasta que se reciba una señal de disparo TTL.<ol>
<li>Dejando la ventana abierta, haga clic en el botón rojo "Grabar" en la barra de herramientas de la vista principal de la cámara. Seleccione la carpeta de secuencias de imágenes ser salvos. Seleccione modo de grabación de 'Tampón' y 'Imágenes' de guardar en formato JPEG. Haga clic en "Iniciar grabación" para inicializar la adquisición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Divisor de imagen y cámara de fluorescencia Nota: GCaMP5 y mCherry canales de fluorescencia deben recogerse simultáneamente para asegurar el registro de imagen adecuada para la cuantificación de radiométrica. Un divisor de imagen permite la adquisición de dos canales de la fluorescencia GCaMP5 y mCherry sobre un sensor.<ol>
<li>En la pestaña de 'Captura' del software de adquisición de imagen (véase Tabla de materiales), tiempo de exposición determinado a 10 ms, binning a x 4 y profundidad de la imagen a 16 bits. Seleccione una submatriz de cámara centrada de 512 pixeles de ancho por 256 píxeles de alto. Haga clic en 'Mostrar opciones de disparo de salida' y establecer todos los desencadenadores a 'Positiva'. Nota: El DAQ ocasionalmente puede faltar disparadores TTL si son 10 ms o menos.</li>
		<li>Asegúrese de que 'Gatillo 1' y 'Gatillo 2' son 'Exposición' mientras que 'Gatillo 3' es a 'Programables' con un período de 25 ms. en la pestaña de 'Secuencia', seleccione 'Time Lapse' con un 'campo Delay1' de 50 ms a recoger imágenes en 20 Hz. Seleccione 'guardar en Buffer temporal.'</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ganancia e intensidad del laser durante la proyección de imagen confocal canal tres<ol>
<li>Ajuste la ganancia de la PMT para que la fluorescencia de fondo está a un nivel justo por encima del mínimo (nivel de negro). Aumentar potencia de láser (verde) de 561 nm hasta un solo píxel de 12 bits o 16 bits saturado se observa en la terminal presináptica en el canal mCherry.</li>
		<li>Ajustar intensidad de láser (azul) de 488 nm para que GCaMP5 su fluorescencia es apenas visible en la terminal presináptica sobre fondo. Este ajuste bajo impide la saturación de los píxeles de GCaMP5 cuando la fluorescencia aumenta en respuesta a la fuerte Ca2 + transitorios. Abrir el agujero de alfiler confocal completamente para maximizar la captura de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. radiométrica Ca2 + proyección de imagen y grabación de comportamiento
<ol><li>En la pestaña de 'Secuencia' en el software de adquisición de fluorescencia, haga clic en "Start" para comenzar a grabar. Pista el gusano con el joystick, conservando las celdas seleccionadas y las sinapsis de interés en foco y en el centro del campo de visión (FOV). Haga clic en el botón de 'Estadísticas' en la ventana de histograma para mostrar estadísticas de píxeles de cada canal.</li>
	<li>Ajustar la potencia de LED para garantizar una máxima píxel mCherry fluorescencia en la terminal presináptica del ≥ 8.000 cuentas (~ 4.000 fotoelectrones), dando un ~ rango dinámico de 12 bits sobre el fondo (~ 100 fotoelectrones). Señales de GCaMP5 en la terminal presináptica durante el descanso (bajo) Ca2 + deben ser alrededor de ~ 2.500 cuenta - apenas visible sobre el fondo.</li>
	<li>Expediente hasta que se alcanza un estado activo de puesta de huevos; Esto ocurre típicamente cada 20-30 min en un tipo gusano7. Guardar un subconjunto de 10 minutos (12.001 Marcos), 6.000 marcos antes y después de la primera puesta de huevos (marco 6.001). Asegúrese de mantener el mismo subconjunto de brightfield imágenes de gusano comportamiento y puntos de tiempo de posición XY, o la precisa sincronización de flujos de datos se perderá.</li>
	<li>Utilizar ImageJ y el plugin BioFormats (véase Tabla de materiales) para convertir secuencias de imágenes a formato de imagen estándar de citometría (.ics) que pueden ser importado en el software de cuantificación proporcionales.</li>
</ol>4. segmentación y análisis cuantitativo de la imagen
