Name: genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Bu eser tarafından hibe Ontario Enstitüsü'nden kanser araştırmaları, Kanada Vakfı için yenilik, Ottawa bölgesel kanser Vakfı ve Terry Fox Araştırma Enstitüsü için desteklenmiştir. K.J.A. Vanier Kanada yüksek lisans burs, Sağlık Araştırma-Master's Ödülü, Kanada Enstitüsü tarafından desteklenen ve bir Ontario yüksek lisans burs.

1. geliştirme ve tahlil eleme yüksek üretilen iş siRNA doğrulama
Not: Tüm deneyler için Hepes tampon büyüme medya her hücre satırı için uygun kullanın. Tahlil optimizasyonu akışından Tersiyer doğrulama için genel bir bakış için bkz: şekil 1 .
<ol><li>En iyi transfection koşullar belirlenmesi
	<ol>
<li>Bir tümör hücre satırı seçin veya ideal satırları da transfection koşulları (örneğin 786-O, ncı-H226...

<ol>
	<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions?.">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li><li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+genomic+screening:+elucidating+virus-host+interactions.">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li><li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis.">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).</li><li>Friedel, C. C., Haas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomes+and+global+models+of+virus-infected+cells.">Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells.</a> Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).</li><li>Gao, S., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+RNA+interference+high-throughput+screening+technology+in+cancer+biology+and+virology.">Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology.</a> Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).</li><li>Kilcher, S., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+approaches+to+study+virus+entry+and+infection.">Next generation approaches to study virus entry and infection.</a> Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).</li><li>Ramage, H., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+From+unbiased+genetic+screens+to+function.">Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function.</a> Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).</li><li>Mercer, J., Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+reveals+proteasome-+and+Cullin3-dependent+stages+in+vaccinia+virus+infection.">RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection.</a> Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).</li><li>Sivan, G., Martin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+role+for+nuclear+pore+proteins+in+poxvirus+morphogenesis.">Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).</li><li>Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loss+of+function+analysis+of+host+factors+Influencing+vaccinia+virus+replication+by+RNA+Interference.">A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).</li><li>Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-genome+RNA+interference+screen+for+human+cell+factors+affecting+myxoma+virus+replication.">A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication.</a> J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).</li><li>Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+lentiviral+shRNA+screen+identifies+serine/arginine-rich+splicing+factor+2+as+a+determinant+of+oncolytic+virus+activity+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).</li><li>Panda, D., Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+reveals+requirement+for+host+cell+secretory+pathway+in+infection+by+diverse+families+of+negative-strand+RNA+viruses.">RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).</li><li>Lee, A. S. -. Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+small+interfering+RNA+screen+identifies+host+factors+required+for+vesicular+stomatitis+virus+infection.">A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection.</a> J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).</li><li>Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-tumor+interactome+screen+reveals+ER+stress+response+can+reprogram+resistant+cancers+for+oncolytic+virus-triggered+Caspase-2+cell+death.">Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death.</a> Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).</li><li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+arms:+Using+RNAi+screening+to+improve+oncolytic+viral+therapy.">A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).</li><li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+screening+to+enhance+oncolytic+virotherapy.">Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy.</a> Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).</li><li>Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+to+enhance+oncolytic+virus+immunotherapy.">High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy.</a> Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER:+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function.">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).</li><li>Luc, P. -. V., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINdb:+a+database+of+nuclear+protein+complexes+from+human+and+yeast.">PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast.</a> Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).</li><li>Chung, N., Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+absolute+deviation+to+improve+hit+selection+for+genome-scale+RNAi+screens.">Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+Score,+SSMD*,+z*+Score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Zhang, X. D., Lacson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+SSMD-based+false+discovery+and+false+nondiscovery+rates+in+genome-scale+RNAi+screens.">The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).</li><li>Amberkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNA+interference+screens+integrative+analysis:+towards+a+comprehensive+understanding+of+the+virus-host+interplay.">High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay.</a> World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).</li><li>Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+reproducibility+between+genome-scale+siRNA-based+screens.">Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).</li><li>Carralot, J. -. P., Ogier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+specific+edge+effect+correction+method+for+RNA+interference+screenings.">A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings.</a> Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).</li><li>Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+off-target+effects+can+be+reduced+at+concentrations+that+match+their+individual+potency.">siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).</li><li>Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+detection+and+elimination+of+systematic+error+in+high-throughput+screening.">An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening.</a> Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).</li><li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies:+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions.">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).</li><li>Savidis, G., McDougall, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Zika+virus+and+dengue+virus+dependency+factors+using+functional+genomics.">Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics.</a> Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).</li><li>Ma, H., Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Based+screen+identifies+genes+essential+for+West-Nile-virus-induced+cell+death.">A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death.</a> Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).</li><li>Zhang, R., Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses.">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li><li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens.">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li></ol>

Burada yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için istihdam için bir iletişim kuralı mevcut. Bu başarıyla oncolytic Maraba virüs ve oncolytic vaksinia virüs ile test edilmiştir ama belirtildiği gibi bu diğer oncolytic virüsler veya diğer virüsler ile kullanmak için genellikle virüs çoğaltma modüle ana bilgisayar genlerin tanımlamak için adapte edilebilir. Tarama protokolü de yayılmasını azaltabilir veya artıra...

