Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות המחלקה לנוירוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דיוק ו- Office של דין עבור המדע הבסיסי, אוניברסיטת דיוק. אנו מודים גם חברי הגרעין וקטור ויראלי הדוכס להערות על כתב היד. פלסמיד pLenti CRISPRv2 היה מתנה ג'אנג פנג (במכון). מערכת LV-האריזה כולל את psPAX2 פלסמידים, VSV-G, pMD2.G, pRSV-Rev היה מתנה נחמדה Trono דידייה (EPFL, שווייץ). תמיכה כספית עבור עבודה זו העניקה של דרום קרוליינה מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, להעניק RDF18080-E202 (B.K).

1. culturing HEK-293T תאים ותאים זריעה על תרביות תאים
הערה: כליות עובריים אנושיים 293T (HEK-293T) התאים גדלים DMEM, מדיה גלוקוז גבוהות בתוספת 10% שור עגל סרום בתוספת ברזל וצמיחה היזמים, 1 x פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic (פתרון x 100 מכיל 10,000 יחידות פניצילין סטרפטומיצין 10 מ ג, 25 µg שהוא גוסס B לכל מ"ל). התקשור...

<ol>
	<li>Horvath, P., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas,+the+immune+system+of+bacteria+and+archaea.">CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.</a> Science. 327 (5962), 167-170 (2010).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference:+RNA-directed+adaptive+immunity+in+bacteria+and+archaea.">CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea.</a> Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Bellec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+inactivation+by+lentiviral+vector-mediated+RNA+interference+and+CRISPR-Cas9+genome+editing+in+human+airway+epithelial+cells.">CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells.</a> Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+hepatitis+B+virus+DNA+accumulation+in+chronically+infected+cells+using+a+bacterial+CRISPR/Cas+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease.</a> Virology. 476, 196-205 (2015).</li><li>Roehm, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HSV-1+Replication+by+Gene+Editing+Strategy.">Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy.</a> Sci Rep. 6, 23146 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5+gene+disruption+via+lentiviral+vectors+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA+renders+cells+resistant+to+HIV-1+infection.">CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection.</a> PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).</li><li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system.">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Adv Genet. 87, 125-197 (2014).</li><li>Lebbink, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+CRISPR/Cas9+gene-editing+approach+can+halt+HIV+replication+and+prevent+viral+escape.">A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape.</a> Sci Rep. 7, 41968 (2017).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+CCR5+Ablation+in+Human+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+Confers+HIV-1+Resistance+In+Vivo.">CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.</a> Mol Ther. , (2017).</li><li>Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Disruption+of+VEGF-A+Expression+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Using+CRISPR-Cas9+Endonuclease.">Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).</li><li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).</li><li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+Cas9+nuclease+specificity.">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Schaefer, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+mutations+after+CRISPR-Cas9+editing+in+vivo.">Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.</a> Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).</li><li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing.">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy.">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li><li>Nelson, C. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Delivery+Vehicles+for+Genome+Editing.">Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).</li><li>Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylation+in+293GPG+packaging+cell+line+improves+the+production+of+self-inactivating+MLV-derived+retroviral+vectors.">Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors.</a> Virol J. 3, 27 (2006).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Genome+Editing+Reagents+to+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cells.">Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).</li><li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector.">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li><li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection.">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li><li>Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR/Cas9-Mediated+Gene+Editing.">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).</li><li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted,+nonintegrating+lentiviral+vector.">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).</li><li>Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+of+live,+attenuated+human+immunodeficiency+virus+type+1+vaccine+strains.">Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains.</a> J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).</li><li>Gomez-Gonzalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatitis+B+virus+X+protein+induces+HIV-1+replication+and+transcription+in+synergy+with+T-cell+activation+signals:+functional+roles+of+NF-kappaB/NF-AT+and+SP1-binding+sites+in+the+HIV-1+long+terminal+repeat+promoter.">The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1.">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li><li>Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+distinct+alpha+subunits+of+GABAA+receptor+regulates+inhibitory+synaptic+strength.">Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength.</a> J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).</li><li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity.">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li><li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li><li>Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+residual+promoter+activity+in+gamma-retroviral+self-inactivating+(SIN)+vectors.">Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors.</a> Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).</li><li>. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations Available from: <a target="_blank" href="https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf">https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf</a> (2017)</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2017)</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome.">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9.">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li></ol>

IDLVs החלו להסתמן כמו הרכב של ויוו ג'ין-עריכה, במיוחד בהקשר של מחלות גנטיות, בעיקר בשל הסיכון נמוך מוטגנזה מכוונת המשויך וקטורים אלה בהשוואה שילוב פלטפורמות משלוח22 , 28. בחוברת הנוכחית חיפשנו לפרט פרוטוקול המשויך הייצור של המערכת IDLV-CRISPR/Cas9 ה-all-in-one משופרת שפ...

