Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il dipartimento di neurobiologia, Duke University School of Medicine e del decanato per scienza di base, Duke University. Ringraziamo anche i membri del nucleo vettore virale Duke per commenti sul manoscritto. Plasmide pLenti CRISPRv2 era regalo da Feng Zhang (Broad Institute). Il sistema di LV-imballaggio tra cui il psPAX2 di plasmidi, VSV-G, pMD2.G e OSPRO-Rev è stato un regalo gentile da Didier Trono (EPFL, Svizzera). Sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito dall'Università di South Carolina School Of Medicine, concedere RDF18080-E202 (Bambi).

1. coltura delle cellule HEK 293T e semina di cellule per la transfezione
Nota: Rene embrionale umano 293T cellule (HEK 293T) sono coltivate in DMEM, media alto glucosio completato con siero di vitello 10% completato con promotori di crescita e di ferro e 1 x soluzione antibiotico antimicotico (100 x soluzione contiene penicillina di 10.000 unità la streptomicina 10 mg e 25 µ g amfotericina B / mL). I mezzi di comunicazione è anche completato con 1 x sodio piruvato, mix di aminoacidi non esse...

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IDLVs hanno cominciato ad emergere come il veicolo della scelta per in vivo gene-editing, soprattutto nel contesto delle malattie genetiche, in gran parte a causa del basso rischio di mutagenesi associata con questi vettori rispetto all'integrazione di piattaforme di consegna22 , 28. nel manoscritto attuale, abbiamo cercato di dettagliare il protocollo associato alla produzione del migliore sistema IDLV-CRISPR/Cas9 all-in-one che recentemente è stato sv...