Yüksek işlem hacmi genom çapında RNAi tarama çalışmanın virüs Biyoloji de dahil olmak üzere çeşitli alanlarda biyolojik anlayışlar ifşa için paha biçilmez bir araç olarak kanıtlamıştır. Son on yıl ya da daha fazla, çok sayıda gruplar hücre tabanlı büyük ölçekli RNAi yoğun virüs çoğaltma (1,2,3,4 yorum modüle ana bilgisayar genlerin tanımlamak için eleme üstlendik , 5 , 6 , 7). İlginçtir, bu ekranlar, çok sayıda gerçekleştirdik kanser hücrelerinin ve birkaç vaksinia virüs8,9,10 da dahil olmak üzere geçerli oncolytic virüs aday olan virüs ile , Miksoma virüs11, herpes simpleks virüs12, vesicular Stomatit virüs13,14ve Maraba virüs15. Bu çalışmaların çoğu odak virüs çoğaltma bazı yönlerini etkileyen ana faktörler tanımlama ve oncolytic virüs tedavisi arttırmak için biotherapeutic hedef belirlemekle değil iken, değerli veri içinde bu veri kümelerinden mayınlı Bu konuda. Bu oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için güçlü potansiyel tam olarak istismar olmayan ki açıktır.
Oncolytic virüs platformlarına bir bolluk şu anda test ediliyor hangi gözle son aşama klinik çalışmalarda başarıya sahiptir herpes simpleks virüs, reovirus ve vaksinia virüsü, dahil olmak üzere preklinik ve klinik çalışmalar. Bu platformlar çoğunluğu için çabaları virüs genleri değiştirerek doğru tedavi geliştirmek için yönetti. Örneğin, tümör özgüllüğü artırmak için belirli virüs genleri silinmiş veya önemli ölçüde viral çoğaltma normal hücreleri ama tümör hücreleri kısıtlamak için mutasyona uğramış. Bazı durumlarda, transgenes GM-bağışıklık yanıtı artırmak için CSF (granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör) içinde vivo görüntüleme ve hücresel radioiodide alımı etkinleştirmek için NIS (sodyum iyodür simporter) gibi için eklenmiş olabilir veya tedavi amaçlar. Ancak, ana bilgisayar/tümör genler manipüle ve oncolytic virüs çoğaltma ana bilgisayar/tümör genler etkilerini keşfetmek odaklanmış çok az çalışma olmuştur. Yüksek üretilen iş tarama teknoloji çıkışıyla, şimdi ana bilgisayar virüs etkileşimleri bir genom ölçekte soruşturma için ve oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için ana bilgisayar genom işlemek için fırsatlar deşifre etmek mümkündür (16', gözden 17,18).
Biz ilk çalışma gösteren,-yüksek-den geçerek oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için eleme genetik kullanmak için prototip bildirdi. Maraba virüs oncolysis, bir oncolytic rhabdovirus aşamasında sınanmakta modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için ı ve II denemeler, biz genom çapında RNAi ekranlar yinelenen bir siRNA (kısa RNA müdahale) ile üç farklı tümör hücre hatları üzerinden yapılan Kütüphane 18,120 genler15hedefleme. Ekranları tespit sayısı yolu analizini zenginleştirme ER (endoplazmik retikulum) stres yanıt yolları üyelerinin saptandı. Biz 10 hits içinde bu yollar bu birincil ekranın farklı hedefleme serileri ile siRNA kullanarak ikincil doğrulama için seçildi. Tersiyer doğrulama bir parçası olarak, biz bir kurtarma IRE1α ile deney (hit hedef olduğunu onaylamak için inositol gerektiren enzim 1 alfa). Vitro ve in vivo küçük molekül inhibitörü olan IRE1α kullanarak test önemli ölçüde geliştirilmiş oncolytic etkinlik sonuçlandı.
Workenhe vd. 12 de yürütülen bir havuza alınan lentiviral shRNA (kısa saç tokası RNA) kullanarak bir genom geniş RNAi perde 1 (HSV-1) mutant KM100-aracılı oncolysis meme tür kitaplığına insan herpes simpleks virüsü kısıtlayan ana faktörleri tanımlamak için 16,056 genler hedefleme kanser hücreleri. Birincil ekranında, sahte enfekte hücreleri üzerinde gelişmiş sitotoksisite KM100 enfekte hücre için hangi yol nakavt 343 genleri tespit; 24 bu genlerin ikincil doğrulama için seçtikleri. 24 genlerin dışarı 8 genler bir tanesi ile ikincil ekranında teyit edildi daha sonra üçüncül doğrulama sırasında bir genetik kurtarma deneyi kullanarak teyit edildi (serin/arginin-zengin Uçbirleştirme faktör 2) SRSF2 olmak. Grup SRSF2 fosforilasyon azaltılmış ve HSV-1 KM100 kombinasyon tedavisi ile genişletilmiş TUBO tümörü taşıyan fareler yaşama bu inhibitörü yol gösterdi ki bir DNA topoizomeraz inhibitörü ilaçlar tanımlamak için devam etti.
Söz konusu çalışmalarda, benzer bir iş akışı izledi. Her birincil ekran tanımlanan sayısı belirli bir sayıda tarafından ikinci bir ekran izledi birincil bir genom geniş RNAi perde ile başladı. Bu hit hedef üzerinde olduğunu onaylayan dahil Tersiyer doğrulama çalışmaları tarafından izledi genetik gerçekleştirerek deneyleri içinde vitro hedef gen ürün içinde vivomanipüle ederek son doğrulaması ile kurtarma. Bu makalede, biz ilk bir genel protokol geliştirme ve en iyi transfection koşulları, virüs miktarı ve enfeksiyon uzunluğunu belirleme içerir yüksek üretilen iş siRNA-tarama testin doğrulama için sağlar. Ayrıca birincil yürütmek için detaylı bir protokol yönteminin ikinci ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama gerçekleştirmek için genel bir açıklama yanı sıra yüksek üretilen iş siRNA ekran sunuyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA library</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>G-005005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 384-well plate</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome SMARTpool PLK1</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>M-003290-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllStars Negative Control siRNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH Glucose</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F15051-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution (1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3535-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1225011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7017-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37% by weight)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Sealing Film For Microplates</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>361006007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peelable Heat Sealing Foil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo Select (liquid dispenser)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11120621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH10000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KiNEDx Robotic Arm</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>KX-300-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat 24C Series Automated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50080227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JANUS Automated Workstation</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>AJI4M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carousel</td>
			<td>Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alps 3000 plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide rnai screening to identify host factors that modulate oncolytic virus therapy