ג'ין מדויק עריכה צורות היסוד של התקדמות גדולה ביו המערבות הפיתוח של אסטרטגיות מקוריות כדי להתמודד עם מחלות גנטיות. At בחזית טכנולוגיות לעריכת ג'ין היא השיטה להסתמך על השימוש clustered regularly -אניnterspaced sהורט palindromic repeats (CRISPR) / מערכת Cas9 היה מזוהה תחילה רכיב של חיידקי חסינות מפני הפלישה של החומר הגנטי הנגיפי (נבדקה הפניות1,2). יתרון גדול של מערכת CRISPR/Cas9 על עריכת הגן כלים אחרים, כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFNs) ו- nucleases אפקטור activator דמוי שעתוק (TALENs) (נבדקה הפניה3), הוא הפשטות היחסית של פלסמיד עיצוב ו בניית רכיבים CRISPR — תכונה יש מופעל הרחבת גן לעריכת ממעבדות מיוחדים כמה רחב יותר לקהילה מחקר רב. בנוסף, הפשטות של תכנות CRISPR/Cas9 ואת יכולת זיהוי המטרה מרובבת יש נוספת מונעת את הפופולריות שלו כטכנולוגיה חסכוניים, קל לשימוש. בין השיטות השונות לרשות החוקרים למסור לרכיבים אלה לעריכת ג'ין תאים, וקטורים ויראלי נותרו עד כה במערכת הפופולרית והיעילה ביותר.
Lentiviral וקטורים (אותו) הופיעו כמו הרכב של לספק את הרכיבים של CRISPR/Cas9 מערכת ויוו עבור יישומים שונים ומגוונים4,5,6,7. מספר תכונות מפתח להפוך אותו בחירה פופולרית עבור תהליך זה כולל את היכולת שלהם להדביק החלוקה הלא-חלוקת תאים, immunogenicity נמוך, והן רעילות מינימלית הסלולר (נבדקה הפניה8). כתוצאה מכך, LV בתיווך ריפוי גנטי כבר מועסקים בטיפולים של מחלות זיהומיות, כגון HIV-1, HBV ו- HSV-1, כמו גם את התיקון של פגמים הבסיסית האנושית מחלות תורשתיות, כגון סיסטיק פיברוזיס, ניאו-וסקולרית ניוון מקולרי 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Moreover, הזינו אותו ביעילות שונו כדי לבצע ג'ין מולטיפלקס העריכה ברורים לוקוסים גנומית באמצעות מערכת של וקטור יחידה12.
עם זאת, המאפיין הטבועה של אותו לשלב לתוך הגנום המארח יכול להיות מוטגן, לעיתים קרובות מגבילה את השירות שלהם בתור כלי רכב משלוח transgene, במיוחד בהגדרות קליני. יתר על כן, מאז אותו משולבת stably אקספרס transgenes שלהם ברמה גבוהה בר קיימא, מערכת זו היא נועד למסירה של עריכת ג'ין רכיבים כגון CRISPR/Cas9; ביטוי של Cas9-מדריך RNA (gRNA), חלבונים דומים כגון ZFNs, קשורים עם רמות גבוהות של חופש-יעד אפקטים, הכוללים מוטציות לא רצויים13,14,15,16 , 17 פוטנציאלי יכול לשפר את cytotoxicity18. כדי להשיג דיוק לעריכת ג'ין עם תופעות מינימליות את המטרה, לכן לבריאותה של עיצוב מערכות המאפשרות עבור הביטוי ארעית של ג'ין עריכה רכיבים.
בשנים האחרונות פותחו מגוון רחב של פלטפורמות משלוח לבטא transiently CRISPR/Cas9 תאים16,19,20,21 (נבדקה הפניה22). אלה כוללים שיטות המסתמכות על ישירות ידביקו מטוהרים Cas9 יחד עם RNAs המדריך המתאים תאים, אשר הוצגה להיות יעילה יותר ממוקד לעריכת ג'ין לעומת תקנים בתיווך פלסמיד16. מחקרים הראו כי ribonucleoprotein (RNP) מתחמי המורכב מדריך RNA/Cas9 החלקיקים מופעלים במהירות לאחר תיווכה ביקוע DNA במטרות שלהם, רומז כי הביטוי לטווח קצר של רכיבים אלה מספיקה להשיג גנים חזקים עריכה16. . שכעיקרון, שילוב שאינו וקטור ויראלי פלטפורמות כגון adeno-הקשורים וקטורים ויראלי (AAVs) יכול לספק אלטרנטיבה מעשית כדי לספק מכונות לעריכת גנים לתאים. למרבה הצער, AAV capsids בעלי יכולת אריזה נמוך משמעותית מאשר אותו (< 5kb), אשר פוגעת קשות ביכולתם כדי לארוז את ערכת הכלים CRISPR רב רכיבים בתוך וקטור יחידה (נבדקה הפניה8). ראוי לציין כי תוספת של תרכובות היסטון deacetylases (למשל, נתרן butyrate23) לעכב או לעצור את מחזור התא (למשל, קפאין24) הוכחו להגביר את lentiviral titers. למרות התקדמות האחרונות, המערכות ביטוי ארעי פיתחה עד כה הם עדיין מובן חסרונות מספר, כגון יעילות ייצור נמוכה יותר, אשר להוביל titers ויראלי מופחתת ויעילות נמוכה התמרה חושית של וירוסים שנוצר דרך כך ניגש25.