<ol><li>Importar secuencias de imágenes en el software de cuantificación proporcionales (véase Tabla de materiales). Haga clic en 'Auto contraste' en el menú 'Herramientas' y ajustar el contraste de cada canal para establecer el apropiado negro (~ 1.800) y niveles (10.000) de blanco. Seleccione 'Cambiar colores...' en el menú herramientas para confirmar que mCherry y GCaMP5 canal color asignaciones son correctos (figura 4A - C).<ol>
<li>Haga clic en la serie de tiempo en la ficha 'Secuencia' y situado a 1,25 μm/píxeles y 20 fotogramas/s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione 'Ratio' del menú 'Herramientas' y seleccione "GCaMP5" para el 'Canal' y "mCherry" para' canal'. Haga clic en "Calcular" al lado de 'Umbral' para sustraer el fondo de cada secuencia de imágenes. Seleccionar "Solicitud arco iris LUT en el canal de relación". Nota: Para una grabación con una proporción de base media de 0,3 (baja Ca2 +) y una relación máxima de 2-3 (alta Ca2 +), una tabla de búsqueda adecuado sería de 0 (azul) 1 (rojo).</li>
	<li>Generar un canal de relación de intensidad modulada utilizando el canal mCherry (figura 4D). El canal de relación de intensidad modulada es una imagen de millones de colores donde se asigna el color de la relación a la luminosidad del canal mCherry.</li>
	<li>En la pestaña de 'Medidas', crear un protocolo de detección de objeto arrastrando la herramienta 'Buscar objetos usando intensidad' en el panel de 'Protocolo'. Haga clic en la 'corona' para establecer la ventana de mCherry valores de intensidad y encontrar objetos.<ol>
<li>Seleccione intensidad valores ≥ 2 desviaciones estándar (SD) sobre el fondo (por ejemplo, un límite más bajo de ~ 2.500, límite máximo de 65.535). Asegúrese de que la terminal presináptica se detecta y que 'actualizar automáticamente retroalimentación' se selecciona en el menú de medidas. Nota: El software también puede identificar objetos por su desviación de estándar de fondo utilizando un protocolo relacionado «SD intensidad.» Sin embargo, si un objeto especialmente brillante entra en el campo de visión, dramáticamente puede cambiar la intensidad media durante esos horarios, que afectan a los atajos de intensidad utilizados para determinar el HSN. Esta variabilidad no se producirá si se utilizan valores de intensidad cruda para encontrar los objetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir filtros adicionales dirigidos a sólo el canal mCherry (tamaño, intensidad máxima, etc.) si es necesario para excluir objetos no deseados como la cabeza, la cola y la fluorescencia de la tripa. Seleccione ' hacer medición ' en el menú mediciones y elija ' Todos los puntos de tiempo.' Nota: Esto ejecutará el protocolo, todas las medidas de la escritura a un archivo de valores separados por comas (.csv) que debe ser exportado utilizando el comando 'export' en el menú archivo.</li>
	<li>Abrir archivo exported.csv y copiar punto, área (μm2), media (cociente del canal), centroide X (μm) y datos Y centroide (μm) en una nueva hoja. Exportar archivo a.csv sin encabezados de columna. El software de cuantificación proporcionales puede clasificar una célula de interés como uno o más objetos por punto.<ol>
<li>Para recombinar estos objetos, utilizar un script personalizado 'AnalzyeGCaMP_2017.m'. Nota: La secuencia de comandos también identifica Ca2 + (cociente) picos en los datos y guarda el archivo de a.csv de sus horarios, las amplitudes de pico y anchuras de pico. También genera archivos postscript de los rastros de la relación cruda y anotado. Con esta información, se deben determinar amplitud transitoria de Ca2 + y el intervalo entre transitoria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir la salida de X y Y valores del centroide de cada objeto de fluorescencia a los valores X e Y registrados en la escritura de etapa XY de Bonsai. Utilizar la posición neta de XY para generar una traza de la locomocion de gusano y para calcular el desplazamiento celular y velocidad que acompañan el comportamiento diferente Estados31.</li>
	<li>Importar las imágenes grabada trasmitida en ImageJ como una pila virtual. Anotar eventos de puesta de huevos y otros comportamientos. El calendario de estos eventos en comparación con Ca2 + picos del rastro de la relación.</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos existen.

