Name: genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por becas del Instituto de Ontario para la investigación del cáncer, la Fundación de Canadá para la innovación, la Fundación de cáncer Regional de Ottawa y el Instituto de investigación del zorro de Terry. K.J.A. fue apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá, un Instituto canadiense de salud investigación-Master Award y una beca de postgrado de Ontario.

1. desarrollo y validación de un siRNA de alto rendimiento, análisis de detección
Nota: Para todos los experimentos, utilizar medios de cultivo tamponado con Hepes apropiados para cada línea celular. Vea la figura 1 para un resumen del flujo de trabajo de optimización análisis de validación terciario.
<ol><li>Determinación de las condiciones óptimas de la transfección
	<ol>
<li>Seleccione una línea de células de tumor o idealmente tu...

<ol>
	<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions?.">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li><li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+genomic+screening:+elucidating+virus-host+interactions.">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li><li>Houzet, L., Jeang, K. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses.">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li><li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens.">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li></ol>

Aquí presentamos un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para identificar objetivos de host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos. Esto ha sido probado con éxito con oncolíticos Maraba virus y virus de la vaccinia oncolíticos, pero, como se ha señalado, puede ser adaptado para su uso con otros virus oncolíticos u otros virus generalmente para identificar host genes que modulan la replicación del virus. El protocolo de investigación también está dise...

Proyección de alto rendimiento genoma ARNi ha demostrado para ser una valiosa herramienta para revelar conocimientos biológicos en diversas áreas de estudio como la biología del virus. Lo largo de la última década, han realizado numerosos grupos celulares a gran escala ARNi screening para identificar ampliamente genes host que modulan la replicación del virus (revisado en1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, un gran número de estas pantallas se han realizado en células de cáncer y varios virus que son candidatos de virus oncolíticos actuales incluyendo el vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, estomatitis vesicular virus13,14y Maraba virus15. Mientras que el foco de la mayoría de estos estudios fue en la identificación de factores de huésped que influyen en algún aspecto de la replicación del virus y no en la identificación de objetivos bioterapéuticos para mejorar la terapia de virus oncolíticos, datos valiosos pueden ser extraídos de estos conjuntos de datos en este sentido. Está claro que el potencial de gran alcance para identificar objetivos de host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos no ha sido plenamente explotado.
Una gran cantidad de plataformas de virus oncolíticos se están probando en estudios clínicos y preclínicos incluyendo herpes simplex virus, reovirus y vaccinia virus, que han tenido éxito demostrable en ensayos clínicos de última etapa. Para la mayoría de estas plataformas, los esfuerzos se han dirigido hacia alterar los genomas de virus para mejorar la terapia. Por ejemplo, para aumentar la especificidad del tumor, genes de virus específico han sido eliminados o transformado para restringir significativamente la replicación viral en las células normales, pero no en las células del tumor. En algunos casos, se han añadido los transgenes como GM-CSF (factor de estimulante de colonias de macrófagos en granulocitos) para potenciar la respuesta inmune o NIS (symporter del yoduro de sodio) para permitir la proyección de imagen in vivo y la absorción celular del radioiodide para terapéutica propósitos. Sin embargo, ha habido muy poco trabajo centrado en manipular los genes del anfitrión, tumor y explorar el impacto de genes del anfitrión, tumor en la replicación de virus oncolíticos. Con el advenimiento de la tecnología de proyección de alto rendimiento, ahora es posible para sondar interacciones virus host en una escala genoma y descifrar oportunidades para manipular el genoma del anfitrión para mejorar la terapia de virus oncolíticos (revisado en16, 17,18).
Nosotros reportamos el primer estudio que prueba-de-concepto para usar la investigación para identificar los host objetivos que podrían ser manipulados para mejorar la terapia de virus oncolíticos genética de alto rendimiento. Para descubrir genes de host que modulan Maraba virus oncolysis, un rhabdovirus oncolíticos están probando en fase I y II de ensayos, realizamos pantallas de RNAi del genoma a través de tres líneas celulares de tumor diferentes por duplicado con un siRNA (short interferencia RNA) Biblioteca dirigido a 18.120 genes15. Análisis de la vía de golpes en las pantallas revelaron enriquecimiento de los miembros de las vías de respuesta de estrés de ER (retículo endoplásmico). Se seleccionaron 10 golpes de estas vías para validación secundaria usando siRNA con secuencias de objetivos diferentes de los de la pantalla principal. Como parte de la validación terciario, se realizó un experimento de rescate con IRE1α (inositol-requerir alpha enzima 1) para confirmar que el golpe estaba en blanco. In vitro y en vivo la prueba usando un inhibidor de molécula pequeña de IRE1α dio lugar a eficacia dramáticamente mejorada oncolíticos.
Workenhe et al. 12 también realizó una pantalla de RNAi del genoma con un shRNA lentivirales combinado (horquilla corto RNA) Biblioteca dirigida a 16.056 genes para identificar los factores de host restringir el virus herpes simple humano tipo 1 oncolysis de KM100-mediados de (HSV-1) de mutante de mama células cancerosas. En la pantalla principal, identificaron 343 genes la caída de que conducen a mayor citotoxicidad de células infectadas KM100 sobre células infectadas con mofa; seleccionaron 24 de estos genes para la validación secundaria. De los 24 genes, 8 genes fueron confirmados en la pantalla secundaria con uno de ellos ser SRSF2 (arginina-serina/rico empalmar factor 2) que posteriormente fue confirmado mediante un experimento de rescate genético durante la validación terciario. El grupo pasó a identificar un ADN inhibidor de la topoisomerasa quimioterapéutico que reduce la fosforilación de la SRSF2 y demostró que el tratamiento combinado de KM100 de HSV-1 con el plomo de este inhibidor a la prolongada supervivencia de ratones con tumores TUBO.
En los estudios antes mencionados, fue seguido un flujo de trabajo similar. Cada uno comenzó con una pantalla de ARNi genoma principal seguida por una pantalla secundaria en un número selecto de aciertos identificados en la pantalla principal. Esto fue seguido por el terciario validación estudios, confirmando que el golpe era en blanco realizando genética rescate de experimentos in vitro con validación definitiva realizada por manipular el objetivo gen producto en vivo. En este artículo, ofrecemos primero un protocolo general para el desarrollo y validación de un ensayo de siRNA-proyección de alto rendimiento, que consiste en determinar las condiciones óptimas de la transfección, cantidad de virus y la longitud de la infección. También ofrecemos un protocolo detallado para la realización de una primaria, una pantalla de siRNA de alto rendimiento así como una descripción general del método para realizar validación de pantalla secundario y terciario validación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA library</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>G-005005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 384-well plate</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome SMARTpool PLK1</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>M-003290-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllStars Negative Control siRNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F15051-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution (1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3535-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1225011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7017-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37% by weight)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Sealing Film For Microplates</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>361006007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable Heat Sealing Foil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo Select (liquid dispenser)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11120621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH10000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KiNEDx Robotic Arm</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>KX-300-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat 24C Series Automated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50080227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JANUS Automated Workstation</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>AJI4M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carousel</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alps 3000 plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy

Tecnología de proyección de alto rendimiento genoma ARNi (ARN de interferencia) ha sido ampliamente utilizada para descubrir factores de huésped que afectan la replicación del virus. Aquí presentamos la aplicación de esta tecnología para descubrir destinos host que modulan específicamente la replicación de Maraba virus un rhabdovirus oncolíticos y virus de la vacuna con el objetivo de mejorar la terapia. Mientras que el protocolo ha sido probado para su uso con oncolíticos Maraba virus y virus de la vaccinia oncolíticos, este enfoque es aplicable a otros virus oncolíticos y también puede ser utilizado para la identificación de objetivos de host que modulan la replicación del virus en células de mamíferos en general. Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo para la detección de alto rendimiento RNAi en células mamíferas, las consideraciones claves y pasos de preparación importantes para la realización de una pantalla principal de ARNi de alto rendimiento y una guía paso a paso para realización de una pantalla principal de ARNi de alto rendimiento; Además, describen ampliamente los métodos para llevar a cabo estudios de validación terciaria y secundaria pantalla validación. El beneficio de alto rendimiento RNAi es que permite catalogar, de una manera amplia e imparcial, factores de huésped que modulan cualquier aspecto de la replicación del virus para el cual uno puede desarrollar un ensayo en vitro como la infectividad, explosión de tamaño, y la citotoxicidad. Tiene el poder para descubrir imprevistos bioterapéuticos objetivos basados en el conocimiento actual.

Un resumen del flujo de trabajo para la identificación de objetivos de host para mejorar la terapia de virus oncolíticos se presenta en la figura 1.
Como se ilustra en la figura 1, el primer paso crítico a la realización de una pantalla de alto rendimiento RNAi es desarrollo de ensayos. Figura 2A proporciona un diseño de placa de muest...

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Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

Aquí se describe un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para descubrir destinos host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos, específicamente rhabodvirus y vaccinia virus terapia, pero puede adaptarse fácilmente a otros oncolíticos plataformas de virus o para descubrir genes de host que modulan generalmente replicación del virus.

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

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The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo

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