Name: genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

इस काम के कैंसर अनुसंधान के लिए ओंटारियो संस्थान, नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन, ओटावा क्षेत्रीय कैंसर फाउंडेशन, और टेरी फॉक्स अनुसंधान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । K.J.A. एक वाणी कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति, स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए एक कनाडाई संस्थान-मास्टर पुरस्कार, और एक ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. विकास और एक उच्च प्रवाह सिरना जांच परख के सत्यापन
नोट: सभी प्रयोगों के लिए, प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए उपयुक्त Hepes-बफ़र्ड वृद्धि मीडिया का उपयोग करें । तृतीयक मांयता के लिए परख अनुकूलन से वर्?...

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	<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions?.">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li><li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+genomic+screening:+elucidating+virus-host+interactions.">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li><li>Houzet, L., Jeang, K. 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यहां हम उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग को रोजगार के लिए मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा बढ़ाने के हेरफेर किया जा सकता है की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । यह सफलतापूर्वक oncolytic Maraba वायरस और oncolytic vaccinia ?...

उच्च प्रवाह जीनोम-वाइड RNAi स्क्रीनिंग वायरस जीव विज्ञान सहित अध्ययन के विविध क्षेत्रों में जैविक अंतर्दृष्टि खुलासा करने के लिए एक अमूल्य उपकरण साबित हो गया है । पिछले एक दशक से अधिक या तो, कई समूहों सेल आधारित बड़े पैमाने पर RNAi स्क्रीनिंग के लिए बड़े पैमाने पर मेजबान जीन है कि वायरस प्रतिकृति मॉडुलन की पहचान (1,2,3,4 में समीक्षा की गई , 5 , ६ , 7). दिलचस्प है, इन स्क्रीन की एक बड़ी संख्या में कैंसर की कोशिकाओं में आयोजित किया गया है और वायरस है कि वर्तमान oncolytic वायरस के साथ कई vaccinia वायरस8,9,10 सहित उंमीदवारों , Myxoma वायरस11, दाद सिंप्लेक्स वायरस12, vesicular stomatitis वायरस13,14, और Maraba वायरस15. हालांकि इन अध्ययनों के बहुमत का ध्यान मेजबान कारकों की पहचान है कि वायरस प्रतिकृति के कुछ पहलू को प्रभावित करने और oncolytic वायरस थेरेपी को बढ़ाने के लिए, मूल्यवान डेटा इन डेटा सेट से खनन किया जा सकता है पर नहीं है पर था इस संबंध में । यह स्पष्ट है कि शक्तिशाली क्षमता मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा को बढ़ाने के लिए हेरफेर किया जा सकता है की पहचान करने के लिए पूरी तरह से शोषण नहीं किया गया है ।
oncolytic वायरस प्लेटफार्मों की बहुतायत वर्तमान में दाद सिंप्लेक्स वायरस, reovirus और vaccinia वायरस है, जो देर चरण नैदानिक परीक्षणों में प्रत्यक्ष सफलता मिली है सहित पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन में परीक्षण किया जा रहा है । इन प्लेटफार्मों के बहुमत के लिए, प्रयास करने के लिए चिकित्सा बढ़ाने के वायरस जीनोम फेरबदल की ओर निर्देशित किया गया है । उदाहरण के लिए, ट्यूमर विशिष्टता बढ़ाने के लिए, विशिष्ट वायरस जीन हटा दिया गया है या काफी सामान्य कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति प्रतिबंधित करने के लिए रूपांतरित, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं में नहीं. कुछ मामलों में, transgenes को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या NIS (सोडियम आयोडाइड symporter) शक्ति प्रदान करने के लिए जीएम-सीएसएफ (granulocyte मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर) की तरह जोड़ा गया है vivo इमेजिंग और सेलुलर radioiodide में सक्षम करने के लिए उपचारात्मक प्रयोजनों. हालांकि, वहां बहुत कम मेजबान/ट्यूमर जीन जोड़ तोड़ और oncolytic वायरस प्रतिकृति पर मेजबान/ट्यूमर जीन के प्रभाव की खोज पर ध्यान केंद्रित काम किया गया है । उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, यह अब एक जीनोम पैमाने पर जांच मेजबान वायरस बातचीत करने के लिए संभव है और करने के लिए मेजबान जीनोम में हेरफेर करने के लिए oncolytic वायरस थेरेपी (16में समीक्षित में सुधार के अवसरों को समझने के लिए, 17,18).