Transgenes:
Porque mCherry expresión ha mejorado a través de inserción del intrón y el codón-optimización (y Reporteros GCaMP disponibles más no), inyectar ~ 4 x la cantidad de plásmido GCaMP5-expresión para asegurar niveles comparables de GCaMP5 de la fluorescencia durante la fuerte Ca 2 + transitorios. Rescate de la mutación de lin-15(n765ts) permite la recuperación fácil de los animales transgénicos con efectos mínimos sobre la puesta de huevos y otros comportamientos35. Los transgenes debe integrarse para garantizar la expresión uniforme y condiciones entre diferentes animales25la proyección de imagen. Marcadores seleccionables, incluyendo resistencia a los antibióticos36,37 y rescate de lethals sensibles a la temperatura de38 , también deberían funcionar, sino, porque animales no transgénicos están muertos, confirmación de la integración del transgén y calidad de homozigoto es más difícil en comparación con marcadores que presentan un fenotipo visible25. Marcadores dominantes que interrumpir la locomoción normal y disminución de aptitud, tales como rol-6(dm), deben ser evitada39. Proyección de imagen en el lite-1 fondo mutante es esencial para reducir las respuestas de escape luz azul durante la proyección de imagen23,40,41. Mutación adicional de gur-3, que actúa en paralelo a 1 lite, puede minimizar aún más el comportamiento residual y cambios fisiológicos causados por la luz azul42. Convenientemente, gur-3 lite 1y lin-15 son todos situados en la mitad derecha del cromosoma X, que debe simplificar la construcción de nuevas cepas de Ca2 + la proyección de imagen y los experimentos de optogenetic.
Ya tiempos de exposición son cortos y se recogen imágenes en 20 Hz, las señales GCaMP5 y mCherry deben ser brillantes. La explicación más probable para ruidoso Ca2 + grabaciones es tenue fluorescencia causada por la expresión débil del reportero. Promotores también deben ser razonablemente específicos para la región se va a examinar. Porque el cuerpo de la célula HSN y sinapsis en los músculos vulvares son en el centro del cuerpo, expresión adicional de la promotora de PNL-3 en la cabeza y la cola está normalmente fuera del campo de visión y puede ser excluido usando filtros adicionales en la Software de cuantificación proporcionales. Para asegurarse de que los cambios observados en GCaMP5 resultado de la fluorescencia de cambios reales en intracelular Ca2 +, control transgenes expresando GFP en lugar de GCaMP5 debe estar preparados de forma independiente y analizaron26. Nuevos Ca2 + reporteros diferentes Ca2 + sensibilidades cinética y colores han ampliado la opción de herramientas de imagen, pero cada nuevo reportero debe validarse con el Ca2 +-variante fluorescente insensible14 ,16.
Los medios de comunicación:
Planchas NGM para la proyección de imagen deben estar preparados con agar de alta calidad. Agar de calidad inferior no se disolverá totalmente en autoclave, dejando pequeñas partículas eso dispersión ligera durante la proyección de imagen y aumento de fluorescencia de fondo. Agarosa grado de biología molecular se puede utilizar, pero debe reducirse la cantidad añadida para mantener la firmeza de placa equivalente.
Comparaciones con otros métodos de montaje:
Planteamientos previos a la actividad de la imagen en el circuito de comportamiento de desove han utilizado gusanos inmovilizados con pegamento a una placa de agarosa. Bajo estas condiciones, actividad del circuito y comportamiento de puesta de huevos no se favorece sin una reducción en los medios de cultivo osmolaridad8,10,44,45. La evidencia reciente sugiere que varios comportamientos de gusano son moduladas por estado de locomoción, plantean interrogantes sobre la relación de la actividad de las células observadas en animales inmovilizados a ése visto en comportarse libremente animales. Hemos demostrado recientemente que actividad de circuito puesta de huevos es inesperadamente gradualmente con locomoción26,27. Del mismo modo, compartimentado Ca2 + en la interneurona RIA integra actividad de las neuronas sensoriales y las neuronas de motor principales durante el forrajeo movimientos46. Comportamiento de defecación se acompaña también de un cambio preciso y estereotipado en la locomoción que permite a los animales a moverse lejos de su lugar de alimentación antes de expulsar residuos47. Juntos, estos resultados sugieren que grabaciones breves de actividad de circuito de animales inmovilizados pueden ser fundamentalmente diferentes de los obtenidos en comportarse libremente animales.
A pesar de estar directamente debajo de un cubreobjetos, comportamiento del gusano se asemeja al visto en placas estándar de NGM. Puesto huevos a de la portilla, y permite a la pequeña cantidad de comida que se depositan las larvas L1 para convertirse en adultos (datos no mostrados). El tamaño grande de agar permite intercambio gaseoso razonable y resiste la deshidratación, aunque demasiada cantidad de alimentos aumentará la fluorescencia del fondo. Mientras que este método funciona mejor para los adultos, la técnica puede utilizarse también para animales de L4 de imagen. Sin embargo, el espesor de la capa acuosa entre el fragmento y el cubreobjetos es tal que las larvas más pequeñas tienen dificultad para gatear y a menudo pueden quedar atrapadas a raíz de un movimiento adulto.
Una limitación de esta técnica de montaje es que la estimulación mecánica o química directa a regiones precisas del cuerpo es difícil. Avances recientes en técnicas de iluminación con motivos permiten la excitación separada de cabeza o de cola expresado opsins microbianas con iluminación independiente y detección de la fluorescencia GCaMP/mCherry en midbody48,49. Como resultado, es posible resolver este problema utilizando enfoques optogenetic.