וקטורים lentiviral חשוכת-Integrase (IDLVs) מייצגים לקידום המשמעותי בפיתוח של ג'ין-מסירה רכב, המשלבים את היכולת אריזה של אותו עם ערך מוסף כמו AAV תחזוקה episomal בתאים. תכונות אלה מסייעות IDLVs במידה רבה לעקוף את הנושאים העיקריים הקשורים עם שילוב של וקטורים, ושהבנק vis ביטוי רציף של פוטנציאל genotoxic רכיבים, המוטגניות בתיווך אינטגרציה. בעבר הוכח כי ניתן לשנות בהצלחה IDLVs כדי לשפר את ג'ין episomal ביטוי26,27. לגבי משלוח בתיווך IDLV CRISPR/Cas9, ייצור נמוך titers וביטוי התחתון של הגנום בעקיצות episome ביחס למערכות lentiviral integrase שולטים מגביל את השירות שלהם פיד ה בונה כלי להעברת לעריכת הגנום בונה מהונדס. לאחרונה להדגים כי הביטוי transgene והן titers ויראלי המשויך IDLV ייצור באופן משמעותי משופר על ידי הכללת מחייב אתרים עבור גורם שעתוק Sp1 בתוך קלטת הביטוי ויראלי28. IDLVs ששונה robustly הנתמכים בתיווך CRISPR גן לעריכת במבחנה (בתאים HEK-293T) והן ויוו (בתוך הנוירונים במוח mitotic פוסט), תוך גרימת מוטציות את המטרה מזערית בהשוואה המתאימה בתיווך ICLV מערכות28. בסך הכל, פיתחנו רומן, ערכת CRISPR קומפקטי, ה-all-in-one נישא על פלטפורמה IDLV, התווה את יתרונות שונים של שימוש כזה משלוח הרכב לעריכה ג'ין משופרת.
כאן, פרוטוקול הייצור של המערכת IDLV-CRISPR/Cas9 הוא כמתואר לעיל, כולל את השלבים השונים הכרוכים הרכבה, היטהרות, ריכוז, וכן טיטור של IDLVs, כמו גם אסטרטגיות כדי לאמת את היעילות לעריכת גנים של וקטורים אלה. פרוטוקול זה בקלות להרחבה כדי לענות על הצרכים של חוקרים שונים והוא נועד ליצור בהצלחה LV וקטורים עם titers בטווח של 1 x 1010 יחידות (טו) transducing / mL. הווקטורים שנוצר באמצעות פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ביעילות תדביק את מספר סוגי תאים שונים, לרבות קשה-עד-מגלי בתאי גזע עובריים, תאים hematopoietic (תאי-T ו מקרופאגים), ותרבותית, vivo- נוירונים מוזרק. יתר על כן, הפרוטוקול היא באותה מידה מותאם היטב עבור הייצור של וקטורים lentiviral integrase-המוסמכת בכמויות דומות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> איור 1: אריזה IDLV. (א) סכמטית פראי סוג integrase חלבון (ב') פלסמיד ששונה נבעה psPAX2 (ראה שיטות בנייה פלסמיד לפרטים). נציג agarose ג'ל תמונה של שיבוטים איבחון integrase מוטציה שיבוטים. דגימות די אן איי המוכנים דנ א פלסמיד רגיל בידוד ערכת מיני נותחו על ידי עיכול עם EcoRV ו- SphI. מתעכל כראוי השיבוט (מס ' 5, תיבת אדום מקווקו) נוסף אומתה על ידי רצף ישיר (סנגר) עבור החלפה D64E ב INT. בקלטת האריזה לקויה integrase נקרא pBK43. (ג) תיאור סכמטי של פרוטוקול תקנים ארעי מועסקים ליצירת וקטורים IDLV-CRISPR/Cas9, מציג 293T תאים transfected עם VSV-G, אריזה transgene קלטות (Sp1-CRISPR/Cas9 ה-all-in-one פלסמיד). נגיפים זה באד של קרום התא להכיל את הרנ א באורך מלא של וקטור (הביע מ הקלטת transgene). הדור השני של מערכת IDLV-אריזה שימש, אשר כוללת את חלבוני Tat, הכומר Rev ביטוי נוסף מצורפים מ קלטת נפרדת (RSV-REV-פלסמיד). Abbrev: משמאל לימין-ארוך-מסוף stomatitis vesicular אני חוזר, VSV-G, וירוס גרם חלבון, יזם pCMV-cytomegalovirus; סרקומה ראוז יזם וירוס (RSV); הכנה-(רכיב תשובה Rev). רכיבים אחרים רגולטוריות בקלטת ביטוי כוללות אתרים מחייב Sp1, רכיב Rev תשובה (הכנה), מרמיטה הפטיטיס וירוס Posttranscriptional תקינה רכיב (WPRE), מקדם 1α גורם התארכות הליבה (EFS-NC), האריזה וקטור רכיב ψ (psi), אנושי המקדם Cytomegalovirus (hCMV) ויזם U6 אנושי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

