Name: genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut ontarien pour la recherche sur le Cancer, la Fondation canadienne pour l’Innovation, la Fondation Cancer région d’Ottawa et l’Institut de recherche Terry Fox. K.J.A. a été soutenu par une bourse supérieures du Canada Vanier, un Canadian Institute for Health Research-maîtrise Award et une bourse d’études supérieures de l’Ontario.

1. développement et validation d’un siARN haut-débit, test de dépistage
Remarque : Pour toutes les expériences, utiliser des milieux de culture tampon Hepes appropriés pour chaque lignée cellulaire. Voir la Figure 1 pour une vue d’ensemble du flux de travail de l’optimisation de l’analyse de validation tertiaire.
<ol><li>Détermination des conditions optimales de transfection
	<ol>
<li>Sélectionnez une lignée de cellules tumoral...

<ol>
	<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions?.">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li><li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+genomic+screening:+elucidating+virus-host+interactions.">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li><li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis.">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).</li><li>Friedel, C. C., Haas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomes+and+global+models+of+virus-infected+cells.">Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells.</a> Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).</li><li>Gao, S., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+RNA+interference+high-throughput+screening+technology+in+cancer+biology+and+virology.">Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology.</a> Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).</li><li>Kilcher, S., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+approaches+to+study+virus+entry+and+infection.">Next generation approaches to study virus entry and infection.</a> Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).</li><li>Ramage, H., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+From+unbiased+genetic+screens+to+function.">Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function.</a> Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).</li><li>Mercer, J., Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+reveals+proteasome-+and+Cullin3-dependent+stages+in+vaccinia+virus+infection.">RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection.</a> Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).</li><li>Sivan, G., Martin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+role+for+nuclear+pore+proteins+in+poxvirus+morphogenesis.">Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).</li><li>Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loss+of+function+analysis+of+host+factors+Influencing+vaccinia+virus+replication+by+RNA+Interference.">A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).</li><li>Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNA+interference+screen+for+human+cell+factors+affecting+myxoma+virus+replication.">A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication.</a> J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).</li><li>Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+lentiviral+shRNA+screen+identifies+serine/arginine-rich+splicing+factor+2+as+a+determinant+of+oncolytic+virus+activity+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).</li><li>Panda, D., Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+reveals+requirement+for+host+cell+secretory+pathway+in+infection+by+diverse+families+of+negative-strand+RNA+viruses.">RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).</li><li>Lee, A. S. -. Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+small+interfering+RNA+screen+identifies+host+factors+required+for+vesicular+stomatitis+virus+infection.">A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection.</a> J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).</li><li>Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-tumor+interactome+screen+reveals+ER+stress+response+can+reprogram+resistant+cancers+for+oncolytic+virus-triggered+Caspase-2+cell+death.">Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death.</a> Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).</li><li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+arms:+Using+RNAi+screening+to+improve+oncolytic+viral+therapy.">A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).</li><li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+screening+to+enhance+oncolytic+virotherapy.">Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy.</a> Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).</li><li>Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+to+enhance+oncolytic+virus+immunotherapy.">High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy.</a> Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER:+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function.">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).</li><li>Luc, P. -. V., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINdb:+a+database+of+nuclear+protein+complexes+from+human+and+yeast.">PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast.</a> Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).</li><li>Chung, N., Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+absolute+deviation+to+improve+hit+selection+for+genome-scale+RNAi+screens.">Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+Score,+SSMD*,+z*+Score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Zhang, X. D., Lacson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+SSMD-based+false+discovery+and+false+nondiscovery+rates+in+genome-scale+RNAi+screens.">The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).</li><li>Amberkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNA+interference+screens+integrative+analysis:+towards+a+comprehensive+understanding+of+the+virus-host+interplay.">High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay.</a> World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).</li><li>Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+reproducibility+between+genome-scale+siRNA-based+screens.">Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).</li><li>Carralot, J. -. P., Ogier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+specific+edge+effect+correction+method+for+RNA+interference+screenings.">A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings.</a> Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).</li><li>Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+off-target+effects+can+be+reduced+at+concentrations+that+match+their+individual+potency.">siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).</li><li>Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+detection+and+elimination+of+systematic+error+in+high-throughput+screening.">An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening.</a> Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Savidis, G., McDougall, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Zika+virus+and+dengue+virus+dependency+factors+using+functional+genomics.">Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics.</a> Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).</li><li>Ma, H., Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Based+screen+identifies+genes+essential+for+West-Nile-virus-induced+cell+death.">A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death.</a> Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).</li><li>Zhang, R., Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses.">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li><li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens.">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li></ol>

Nous présentons ici un protocole pour l’emploi de criblage à haut débit Arni pour identifier les cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques. Ceci a été testé avec succès avec oncolytiques vaccinia virus et Maraba oncolytiques, mais, comme indiqué, il peut être adapté pour être utilisé avec d’autres virus oncolytiques ou autres virus généralement pour identifier les gènes de l’hôte qui modulent la réplication du virus. Le protocole de dépistage vise égale...