Comparaciones con otros Ca 2 + Enfoques de la proyección de imagen:
Este método funciona muy bien para registrar cambios en citoplásmicas Ca2 + de sola, resuelve las células y sus regiones sinápticas. La proyección de imagen en tiempo real, volumétrica de las neuronas en la cabeza recientemente se ha logrado mediante la posición de los núcleos de célula para la identificación de la célula y para cuantificar cambios en calcio nucleoplasmática50,51,52. La relación entre nucleares y sináptica Ca2 + sigue siendo confusa. Nuestros datos sugieren que los cambios más visibles en HSN intracelular Ca2 + se producen en la termini presináptica de la soma de la célula (figura 4). El termini presináptica de la HSN y las neuronas VC está incrustados en los músculos vulvares postsinápticos26. No está claro si habrá suficiente resolución en la dimensión Z incluso con spinning disk o técnicas ficha técnica de iluminación para atribuir presinápticos Ca2 + señales a células específicas sin depender de alguna manera calcio somática para la identificación de células . Utilizando las técnicas descritas aquí, cada 10 minutos, dos canales de grabación con 12.001 imágenes de 256 x 256 píxeles de 16-bit TIFF es ~ 4 GB. La proporción proporción e intensidad modulada canales doble el tamaño del archivo a ~ 8 GB. Un típico experimento de grabación 10 animales de cada uno de los dos genotipos (tipo salvaje y experimentales) genera casi 150 GB de datos primarios y requiere 20 h para recopilar y analizar. Análisis volumétrico con 10 rebanadas de Z por punto requeriría un orden de magnitud más datos y tiempo analítica, explicando por qué tan pocos tales estudios han sido completados.
Hardware:
Registramos y analizar las secuencias de imagen en estaciones de trabajo de doble procesador con alto rendimiento tarjetas de gráficos (por ejemplo, juegos), 64 GB de RAM, y discos de estado sólido de alto rendimiento (véase Tabla de materiales). Datos almacenados en red matriz redundante de discos independientes (RAID) y copia de seguridad a la nube en un centro de datos fuera del sitio.
Recomendamos usando alta potencia colimado LEDs para excitación pulsada fluorescencia halogenuros metálicos o fuentes de luz de mercurio. Varios disponibles en el mercado sistemas de LED de varios colores están disponibles. Mientras que algunos de estos sistemas de LED tienen un coste inicial más alto, tienen una larga vida (> 20,000 h), pueden al mismo tiempo excitar fluoróforos diferentes cuatro o más y ofrecen un control temporal preciso usando un serial o un interfaz TTL con baja latencia (interruptor de 10 a 300 μs tiempo). Activación asegura que la muestra se ilumina sólo cuando realmente se están recopilando datos. Normalmente se utiliza una exposición de 10 ms cada 50 ms (tasa arancelaria de 20%). Esto reduce la fototoxicidad y desenfoque de movimiento durante la captura de la imagen, previamente divulgados43.
Utilizamos cámaras sCMOS por su velocidad y gran cantidad de píxeles pequeños y sensibles. Un EM-CCD de la cámara es una alternativa más costosa, pero 'floración' efectos pueden resultar en fotoelectrones capturados se derrame en los píxeles adyacentes. Nuevas cámaras sCMOS retroiluminado tienen fotosensibilidad similar de EM-CCD a un precio significativamente reducido. A pesar de todo sensor que utiliza, los canales GCaMP5 y mCherry deberán obtenerse simultáneamente. Captura secuencial en gusanos en movimiento llevarán a mal registrados imágenes inadecuadas para cuantificación proporcionales. Proyección de imagen de canal dual se puede lograr en una sola cámara después de partir de canales utilizando un divisor de imagen (figura 2) o dos cámaras idénticas. El rango dinámico de imágenes de 16 bits se recomienda sobre las imágenes de 8 bits de cuantificación precisa radiométrica. Imágenes de brightfield del comportamiento del gusano, capturamos utilizando una cámara de 1 pulg. de 4.1 MP infrarrojo cercano USB3 para capturar grandes secuencias de imágenes de 8 bits 1.024 x 1.024 desechado de 2 x 2 después de la compresión JPEG. El mayor FOV en más nuevos modelos de microscopio permite un gusano adulto a visualizarse en 20 x después de 0.63 x demagnification con sólo leve viñeteo (figura 4E).
