Name: genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van het Ontario Instituut voor kankeronderzoek, de Stichting van Canada voor de innovatie, de Ottawa regionale Cancer Foundation en de Terry Fox Research Institute. K.J.A. werd gesteund door een Vanier Canada Graduate beurs, een Canadees Instituut voor gezondheid onderzoek-Master Award, en een Graduate beurs van Ontario.

1. ontwikkeling en validatie van een siRNA van de high-throughput screening test
Opmerking: Voor alle experimenten, groei Hepes-buffer media geschikt is voor elke cel-regel gebruiken. Zie afbeelding 1 voor een overzicht van de workflow van assay optimalisatie tot tertiaire validatie.
<ol><li>Vaststelling van de voorwaarden van de optimale transfectie
	<ol>
<li>Selecteer een tumor cellijn of een ideale meerdere tumor cellen lijnen waarmee het opt...

<ol>
	<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions?.">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li><li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+genomic+screening:+elucidating+virus-host+interactions.">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li><li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis.">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).</li><li>Friedel, C. C., Haas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomes+and+global+models+of+virus-infected+cells.">Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells.</a> Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).</li><li>Gao, S., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+RNA+interference+high-throughput+screening+technology+in+cancer+biology+and+virology.">Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology.</a> Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).</li><li>Kilcher, S., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+approaches+to+study+virus+entry+and+infection.">Next generation approaches to study virus entry and infection.</a> Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).</li><li>Ramage, H., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+From+unbiased+genetic+screens+to+function.">Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function.</a> Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).</li><li>Mercer, J., Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+reveals+proteasome-+and+Cullin3-dependent+stages+in+vaccinia+virus+infection.">RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection.</a> Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).</li><li>Sivan, G., Martin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+role+for+nuclear+pore+proteins+in+poxvirus+morphogenesis.">Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).</li><li>Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loss+of+function+analysis+of+host+factors+Influencing+vaccinia+virus+replication+by+RNA+Interference.">A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).</li><li>Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNA+interference+screen+for+human+cell+factors+affecting+myxoma+virus+replication.">A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication.</a> J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).</li><li>Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+lentiviral+shRNA+screen+identifies+serine/arginine-rich+splicing+factor+2+as+a+determinant+of+oncolytic+virus+activity+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).</li><li>Panda, D., Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+reveals+requirement+for+host+cell+secretory+pathway+in+infection+by+diverse+families+of+negative-strand+RNA+viruses.">RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).</li><li>Lee, A. S. -. Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+small+interfering+RNA+screen+identifies+host+factors+required+for+vesicular+stomatitis+virus+infection.">A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection.</a> J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).</li><li>Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-tumor+interactome+screen+reveals+ER+stress+response+can+reprogram+resistant+cancers+for+oncolytic+virus-triggered+Caspase-2+cell+death.">Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death.</a> Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).</li><li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+arms:+Using+RNAi+screening+to+improve+oncolytic+viral+therapy.">A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).</li><li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+screening+to+enhance+oncolytic+virotherapy.">Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy.</a> Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).</li><li>Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+to+enhance+oncolytic+virus+immunotherapy.">High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy.</a> Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER:+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function.">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).</li><li>Luc, P. -. V., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINdb:+a+database+of+nuclear+protein+complexes+from+human+and+yeast.">PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast.</a> Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).</li><li>Chung, N., Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+absolute+deviation+to+improve+hit+selection+for+genome-scale+RNAi+screens.">Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+Score,+SSMD*,+z*+Score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Zhang, X. D., Lacson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+SSMD-based+false+discovery+and+false+nondiscovery+rates+in+genome-scale+RNAi+screens.">The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).</li><li>Amberkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNA+interference+screens+integrative+analysis:+towards+a+comprehensive+understanding+of+the+virus-host+interplay.">High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay.</a> World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).</li><li>Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+reproducibility+between+genome-scale+siRNA-based+screens.">Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).</li><li>Carralot, J. -. P., Ogier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+specific+edge+effect+correction+method+for+RNA+interference+screenings.">A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings.</a> Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).</li><li>Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+off-target+effects+can+be+reduced+at+concentrations+that+match+their+individual+potency.">siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).</li><li>Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+detection+and+elimination+of+systematic+error+in+high-throughput+screening.">An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening.</a> Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Savidis, G., McDougall, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Zika+virus+and+dengue+virus+dependency+factors+using+functional+genomics.">Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics.</a> Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).</li><li>Ma, H., Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Based+screen+identifies+genes+essential+for+West-Nile-virus-induced+cell+death.">A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death.</a> Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).</li><li>Zhang, R., Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses.">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li><li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens.">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li></ol>

Hier presenteren we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Dit is met succes getest met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, maar, zoals opgemerkt, het kan worden aangepast voor gebruik met andere oncolytische virussen of andere virussen in het algemeen ter identificatie van de host-genen die virus replicatie moduleren. Het protocol van de screening is ook ontworp...