וקטורים lentiviral הם הבחירה האידיאלית עבור אספקת רכיבים לעריכת גנים בתאים עקב שטמונה בהם stably transducing רחבה של תאים, מתווכים רמות גבוהות של ביטוי גנים. עם זאת, היכולת שלהם להשתלב הגנום של התא המארח מגבירה את הסיכון המוטגניות insertional ובכך מעלה חששות בטיחות, מגביל את שימושם בהגדרות קליניים. עוד, הביטוי מתמיד של רכיבים לעריכת גנים מועברים על ידי הללו עליות וקטורים אינטגרציה-כשיר lentiviral (ICLVs) ההסתברות של ג'ין מופקר מיקוד. כחלופה, דור חדש של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) פותחה הנותן מענה הרבה חששות אלה. כאן הפרוטוקול הייצור של פלטפורמה IDLV חדשות ומשופרות בתיווך CRISPR גן עריכה של רשימת הצעדים מעורב הטיהור, שמתואר הריכוז של וקטורים כזה שלהם התמרה חושית ואת יעילות לעריכת הגן באמצעות HEK-293T הודגם תאים. פרוטוקול זה הוא שניתן להרחבה בקלות והוא יכול לשמש כדי ליצור IDLVs כייל נוגדנים גבוה כי הם מסוגלים transducing תאים בתוך חוץ גופית ו vivo בתוך. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לייצור של ICLVs.

אימות של נוקאאוט-היעילות של וקטורים IDLV-CRISPR/Cas9 השתמשנו GFP-לבטא 293T תאים כמודל כדי לאמת את היעילות של CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי. GFP + תאים נוצרו על ידי התמרה חושית של תאים HEK-293T עם pLenti-GFP (vBK201a)-MOI של 0.5 (איור 3b, "לא-וירוס" לוח). הקלטת sgRNA-כדי-GFP/Cas9 ה-all-in-one וקט...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

אנו מתארים את האסטרטגיה הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) בתור כלי רכב להעברת CRISPR/Cas9 לתאים. עם היכולת לתווך ג'ין מהיר וחזק עריכה בתאים, IDLVs להציג דרך בטוחה יותר, פלטפורמה וקטור יעיל באותה מידה המסירה הגן לעומת integrase-המוסמכת וקטורים.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...