Gene preciso editing costituisce la pietra miliare dei principali progressi biomedici che coinvolgono lo sviluppo di nuove strategie per affrontare le malattie genetiche. At l'avanguardia delle tecnologie di modifica del gene è il metodo basandosi sull'uso della clustered regularly -ionterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema di Cas9 che inizialmente è stato identificato come componente dell'immunità batterica contro l'invasione di materiale genetico virale (rivisto in riferimenti1,2). Un grande vantaggio del sistema CRISPR/Cas9 rispetto ad altri strumenti di modifica del gene, quali nucleasi a dita di zinco (ZFNs) e nucleasi di attivatore-come effettore di trascrizione (TALENs) (rivista in riferimento3), è la relativa semplicità del design di plasmide e costruzione di componenti CRISPR — una caratteristica che ha alimentato l'espansione del gene-editing da pochi laboratori specializzati per una comunità di ricerca molto più ampia. Inoltre, la semplicità di programmazione CRISPR/Cas9 e la sua capacità per riconoscimento multiplex target hanno ulteriormente alimentato la sua popolarità come una tecnologia conveniente e facile da usare. Tra i vari metodi disponibili per i ricercatori di consegnare tali componenti modifica del gene delle cellule, vettori virali restano di gran lunga il sistema più popolare ed efficace.
Vettori lentivirali (LVs) sono emersi come il veicolo della scelta per fornire i componenti di CRISPR/Cas9 sistema in vivo per diverse applicazioni4,5,6,7. Diverse caratteristiche chiave rendono LVs una scelta popolare per questo processo inclusa la capacità di infettare sia separazione e divisione di celle, bassa immunogenicità e minima tossicità cellulare (rivisto in riferimento8). Di conseguenza, la terapia genica mediata da LV è stata impiegata nei trattamenti di malattie infettive come l'HIV-1, HBV e HSV-1, come pure nella correzione dei difetti alla base di malattie ereditarie umane, come la fibrosi cistica e degenerazione maculare neo-vascolare 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Inoltre, LVs sono stati modificati in modo efficace per eseguire multisala gene editing presso distinti loci genomici utilizzando un singolo vettore sistema12.
Tuttavia, la proprietà intrinseca di LVs per integrare nel genoma ospite possa essere mutagenica e spesso ostacola la loro utilità come veicoli di consegna del transgene, specialmente nelle regolazioni cliniche. Inoltre, poiché LVs stabilmente integrato esprimono loro transgeni a livelli elevati in modo sostenibile, questo sistema è inadeguato per la consegna del gene di modifica di componenti quali CRISPR/Cas9; sovraespressione di RNA Cas9-guida (gRNA) e di proteine simili come ZFNs, sono associati con i livelli elevati di effetti fuori bersaglio, che comprendono mutazioni indesiderate13,14,15,16 , 17 e può potenzialmente migliorare la citotossicità18. Pertanto, per raggiungere precisi gene-editing con effetti minimi fuori bersaglio, è imperativo per progettare sistemi che consentono l'espressione transitoria del gene componenti editing.
Negli ultimi anni, una varietà di piattaforme di distribuzione sono stati sviluppati per esprimere transitoriamente CRISPR/Cas9 in cellule16,19,20,21 (recensione in riferimento22). Questi includono metodi che si basano sull'introduzione direttamente Cas9 purificata con il RNAs guida appropriata nelle cellule, che è stato indicato per essere più efficace al gene-editing mirato rispetto al plasmide-mediata transfezione16. Gli studi hanno dimostrato che ribonucleoproteina (RNP) complessi costituiti guidano RNA/Cas9 particelle sono girate rapidamente dopo che mediano la fenditura del DNA alle loro destinazioni, suggerendo che a breve termine espressione di questi componenti è sufficiente per raggiungere gene robusto16di editing. In teoria, non integrando piattaforme vettore virale adeno-associato di vettori virali (AAVs) in grado di fornire una valida alternativa per fornire macchinari modifica del gene alle cellule. Purtroppo, capsidi AAV possiedono capacità di imballaggio significativamente più bassa rispetto alla LVs (< 5kb), che ostacola gravemente la loro possibilità di confezionare il toolkit multi-componente CRISPR all'interno di un singolo vettore (rivisto in riferimento8). Vale la pena notare che l'aggiunta di composti che inibiscono istone deacetilasi (ad es., sodio butirrato23) o ostacolare il ciclo cellulare (per esempio, caffeina24) hanno dimostrato di aumentare i titoli lentivirali. Nonostante i recenti progressi, i sistemi di espressione transiente sviluppati finora sono ancora ostacolati da varie carenze, come l'efficienza di produzione inferiore, che portano a titoli virali ridotti e l'efficienza di trasduzione basso dei virus generato attraverso tali approcci25.
Integrasi-carenti vettori lentivirali (IDLVs) rappresentano un avanzamento importante nello sviluppo di veicoli di consegna del gene, come essi combinano la capacità di confezionamento di LVs con il beneficio aggiunto di manutenzione episomal AAV-come nelle cellule. Queste funzionalità consentono di IDLVs in gran parte eludere i problemi principali connessi con l'integrazione di vettori, vis-à-vis continua sovraespressione di potenzialmente genotossici elementi e integrazione-mediata mutagenicità. È stato precedentemente dimostrato che IDLVs possa essere modificata correttamente per migliorare il gene episomal espressione26,27. Per quanto riguarda la consegna di IDLV-mediata CRISPR/Cas9, i titoli di bassa produzione e bassa espressione di genomi episome-sopportate relativi agli impianti lentivirali integrasi-competente limita la loro utilità come strumenti di bona fide per la consegna di modifica del genoma costrutti transgenici. Recentemente abbiamo dimostrato che sia l'espressione del transgene e titoli virali associati IDLV produzione aumentano significativamente con l'inclusione di siti per il fattore di trascrizione Sp1 all'interno l'espressione virale cassetta28di legame. Il IDLVs modificate robustamente supportate CRISPR-mediata del gene editing sia in vitro (in cellule HEK 293T) e in vivo (nei neuroni post-mitotici cervello), mentre induce mutazioni di fuori bersaglio minime rispetto ai corrispondenti ICLV-mediata sistemi28. Nel complesso, abbiamo sviluppato un romanzo, compatto, all-in-one toolkit CRISPR trasportato su una piattaforma IDLV e delineati i vari vantaggi dell'utilizzo di un veicolo di consegna per l'editing avanzato gene.
Qui, il protocollo di produzione del sistema IDLV-CRISPR/Cas9 è descritto, compreso i vari passaggi nell'Assemblea, la purificazione, la concentrazione e la titolazione di IDLVs, nonché strategie per convalidare l'efficacia della modifica del gene di questi vettori. Questo protocollo è facilmente scalabile per soddisfare le esigenze di diversi ricercatori ed è progettato per generare dei vettori-LV con i titoli con successo nella gamma di 1 x 1010 transducing unità (TU) / mL. I vettori generati attraverso questo protocollo possono essere utilizzati per infettare in modo efficiente diversi tipi di cellule diverse, tra cui difficile per trasdurre staminali embrionali, cellule ematopoietiche (cellule T e macrofagi) e coltivate e vivo in- neuroni iniettati. Inoltre, il protocollo è ugualmente adatto per la produzione di vettori lentivirali integrasi-competente in quantità simili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> Figura 1: imballaggio di IDLV. (a) schema di tipo selvaggio dell'integrasi proteina (b) il plasmide modificato è stato derivato da psPAX2 (vedere Metodi, costruzione del plasmide per dettagli). Immagine di gel di agarosio rappresentante dei cloni schermati per cloni mutati integrasi. Campioni di DNA preparati utilizzando un mini-kit di isolamento del DNA del plasmide standard sono stati analizzati tramite digestione con EcoRV e SphI. Il clone correttamente digerito (numero 5, casella rossa tratteggiata) è stata ulteriormente verificato mediante sequenziamento diretto (Sanger) per la sostituzione di D64E in INT. La cassetta di imballaggio dell'integrasi-carente è stata denominata pBK43. (c) schema del protocollo trasfezione transiente impiegato per generare dei vettori-IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando 293T cellule trasfettate con VSV-G, imballaggi e cassette transgene (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-one plasmide). Le particelle virali che bud fuori dalla membrana cellulare contengono il RNA Full-Length del vettore (espresso dal cassetto transgene). La seconda generazione del IDLV-packaging system è stata utilizzata, che comprende le proteine regolarici Tat ed espressione Rev Rev. è inoltre integrata da una cassetta separata (RSV-REV-plasmide). Abbrev: virus di stomatite vescicolare ripetere, VSV-G, LTR-Long-terminale G-proteina, promotore pCMV-citomegalovirus; Promotore di Rous sarcoma virus (RSV); RRE-(elemento di risposta Rev). Altri elementi regolatori della cassetta di espressione comprendono siti di legame per Sp1, elemento Rev Response (RRE), marmotta epatite Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE), promotore di un nucleo-allungamento fattore 1 α (EFS-NC), l'imballaggio di vettore elemento ψ (psi), promotore umano di citomegalovirus (hCMV) e promotore umano U6. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