High-throughput genoom-brede RNAi screening is gebleken een instrument van onschatbare waarde voor het openbaren van biologische inzichten in diverse gebieden van studie, met inbegrip van virus biologie. In de afgelopen tien jaar of zo, talrijke groepen hebben zich ertoe verbonden cel-gebaseerde grootschalige RNAi screening om te identificeren uitgebreid host genen die virus replicatie (herzien in1,2,,3,4 moduleren , 5 , 6 , 7). interessant, een groot aantal van deze schermen zijn uitgevoerd in kankercellen en diverse met virussen die zijn huidige oncolytische virus kandidaten waaronder vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12,13,,14van de virus van de vesiculaire stomatitis en Maraba virus15. Terwijl de focus van de meerderheid van deze studies was op het identificeren van gastheer factoren die invloed hebben op bepaalde aspecten van de replicatie van het virus en niet op het identificeren van biotherapeutic doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie, kan waardevolle gegevens worden gedolven uit deze data sets in dit verband. Het is duidelijk dat het krachtige potentieel te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie heeft niet ten volle zijn benut.
Een overvloed aan oncolytische virus platformen worden momenteel getest in preklinische en klinische studies met inbegrip van herpes simplex virus, reovirus en vaccinia virus, die aantoonbaar succes in laat-stadium klinische proeven hebben gehad. Voor de meerderheid van deze platforms, hebben inspanningen zijn gericht op het veranderen van het genoom van het virus ter verbetering van de therapie. Bijvoorbeeld het vergroten van tumor specificiteit, zijn specifieke virus genen verwijderd of gemuteerd om aanzienlijk beperken van virale replicatie in normale cellen, maar niet in tumorcellen. In sommige gevallen transgenen bijgekomen zoals GM-CSF (granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor) te versterken het immuunrespons of NIS (natrium jodide symporter) in vivo imaging en cellulaire radioiodide opname inschakelen voor therapeutische doeleinden. Echter is er zeer weinig werk, gericht op het manipuleren van genen van de gastheer/tumor en het verkennen van de impact van gastheer/tumor genen op oncolytische virus replicatie. Met de komst van high-throughput screening technologie, is het nu mogelijk om te sonderen virus-gastheer interacties op de schaal van een genoom en te ontcijferen van mogelijkheden voor het manipuleren van het genoom van de gastheer om oncolytische virus therapie (herzien in16, 17,,18).
We gemeld de eerste studie demonstrerende proof-of-concept voor het gebruik van high-throughput genetische screening ter identificatie van de host-doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Om te ontdekken van host-genen die moduleren Maraba virus oncolysis, een oncolytische rhabdovirus momenteel getest in fase I en II proeven, voerden we genoom-brede RNAi schermen over drie verschillende tumor cellijnen in tweevoud met een siRNA (korte inmenging van RNA) bibliotheek gericht op 18,120 genen15. Traject analyse van hits geïdentificeerd in de schermen geopenbaard verrijking van leden van het ER (endoplasmatisch reticulum) stress reactie trajecten. Wij hebben 10 hits binnen deze trajecten voor secundaire validatie met behulp van siRNA met verschillende targeting sequenties van die van het primaire scherm hebt geselecteerd. Als onderdeel van de tertiaire validatie, voerden we een redding experiment met IRE1α (inositol-vereisen enzym 1 alpha) om te bevestigen dat de hit op doel was. In vitro en in vivo tests met een klein molecuul inhibitor van IRE1α resulteerde in sterk verbeterde oncolytische werkzaamheid.
Workenhe et al. 12 leidee een genoom-brede RNAi scherm met behulp van een gebundelde lentivirale shRNA (korte haarspeld RNA) bibliotheek gericht op 16,056 genen te identificeren gastheer factoren beperken het menselijke herpes simplexvirus type 1 (HSV-1) mutant KM100-gemedieerde oncolysis van borst kankercellen. In het primaire scherm ze geïdentificeerd 343 genen de knockdown van die leiden tot verbeterde cytotoxiciteit van KM100-geïnfecteerde cellen over mock-geïnfecteerde cellen; ze geselecteerd 24 van deze genen voor secundaire validatie. Uit de 24 genen, 8 genen werden bevestigd in de secundaire scherm met één van hen wordt SRSF2 (serine/arginine-rijke splicing factor 2) die werd vervolgens bevestigd met behulp van een genetische redding experiment tijdens de tertiaire validatie. De groep ging naar het identificeren van een DNA topoisomerase remmer chemotherapeutische dat verminderd de fosforylatie van SRSF2 en is gebleken dat de behandeling van de combinatie van HSV-1 KM100 met dit remmer leidde tot uitgebreide voortbestaan van TUBO tumor-dragende muizen.
In de bovengenoemde studies volgde een soortgelijke workflow. Elk begon met een primaire genoom-brede RNAi scherm gevolgd door een secundaire scherm op een select aantal hits geïdentificeerd in het primaire scherm. Dit werd gevolgd door tertiaire validatieonderzoek, waaronder om te bevestigen dat de hit op de doelsoort was redden door het uitvoeren van genetische experimenten in vitro met uiteindelijke validatie uitgevoerd door het manipuleren van de target gene product in vivo. In dit artikel geven we eerst een algemeen protocol voor de ontwikkeling en validatie van een high-throughput siRNA-screening test, waarbij sprake is van een vaststelling van de voorwaarden van de optimale transfectie, hoeveelheid virus en de duur van de infectie. Wij bieden ook een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een primaire, een high-throughput siRNA scherm evenals een algemene beschrijving van de methode voor het uitvoeren van validatie van de secundaire scherm en tertiaire validatie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA library</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>G-005005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 384-well plate</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome SMARTpool PLK1</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>M-003290-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllStars Negative Control siRNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F15051-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution (1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3535-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1225011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7017-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37% by weight)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Sealing Film For Microplates</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>361006007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable Heat Sealing Foil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo Select (liquid dispenser)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11120621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH10000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KiNEDx Robotic Arm</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>KX-300-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat 24C Series Automated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50080227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JANUS Automated Workstation</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>AJI4M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carousel</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alps 3000 plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy

High-throughput genoom-brede RNAi (RNA-interferentie) screening technologie is wijd verbeid gebruikt om gastheer factoren die van invloed zijn virus replicatie te ontdekken. Hier presenteren we de toepassing van deze technologie op blootleggen host doelen die specifiek het moduleren van de replicatie van Maraba virus, een oncolytische rhabdovirus en vacciniavirus met als doel verbetering van de therapie. Terwijl het protocol is getest voor gebruik met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, deze aanpak geldt voor andere oncolytische virussen en kan ook worden gebruikt voor de identificatie van de host-doelen die moduleren virus replicatie in zoogdiercellen in algemene. Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een assay voor high-throughput RNAi screening in zoogdiercellen, belangrijke overwegingen en voorbereiding maatregelen belangrijk zijn voor het uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm, en een stapsgewijze handleiding voor uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm; Bovendien is het in grote lijnen schetst voor de methoden voor de uitvoering van de secundaire scherm validatie en tertiaire validatieonderzoek. Het voordeel van high-throughput RNAi screening is dat het maakt het mogelijk een catalogus, in een uitgebreide en onbevooroordeelde manier, gastheer factoren die enig aspect van virus replicatie waarvoor een een in vitro assay zoals infectiviteit ontwikkelen kan, moduleren barsten grootte, en cytotoxiciteit. Het heeft de bevoegdheid om te ontdekken van biotherapeutic doelstellingen onvoorziene op basis van de huidige kennis.

Een overzicht van de workflow voor het identificeren van host doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie wordt gepresenteerd in Figuur 1.
Zoals aangegeven in Figuur 1, is de kritieke eerste stap om het uitvoeren van een high-throughput RNAi scherm assay ontwikkeling. Figuur 2A biedt een monster plaat indeling voor de ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Whole-body PET/MRI van pediatrische patiënten: de Details die er toe

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus levering van CRISPR gidsen voor de lymfkliertest prostaat voor Gene wijziging

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Een workflow voor gegevensintegratie om medicijncombinaties te identificeren die gericht zijn op synthetische dodelijke interacties

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Het analyseren van tumor genexpressie factoren met de CorExplorer Web Portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag- en darmkanker

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Een Murine Ommaya Xenograft-model om direct-gerichte therapie van leptomeningeale ziekte te bestuderen

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...