Recomendamos el uso de señales de voltaje TTL estándar para sincronizar la iluminación y la captura de marco. Debido a latencias posibles en los programas de software diferentes, recomendamos a los usuarios configuración la cámara de fluorescencia con gatillo salidas como maestro con salidas TTL todos los demás dispositivos de conducción. De esta manera, se recogerán información de posición de brightfield y etapa para cada medida de Ca2 + .
Hendidura o microscopios confocales exploración punto resonantes típicamente encontrados en instalaciones compartidas confocales también dan excelente rendimiento durante radiométrica Ca2 + proyección de imagen. Este tipo de instrumentos puede utilizarse para capturar dos o más canales de fluorescencia junto con brightfield24. En este caso, el agujero de alfiler confocal debe ser abierto y su diámetro máximo, y un detector espectral debe ser utilizado para separar señales de infrarrojos brightfield, mCherry y GCaMP5. Esto maximiza la colección light de un grueso (~ 20 μm) slice mientras sigue permitiendo el rechazo de la fluorescencia fuera de enfoque. Una desventaja es el FOV más pequeño y más restricciones para la personalización de hardware y software.
Software:
Mayoría de los fabricantes de la nave e instala sus cámaras y microscopios con software privativo, incluyendo configuración de activación de entradas y salidas. Pueden variar las características y funcionamiento de este software durante la grabación. Porque gusanos en movimiento rápido puede ser un desafío a seguir, imagen de pantalla durante la grabación debe ser suave y estable a 20 Hz. Para mejorar el rendimiento, secuencias de imágenes pueden guardarse temporalmente en la memoria RAM con subconjuntos conductualmente relevantes salvados en el final del experimento. Estos archivos de secuencia de imágenes de dos canales se pueden convertir en el formato abierto de la citometría de imagen estándar (.ics) para la importación en el software de cuantificación proporcionales. OME-TIFF es un formato de imagen de código abierto más reciente, aunque diversas instalaciones pueden ser incapaces de guardar secuencias de imágenes TIFF mayor que 4 GB.
Una característica clave de la tubería de cuantificación es la generación del canal de relación y luego de un procedimiento de segmentación de imagen imparcial usando fluorescencia mCherry para encontrar células de interés. De cada objeto encontrado, significan que el tamaño del objeto, posición del centroide XY y el mínimo, y se calculan los valores de intensidad máxima de la fluorescencia para cada canal (incluyendo el canal de relación). Juntos, estos valores se utilizan para cuantificar cambios en intracelular Ca2 + en cada punto de tiempo en la grabación. Medidas de objeto para cada punto luego se exportan como archivo de a.csv para análisis posteriores.
Una limitación importante del protocolo descrito aquí es la dependencia de mover los datos en diferentes formas a través de una serie de productos de software. Una irritación adicional es que algunos de lo software de código abierto y libre, mientras que otros están cerrados, caro e irregularmente actualizados. Una mejora importante sería utilizar o desarrollar una pieza de software (idealmente open-source) que proporciona niveles similares de rendimiento y facilidad de uso de adquisición para el análisis. Como se señaló anteriormente, análisis radiométrica duplican el tamaño del archivo y el tiempo requerido para completar un experimento. Generación de controladores de cámara que pueden integrarse en los marcos personalizables por el usuario como Bonsai permitiría imágenes y otras secuencias de datos a ser recogidos y analizados en el rendimiento en tiempo real, mejorando significativamente.
Perspectivas de futuro:
Mientras que típicamente rastrear movimientos de gusano manualmente, debe permitir seguimiento del centroide de gusano detectado en grabaciones de infrarrojos brillante - o campo oscuro para los nodos que proporcionan ajuste de lazo cerrado de posición y automatizado de procesamiento de imágenes adicionales seguimiento (figura 3 y datos no mostrados). La mayoría de las grabaciones de la fluorescencia obtenido con este método es oscuro y carente de biológicamente interesantes datos. En el sensor o en tiempo real después de la adquisición procesamiento de imágenes técnicas de secuencias de imágenes a objetos relevantes que permite mayor resolución espacial y agilizar la canalización de análisis de datos, particularmente si rodajas Z adicionales se recogen para cada uno punto de tiempo para visualizar la actividad en todas las células previas y postsinápticas en el circuito.

Una meta central de la neurociencia es entender cómo se comunican las neuronas en circuitos de comportamiento animal de la unidad. Circuitos neurales integran una gama de diversas señales sensoriales con el fin de cambiar la actividad del circuito, así conducir cambios de comportamiento necesarios para los animales responder a sus ambientes. El nematodo C. elegans, tiene un sistema nervioso simple con 302 neuronas cuyas conexiones sinápticas han sido totalmente asignados1. Además, los genes que codifican para proteínas implicadas en la neurotransmisión están muy conservados entre C. elegans y mamíferos2. A pesar de la sencillez anatómica de su sistema nervioso, muestra un complejo repertorio de comportamientos conservados proporcionando una plataforma fértil para entender cómo las neuronas regulan comportamiento3.