Vettori lentivirali sono la scelta ideale per fornire componenti di modifica del gene delle cellule dovuto la loro capienza per stabile trasducendo un ampio intervallo di celle e alti livelli di espressione genica di mediazione. Tuttavia, la loro capacità di integrarsi nel genoma della cellula ospite aumenta il rischio di mutagenesi inserzionale e quindi solleva preoccupazioni di sicurezza e limita il loro uso nelle regolazioni cliniche. Più ulteriormente, l'espressione persistente della modifica del gene componenti trasportati da questi aumenti di vettori lentivirali integrazione-competente (ICLVs) la probabilità di promiscua gene-targeting. In alternativa, è stata sviluppata una nuova generazione di vettori lentivirali integrasi-carente (IDLVs) che affronta molte di queste preoccupazioni. Qui il protocollo di produzione di una piattaforma IDLV nuova e migliorata per CRISPR-mediata del gene editing ed elenco i passaggi coinvolti nella purificazione e concentrazione di tali vettori è descritto e loro trasduzione e modifica del gene efficienza utilizzando HEK 293T cellule è stata dimostrata. Questo protocollo è facilmente scalabile e può essere utilizzato per generare alto titolo IDLVs che sono in grado di trasdurre cellule in vitro ed in vivo. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per la produzione di ICLVs.

Convalida dell'eliminazione diretta-efficienza dei vettori IDLV-CRISPR/Cas9 Abbiamo usato cellule 293T che esprimono GFP come un modello per convalidare l'efficienza di knockout di gene CRISPR/Cas9-mediata. Cellule GFP + sono state generate da trasduzione delle cellule HEK 293T con pLenti-GFP (vBK201a) presso un MOI di 0,5 (Figura 3b, pannello di "no-virus"). La cassetta di sgRNA-a-GFP/Cas9 all-in-one vector è stata confezionata in partic...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

Descriviamo la strategia di produzione di vettori lentivirali integrasi-carente (IDLVs) come veicoli per la consegna di CRISPR/Cas9 alle cellule. Con una capacità di mediare rapido e robusto gene modifica nelle celle, IDLVs presentare una più sicura e piattaforma altrettanto efficace vettore per la consegna del gene rispetto ai vettori integrasi-competente.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Ricerca

Genetica

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

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Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...