Yüksek işlem hacmi genom çapında RNAi (RNA müdahale) tarama teknoloji virüs çoğaltma etkileyen ana faktörler keşfetmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada bu teknoloji uygulama özellikle Maraba virüs, bir oncolytic rhabdovirus ve vaksinia virüs çoğaltma terapi artırılması amacı ile modüle ortaya çıkarılması ana hedefleri için mevcut. Protokol oncolytic Maraba virüs ve oncolytic vaksinia virüs ile kullanım için test edilmiştir, bu yaklaşım diğer oncolytic virüsler için uygulanabilir ve ayrıca virüs çoğaltma memeli hücrelerinde modüle ana hedefleri belirlemek için yararlı olabilir Genel. Geliştirme ve doğrulama için yüksek üretilen iş RNAi tarama memeli hücrelerinde, kritik noktalar ve hazırlık adımları bir birincil yüksek üretilen iş RNAi ekran ve bir adım adım kılavuz için yürütmek için önemli bir testin Bu protokolünü açıklar birincil bir yüksek-den geçerek RNAi ekran yürütülmesi; Buna ek olarak, genel olarak ikincil ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama çalışmaları yürütmek için yöntemleri özetlenmektedir. Bir katalog, bir kapsamlı ve tarafsız biçimde, virüs çoğaltma için bir infektivite gibi bir vitro tahlil geliştirmek herhangi bir yönünü modüle ana faktörler sağlar tarama olduğu yüksek üretilen iş RNAi yararına veri bloğu boyutu, ve sitotoksisite. Güç biotherapeutic hedefleri beklenmedik geçerli bilgiye dayalı ortaya çıkarmak için vardır.

Oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için ana hedefleri tanımlamak için iş akışı genel bakış şekil 1' de sunulmuştur.
Şekil 1' de gösterildiği gibi bir yüksek-den geçerek RNAi ekran yürütülmesi için kritik ilk adım tahlil gelişmedir. Şekil 2A transfection en iyi duruma getirme tahlil için bir örnek plaka düzeni s...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy at JoVE.com

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Tüm vücut PET/MRG Pediatrik hastalarda: fark Ayrıntılar

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedefleyen İlaç Kombinasyonlarını Tanımlamak için Veri Entegrasyonu İş Akışı

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

CorExplorer Web Portalı ile Tümör Gen Ekspresyonu Faktörlerinin Analizi

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

Gastrointestinal Kanserde DNA Metilasyonunun Genom Çapında Analizi

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal Hastalığın Doğrudan Hedefli Tedavisini Incelemek için Bir Murine Ommaya Xenograft Modeli

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...