C. elegans es favorable a la aplicación de una amplia gama de enfoques como la manipulación genética, ablación del laser de células, técnicas electrofisiológicas, así como en vivo 4,5la proyección de imagen óptica. Estudios recientes han producido mapas detallados del principal neurotransmisor señalización en C. elegans como el colinérgico y redes neuronales GABAérgicos. Estos estudios, junto con estudios en curso para la expresión de receptores proteína G acoplado todo neuronales colocar este modelo en una posición única para aprovechar estructural altamente detallado y mapas de conectividad neuronal funcional para comprender cómo estos señal de diferentes neurotransmisores a través de diversos receptores y escalas de tiempo a aspectos diferentes de la unidad de comportamiento animal.
Para estudiar patrones de actividad neuronal dinámica en cualquier sistema, un requisito previo esencial es desarrollar metodologías robustas para grabar actividad en neuronas individuales o circuitos todos en comportamientos. Especialmente importante es la receptividad de estos enfoques ópticos para visualizar la actividad presináptica que impulsa la fusión de la vesícula sináptica. Reporteros fluorescentes rápidos y altamente sensibles de intracelular Ca2 +, junto con la creciente disponibilidad de fotodetectores sensibles, han revolucionado la grabación de celular y actividad sináptica en animales despiertos, vivos durante el comportamiento. Porque un resultado importante de la actividad eléctrica sináptica es regular los canales de Ca2 + , cambios en intracelular Ca2 + se cree que fielmente reportar conductualmente relevantes cambios en actividad de las células.
En este estudio, presentamos un enfoque para realizar radiométrica Ca2 + proyección de imagen en el HSN motor las neuronas serotonergic que promueven el comportamiento de puesta de huevos en C. elegans6,7. Este enfoque se basa en los esfuerzos anteriores para visualizar Ca2 + en C. elegans y el circuito de puesta de huevos durante comportamiento5,8,9,10,11 . El método permite correlacionar simultáneamente los cambios observados en la actividad de la célula/circuito con eventos de desove, así como cambios en el estado de locomoción animal. Aunque utilizamos este enfoque para estudiar la actividad en gusanos adultos, trabajos no publicados de nuestro laboratorio muestran que este enfoque puede ser extendido para animales menores en el cuarto (L4) estadio larvario así. Es probable que la actividad de otras neuronas de C. elegans que funcionan en distintos circuitos y conductas debe ser igualmente accesible con esta técnica. Otro recientemente desarrollado rápido Ca2 + indicadores no superposición espectros de emisión12,13,14,15,16, optogenetic herramientas17 y genéticamente codificado indicadores ópticos de membrana voltaje18, nos permitirá realizar penetrante all-optical investigar cómo cambios en la actividad del circuito neural drive Estados de comportamiento distinto.

ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans

Se ha vuelto cada vez más claro que actividad circuito neural en animales de comportamiento difiere sustancialmente en animales anestesiados o inmovilizados. Reporteros fluorescentes altamente sensibles, genéticamente codificados de Ca2 + han revolucionado la grabación de celular y actividad sináptica con ópticas no invasivos en comportamiento de animales. Cuando se combina con genética y técnicas de optogenetic, los mecanismos moleculares que modulan la actividad celular y el circuito durante el comportamiento diferentes Estados pueden identificarse.
Aquí describimos los métodos proporcionales Ca2 + imagen de neuronas individuales en comportarse libremente gusanos Caenorhabditis elegans . Se demuestra una técnica de montaje sencillo que suavemente gusanos de recubrimientos sobre un agar estándar de los medios de crecimiento de nematodos (NGM) bloquean con un cubreobjetos de vidrio, permitiendo a los animales a ser grabado en alta resolución durante el movimiento sin restricción y comportamiento. Con esta técnica, utilizamos el sensible Ca2 + reportero GCaMP5 para registrar cambios en intracelular Ca2 + en el hermafrodita específico las neuronas serotonergic (HSNs) como conducen comportamiento de puesta de huevos. Co expresando mCherry, Ca2 +-proteína fluorescente insensible, podemos localizar la posición de la HSN dentro de ~ 1 μm y corregir las fluctuaciones en la fluorescencia causada por cambios en el enfoque o movimiento. La proyección de imagen simultánea, infrarrojo brightfield permite comportamiento registro y seguimiento de animales con una etapa motorizada. Mediante la integración de estas técnicas microscópicas y secuencias de datos, podemos registrar actividad de Ca2 + en el circuito de puesta de huevos de C. elegans como progresa entre los Estados de comportamiento inactivo y activo más de decenas de minutos.