हम पहले के सबूत का प्रदर्शन अध्ययन की रिपोर्ट उच्च प्रवाह आनुवंशिक स्क्रीनिंग का उपयोग करने के लिए मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा बढ़ाने के हेरफेर किया जा सकता है की पहचान के लिए अवधारणा । मेजबान जीन है कि Maraba वायरस oncolysis, एक oncolytic वर्तमान में चरण मैं और द्वितीय परीक्षण में परीक्षण किया जा रहा है, हम तीन अलग ट्यूमर सेल लाइनों भर में एक RNAi (लघु सेना आरएनए) के साथ डुप्लिकेट में जीनोम चौड़ा सिरना स्क्रीन आयोजित की खोज पुस्तकालय लक्ष्यीकरण १८,१२० जीन15। स्क्रीन में पहचान की हिट के मार्ग विश्लेषण एर (endoplasmic जालिका) तनाव प्रतिक्रिया रास्ते के सदस्यों के संवर्धन का पता चला । हम प्राथमिक स्क्रीन के उन लोगों से अलग लक्ष्यीकरण दृश्यों के साथ सिरना का उपयोग कर माध्यमिक सत्यापन के लिए इन रास्ते के भीतर 10 हिट का चयन किया. तृतीयक मांयता के भाग के रूप में, हम IRE1α के साथ एक बचाव प्रयोग (inositol-एंजाइम 1 अल्फा की आवश्यकता) की पुष्टि करने के लिए कि हिट लक्ष्य पर किया गया था आयोजित की । इन विट्रो में और vivo में IRE1α का एक छोटा सा अणु अवरोधक का उपयोग कर परीक्षण नाटकीय रूप से बढ़ाया oncolytic प्रभावकारिता के परिणामस्वरूप ।
Workenhe एट अल. 12 भी एक जीनोम-वाइड RNAi स्क्रीन का उपयोग कर एक परित lentiviral shRNA (लघु hairpin आरएनए) पुस्तकालय लक्ष्यीकरण १६,०५६ जीन मानव दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1 (एचएसवी-1) उत्परिवर्ती KM100-मध्यस्थता oncolysis के सीमित कारकों की पहचान करने के लिए स्तन कैंसर की कोशिकाओं । प्राथमिक स्क्रीन में, वे 343 जीन की पहचान की पछाड़ना जो नकली संक्रमित कोशिकाओं पर KM100-संक्रमित कोशिकाओं के बढ़ाया cytotoxicity के लिए सीसा; वे माध्यमिक सत्यापन के लिए इन जीन के 24 का चयन किया । 24 जीनों में से, 8 जीन माध्यमिक स्क्रीन में उनमें से एक के साथ पुष्टि की गई SRSF2 जा रहा है (serine/arginine-अमीर ब्याह फैक्टर 2) जो बाद में तृतीयक सत्यापन के दौरान एक आनुवंशिक बचाव प्रयोग का उपयोग कर पुष्टि की थी । समूह के लिए एक डीएनए चतुर्थ तोपोइसोमेरसे अवरोध करनेवाला कीमोथेरेपी है कि SRSF2 के फास्फारिलीकरण कम की पहचान पर चला गया और पता चला कि इस अवरोधक के साथ एचएसवी-1 KM100 के संयोजन उपचार TUBO ट्यूमर असर चूहों के अस्तित्व को विस्तारित करने के लिए नेतृत्व.
aforementioned अध्ययन में, एक समान कार्यप्रवाह का पालन किया गया । प्रत्येक प्राथमिक जीनोम-वाइड RNAi स्क्रीन के साथ शुरू हुआ एक माध्यमिक स्क्रीन के द्वारा पीछा किया है की पहचान की हिट की संख्या का चयन करें प्राइमरी स्क्रीन में पहचाना । यह तृतीयक सत्यापन अध्ययन है, जो पुष्टि शामिल है कि हिट पर था परम मांयता के साथ इन विट्रो में आनुवंशिक बचाव प्रयोग प्रदर्शन से लक्ष्य vivo मेंलक्ष्य जीन उत्पाद जोड़ तोड़ द्वारा प्रदर्शन के बाद किया गया । इस अनुच्छेद में, हम पहले के विकास और सत्यापन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल प्रदान एक उच्च प्रवाह सिरना जांच परख है, जो इष्टतम अभिकर्मक शर्तों का निर्धारण शामिल है, वायरस की मात्रा, और संक्रमण की लंबाई । हम भी एक प्राथमिक एक उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माध्यमिक स्क्रीन मांयता और तृतीयक मांयता प्रदर्शन के लिए विधि का एक समग्र विवरण के संचालन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA library</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>G-005005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 384-well plate</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome SMARTpool PLK1</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>M-003290-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllStars Negative Control siRNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F15051-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution (1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3535-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1225011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7017-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37% by weight)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Sealing Film For Microplates</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>361006007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable Heat Sealing Foil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo Select (liquid dispenser)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11120621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH10000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KiNEDx Robotic Arm</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>KX-300-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat 24C Series Automated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50080227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JANUS Automated Workstation</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>AJI4M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carousel</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alps 3000 plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy

उच्च प्रवाह जीनोम-वाइड RNAi (आरएनए हस्तक्षेप) स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी व्यापक रूप से होस्ट कारकों है कि प्रभाव वायरस प्रतिकृति की खोज के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां हम मेजबान लक्ष्य है कि विशेष रूप से Maraba वायरस, एक oncolytic rhabdovirus, और चिकित्सा बढ़ाने के लक्ष्य के साथ vaccinia वायरस की प्रतिकृति मिलाना उजागर करने के लिए इस प्रौद्योगिकी के आवेदन प्रस्तुत करते हैं । जबकि प्रोटोकॉल oncolytic Maraba वायरस और oncolytic vaccinia वायरस के साथ प्रयोग के लिए परीक्षण किया गया है, इस दृष्टिकोण अन्य oncolytic वायरस के लिए लागू है और भी मेजबान लक्ष्य है कि में स्तनधारी कोशिकाओं में वायरस प्रतिकृति मॉडुलन की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है सामान्य. इस प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग के लिए एक परख के विकास और सत्यापन का वर्णन करता है, प्रमुख विचार और तैयारी एक प्राथमिक उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन के संचालन के लिए महत्वपूर्ण कदम है, और के लिए एक कदम दर कदम गाइड एक प्राथमिक उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन का आयोजन; इसके अलावा, यह मोटे तौर पर माध्यमिक स्क्रीन सत्यापन और तृतीयक सत्यापन अध्ययन के संचालन के लिए तरीकों की रूपरेखा । उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग का लाभ यह है कि यह एक कैटलॉग करने के लिए अनुमति देता है, एक व्यापक और निष्पक्ष फैशन में, मेजबान कारकों है कि वायरस प्रतिकृति के किसी भी पहलू है जो एक के लिए एक विकसित कर सकते है मॉडुलन के रूप में ऐसे infectivity के रूप में इन विट्रो परख, आकार फट, और cytotoxicity । यह वर्तमान ज्ञान के आधार पर अप्रत्याशित चिकित्सकीय लक्ष्यों को उजागर करने की शक्ति है ।

oncolytic वायरस थेरेपी को एंहांस करने के लिए होस् ट लक्ष् यों की पहचान करने के लिए कार्यप्रवाह का ओवरव्यू चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है ।
जैसा कि चित्र...

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Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

जीनोम चौड़ा RNAi स्क्रीनिंग मेजबान कारकों है कि Oncolytic वायरस थेरेपी मिलाना की पहचान करने के लिए

यहां हम उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीनिंग को रोजगार के लिए मेजबान लक्ष्य है कि oncolytic वायरस चिकित्सा, विशेष रूप से rhabodvirus और vaccinia वायरस चिकित्सा बढ़ाने के हेरफेर किया जा सकता है उजागर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, लेकिन यह आसानी से अंय oncolytic के लिए अनुकूलित किया जा सकता है वायरस प्लेटफार्मों या आम तौर पर वायरस प्रतिकृति मिलाना मेजबान जीन की खोज के लिए.

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

उपयोग कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीनिंग कैंसर सेल उपगोल संस्कृतियों में संभावित उपन्यास ड्रग लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

ट्यूमर के ऊतकों में उच्च प्रवाह चिप-अनुक्रमण का उपयोग कर क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक एकीकृत मंच

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

पूरे शरीर पीईटी/बाल रोगियों के एमआरआई: विवरण है कि बात

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

जीन परिवर्तन के लिए Murine प्रोस्टेट के लिए CRISPR गाइड के वायरस डिलिवरी

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

एक क्रोमेटिन Immunoprecipitation परख पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में उपंयास NFAT2 लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

सिंथेटिक घातक इंटरैक्शन को लक्षित करने वाले ड्रग कॉम्बिनेशन की पहचान करने के लिए एक डेटा इंटीग्रेशन वर्कफ़्लो

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

CorExplorer वेब पोर्टल के साथ ट्यूमर जीन अभिव्यक्ति कारकों का विश्लेषण

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में डीएनए मिथाइलेशन का जीनोम-वाइड विश्लेषण

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

लेप्टोमीनिंगियल रोग के प्रत्यक्ष लक्षित चिकित्सा का अध्ययन करने के लिए एक मुरीन ओमाया Xenograft मॉडल

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...