Criblage à haut débit pangénomique Arni s’est avéré pour être un outil précieux pour révéler des connaissances biologiques dans divers domaines d’études dont la biologie du virus. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont entrepris sur les cellules à grande échelle Arni dépistage pour identifier les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus (révision1,2,3,4 largement , 5 , 6 , 7). il est intéressant, un grand nombre de ces écrans ont été mené dans les cellules cancéreuses et plusieurs avec les virus qui sont des candidats de virus oncolytiques actuels y compris vaccinia virus8,9,10 , Myxome virus11, herpès simplex virus12, virus de la stomatite vésiculeuse13,14et Maraba virus15. Alors que la majorité de ces études portait sur l’identification des facteurs de l’hôte qui influent sur certains aspects de la réplication du virus et ne pas sur l’identification des produits biothérapeutiques cibles pour améliorer virales oncolytiques, données précieuses pourraient être exploitées de ces ensembles de données dans cet égard. Il est clair que le puissant potentiel d’identifier des objectifs d’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques n’a pas été pleinement exploité.
Une multitude de plates-formes de virus oncolytiques sont actuellement à l’essai dans les études précliniques et cliniques, y compris les virus herpes simplex virus, réovirus et vaccine, qui ont eu des succès tangibles dans les essais cliniques de stade avancé. Pour la majorité de ces plates-formes, des efforts ont été dirigées vers modifier les génomes de virus afin d’améliorer la thérapie. Par exemple, pour augmenter la spécificité de la tumeur, les gènes des virus spécifiques ont été supprimés ou mutés pour restreindre considérablement la réplication virale dans les cellules normales, mais pas dans les cellules tumorales. Dans certains cas, les transgènes ont été ajoutés comme GM-CSF (granulocyte and macrophage colony-stimulating factor) pour potentialiser la réponse immunitaire ou NIS (symporteur de l’iodure de sodium) pour permettre à l’imagerie in vivo et l’absorption cellulaire radioiodure pour thérapeutique fins. Cependant, il y a eu très peu de travail axé sur la manipulation des gènes de l’hôte/tumeur et explorer l’impact des gènes de l’hôte/tumeur sur la réplication du virus oncolytiques. Avec l’avènement de la technologie de criblage à haut débit, il est maintenant possible de sonder les interactions hôte-virus à l’échelle du génome et de déchiffrer les possibilités de manipuler le génome de l’hôte pour améliorer virales oncolytiques (revu en16, 17,,18).
Nous avons signalé la première étude mettant en évidence de validation pour l’utilisation de haut-débit génétique de dépistage pour identifier les cibles d’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques. Pour découvrir les gènes hôtes qui modulent Maraba virus oncolysis, un rhabdovirus oncolytiques actuellement testée en phase I et II des essais, nous avons mené écrans Arni Génome-large à travers trois lignées de cellules tumorales différentes en double avec un siARN (abrégé interférant RNA) bibliothèque de ciblage de gènes 18 12015. Analyse de la voie de succès identifiés dans les écrans a révélé enrichissement des membres des voies de réponse de stress ER (réticulum endoplasmique). Nous avons sélectionné 10 hits dans ces voies pour validation secondaire à l’aide de siARN avec des séquences de ciblage différentes de celles de l’écran principal. Dans le cadre de la validation tertiaire, nous avons réalisé une expérience de sauvetage avec IRE1α (nécessitant de l’inositol alpha enzyme 1) pour confirmer que le coup était sur la cible. In vitro et in vivo , essais à l’aide d’un inhibiteur de la petite molécule de IRE1α a entraîné oncolytiques considérablement amélioré l’efficacité.
Workenhe et al. 12 a également mené un écran de RNAi de Génome-large à l’aide d’une mise en commun shARN des gènes (abrégé hairpin RNA) Bibliothèque ciblant des gènes 16 056 afin d’identifier les facteurs de l’hôte limitant le virus de l’herpès humain de type 1 (HSV-1) mutant KM100-mediated oncolysis du sein cellules cancéreuses. Dans l’écran principal, ils ont identifié des 343 gènes la précipitation de qui conduisent à la cytotoxicité accrue de cellules infectées par le KM100 au-dessus des cellules infectées par un simulacre ; ils ont sélectionné 24 de ces gènes pour la validation secondaire. Sur les 24 gènes, 8 gènes ont été confirmés dans l’écran secondaire avec l’un d'entre eux étant SRSF2 (riche en sérine/arginine épissage facteur 2) qui a ensuite été confirmée à l’aide d’une expérience de sauvetage génétique lors de la validation tertiaire. Le groupe a ensuite pour identifier un ADN topoisomerase inhibiteur chimiothérapeutique réduit la phosphorylation de SRSF2 et a montré que le traitement de combinaison de HSV-1 KM100 avec cet inhibiteur d’avance à une survie prolongée des souris de tumeur-roulement TUBO.
Dans les études susmentionnées, un flux de travail similaire a été suivie. Chacun a commencé avec un écran de RNAi pangénomique primaire suivi d’un écran secondaire sur un certain nombre de possibilités identifiées dans l’écran principal. Ceci a été suivi par des études tertiaires validation incluse confirmant que le coup était sur la cible en effectuant génétique sauver des expériences in vitro avec ultime validation effectuée en manipulant la cible de produit génique in vivo. Dans cet article, nous fournissons tout d’abord un protocole général pour le développement et la validation d’un test de siARN-criblage haut débit, qui consiste à déterminer les conditions optimales de transfection, quantité de virus et la durée de l’infection. Nous offrons également un protocole détaillé pour effectuer un primaire un écran siARN haut débit ainsi qu’une description générale de la méthode pour effectuer la validation de l’écran secondaire et tertiaire validation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA library</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>G-005005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 384-well plate</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome SMARTpool PLK1</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>M-003290-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllStars Negative Control siRNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F15051-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution (1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3535-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1225011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7017-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37% by weight)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Sealing Film For Microplates</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>361006007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable Heat Sealing Foil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo Select (liquid dispenser)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11120621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH10000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KiNEDx Robotic Arm</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>KX-300-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat 24C Series Automated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50080227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JANUS Automated Workstation</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>AJI4M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carousel</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alps 3000 plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy

Haut débit pangénomique Arni (interférence ARN) dépistage technologie a été largement utilisée pour découvrir les facteurs de l’hôte qui ont une incidence de réplication du virus. Nous présentons ici l’application de cette technologie à découvrir sur hôte cibles qui modulent spécifiquement la réplication du virus de Maraba, un rhabdovirus oncolytiques et virus de la Vaccine dans le but d’améliorer la thérapie. Alors que le protocole a été testé pour une utilisation avec oncolytiques vaccinia virus et Maraba oncolytiques, cette approche est applicable à d’autres virus oncolytiques et peut également être utilisée pour identifier des cibles d’hôte qui modulent la réplication virale dans les cellules de mammifère en général. Ce protocole décrit le développement et la validation d’un test de criblage à haut débit Arni dans les cellules de mammifères, les considérations clés et des étapes de préparation importantes pour la réalisation d’un écran de RNAi haut débit primaire et un guide étape par étape pour réalisation d’un écran de RNAi haut débit primaire ; en outre, il décrit globalement les méthodes pour effectuer la validation de l’écran secondaire et les études de validation tertiaire. L’avantage de l’ARNi haut-débit, présélection, c’est qu’il permet de répertorier, de manière approfondie et impartiale, facteurs de l’hôte qui modulent n’importe quel aspect de la réplication du virus pour lesquels on peut se développer un test in vitro , tels que l’infectiosité, éclatement de taille, et la cytotoxicité. Il a le pouvoir de découvrir imprévues biothérapeutiques cibles basées sur les connaissances actuelles.

Une vue d’ensemble du flux de travail pour identifier des cibles pour améliorer virales oncolytiques hôte est présenté dans la Figure 1.
Tel qu’illustré à la Figure 1, la première étape essentielle à la réalisation d’un écran de RNAi de haut débit est développement de dosage. Figure 2 a fournit une disposition de plaque d...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Corps entier TEP/IRM des Patients pédiatriques : les détails qui comptent

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Un flux de travail d’intégration de données pour identifier les combinaisons de médicaments ciblant les interactions létales synthétiques

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analyse des facteurs d'expression des gènes tumoraux avec le portail Web CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans le cancer gastro-intestinal

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Un modèle murin de xénogreffe d’Ommaya pour étudier le traitement ciblé direct de la maladie leptoméningée

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...