La técnica de montaje simple descrita aquí (figura 1) produce mínimos cambios en el entorno de la cultura de L4 y adultos C. elegans permitiendo alta resolución grabación en comportamiento de animales a través de un cubreobjetos de vidrio (figura 4). Sincronización de fuentes de luz LED, controladores de fase y exposiciones de la cámara permite para adquisición de datos desde múltiples fuentes a 20 frames/s hasta 1 h. intermedio aumento (20 x) con objetivos de alta apertura numérica (0.7-0.8) ofrece buena resolución espacial de la región sináptica en el circuito de comportamiento puesta de huevos, incluso con 4 x 4 pixel binning (1,25 μm/píxeles). Adquisición simultánea de GCaMP5 y mCherry señales de fluorescencia (figura 4A, B) se utiliza para generar un canal de relación pixel por pixel que compensa los cambios en el movimiento animal y foco (figura 4D). La terminal presináptica de HSN es tan grande como se pueden visualizar claramente muchos cuerpos de células neuronales en C. elegansy los cambios en presynaptic HSN Ca2 + . El FOV grande de la cámara de infrarrojos brightfield permite el gusano manualmente hacer un seguimiento durante la grabación (figura 4E). Para cada animal, cambios en intracelular Ca2 + se pueden correlacionarse con comportamientos evidentes en proyección de imagen de brightfield incluyendo liberación de huevo y los cambios en la locomoción (figura 4E).
Cuantificación de HSN Ca2 + y velocidad confirma que gusanos cambian su locomoción en su transición al comportamiento de puesta de huevos. Existen diferencias significativas en la velocidad del gusano antes, durante y después del puesta de huevos estado activo (figura 5A). Esto no es causado por ruido inherente a la proyección de imagen o sistema de seguimiento. Zoom en un evento de puesta de huevos, se observa un fuerte cambio en la fluorescencia de GCaMP5 (ΔF/F) antes del evento de puesta de huevos mientras que la fluorescencia mCherry es relativamente sin cambios (figura 5B). Cambios registrados en la relación GCaMP5:mCherry (ΔR/R) muestran claramente una HSN Ca2 + transitoria ~ 4 antes s de lanzamiento de huevos (figura 5B). Coincidente con la contracción de un músculo, una clara desaceleración de locomoción gusano ocurre que suelte los extremos con huevo. Los resultados anteriores han demostrado que las neuronas colinérgicas del motor de VC, que están inervadas por las HSNs, muestran actividad pico durante contracciones fuertes del músculo vulvar y huevo lanzamiento 8,10,27. También hemos demostrado que optogenetic la activación de las neuronas de VC conduce una inmediata disminución de la locomoción, lo que sugiere que las neuronas de la VC pueden ser activadas por la contracción de un músculo, de tal modo retardando locomoción hasta recibir retroalimentación de la liberación del huevo27 .
La proyección de imagen y sistema descrito de seguimiento permite la visualización de la organización espacial del comportamiento de puesta de huevos (figura 5C). Como se muestra, gusanos entrar funciona sostenido de locomoción hacia adelante justo antes de que el estado activo de32. Gusanos pasan la mayor parte de su tiempo alimentándose de las bacterias en el centro del trozo de agar. Antes de la entrada en el estado activo, gusanos Aléjese de la comida, que es coincidente con la aparición de frecuentes HSN Ca2 + transitorios. Actividad HSN entonces transiciones en disparo de ráfaga, con varios espaciados HSN Ca2 + transitorios que sostener eventos de puesta de huevos. Los gusanos a menudo girar, reanudar la locomoción hacia adelante y ponen huevos en el camino hacia su posición inicial junto a las bacterias OP50. Suponemos que se pueden estar influyendo en los cambios en local O2 y CO2 concentración donde los gusanos deciden poner huevos33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> Figura 1. C. elegans montaje de técnica para la proyección de imagen de alta resolución de circuito actividad y comportamiento de puesta de huevos. Arriba, el montaje final del lado. Fondo, el montaje final como se ve por la parte inferior del cubreobjetos grande. Las flechas indican alimentación bacteriana OP50, gusanos C. elegans y huevos, intercalada entre el trozo de agar NGM y el cubreobjetos de 24 mm x 60 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> Figura 2 . Campo amplio radiométrica Ca2 + proyección de imagen y comportamiento de grabación en un microscopio de epifluorescencia invertida. (A) posición de gusano y comportamiento es capturado en trasmitida vía un 20 x (0.8 NA) objetivo Plan-Apochromat usando luz infrarroja (750-790 nm) (flechas púrpura) emitida por una lámpara halógena a través de la pedazo NGM. Un joystick y etapa motorizada controlador se utiliza para mantener el gusano en el campo de visión durante la grabación. Posición (Δx, Δy) se envía a la PC por el puerto serie. GCaMP5 y mCherry proteínas expresadas en el gusano se excitan con 470 nm (flechas azules) y 590 nm (flechas amarillas) diodos emisores de luz (LED). Emite GCaMP5 (flechas verdes) y fluorescencia mCherry (flechas naranjas) junto con la luz infrarroja pasa a través de un espejo dicroico de varias banda (véase Tabla de materiales). Un divisor de viga de 80/20 envía 20% de la luz a través de un demagnifer de 0.63 x para la captura con una cámara CMOS de sensibles al infrarrojo (flecha morada). El 80% restante de la luz se envía por el puerto lateral del microscopio a un divisor de imagen que separa el GCaMP5 y mCherry fluorescencia en separar las mitades de una cámara sCMOS mientras brightfield infrarrojo luz. Datos de ambas cámaras son transferidos a un PC mediante cables USB3. Los puertos de disparo de la cámara del sCMOS fluorescencia (azul) se utilizan para enviar + 5V TTL se activa el sistema de iluminación LED, la cámara del CMOS infrarrojo brightfield y el dispositivo Digital de adquisición (DAQ). (B) gatillo 3 salida de señales TTL son detectadas por el DAQ en el pin digital 8 # y enviadas a la PC mediante una conexión USB. Estas entradas digitales desencadenan una ' donde XY' serie comando desde un script de software de Bonsai (XY-fase-final) que lee X e Y de posición para cada imagen de fluorescencia/infrarrojo GCaMP5/mCherry capturado la etapa. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> Figura 3 : Diseño de la secuencia de comandos de comunicación serie-etapa de Bonsai XY-fase-final. La parte superior DigitalInput nodo (rosa) lee disparadores TTL en pin #8 de la DAQ. Para cada voltaje TTL positivo (verde), lo DAQ hace un timestamp (azul) y escribe una cadena de 'Donde XY?' (rosa) en el controlador de la etapa por el puerto serie (gris). El nodo SerialStringRead (rosado) lee que x e Y coordinan la respuesta desde el controlador de la etapa. Esta cadena se convierte en micras y separada en X e Y coordenadas de la etapa. Finalmente, estas cuatro corrientes se combinan usando un nodo de zip (azul) y se escribe en un archivo de cuatro column.csv: una cuenta de marco de las señales de la TTL recibidas (nodo de gama, color de rosa), las coordenadas X e Y y el intervalo entre los puntos de tiempo posteriores (típicamente ~ 50 ms cuando grabación a 20 Hz). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografías representativas de HSN fluorescencia y todo animal trasmitida durante comportamiento de puesta de huevos. (A–D) Proyección de imagen simultánea radiométrica de fluorescencia GCaMP5 y mCherry HSNs justo antes de lanzamiento de huevo. Termini presináptica HSN se indica con las puntas de flecha. (C) la combinación de GCaMP5 y mCherry fluorescencia. (D) intensidad modulada GCaMP5:mCherry relación; una proporción alta (rojo) indica Ca intracelular alto2 + en la terminal presináptica. (E) imagen trasmitida del gusano entero justo después de que se han puesto huevos. Puntas de flecha indican las mitades anteriores y posteriores de la vulva de la que se colocan los huevos. Barra de escala para todas las imágenes es 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> Figura 5 : Grabación de HSN Ca2 + y locomoción velocidad durante comportamiento de puesta de huevos. (A) rastros de cambios de relación de GCaMP5:mCherry en respuesta a intracelular Ca2 + transitorios (ΔR/R; rojo) junto con la velocidad instantánea del gusano (μm/s; azul). Puntas de flecha indican eventos de puesta de huevos. (B) rastros de HSN GCaMP5 fluorescencia (verde; ΔF/F), mCherry fluorescencia (rojo, ΔF/F), cociente de la fluorescencia de GCaMP5:mCherry (negro; ΔR/R) y gusano velocidad (azul) en el momento de la liberación de huevos. (C) organización espacial de puesta de huevos y locomoción comportamientos durante toda la grabación de 10 minutos. La pista de gusano se obtuvo de la información de fase XY que se sumó a la posición del centroide de la HSN Obtenido de la grabación de fluorescencia mCherry. Se indican los tiempos de transitorios de HSN (círculos rojos), eventos de desove (flecha negra), el comienzo y final de la grabación (diamantes azul y verde). Barra de escala es 1 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

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