Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

우리는 신경 생물학의 학과 듀크 대학의과 대학 및 기초 과학, 듀크 대학에 대 한 학장의 사무실 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 원고에 의견에 대 한 공작 바이러스 성 벡터 코어의 회원을 감사합니다. 플라스 미드 pLenti CRISPRv2 Feng 장 (브로드 연구소)에서 선물 했다. LV-포장 시스템 플라스 미드 psPAX2를 포함 하 여, VSV G, pMD2.G, pRSV 계 Didier Trono (EPFL, 스위스)에서 종류 선물 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원에의 사우스 캐롤라이나의과 대학에 의해 제공 된 RDF18080 E202 (B.K) 부여 합니다.

1. HEK 293T 세포 배양과 Transfection에 대 한 셀을 시드
참고: 인간 미 발달 신장 293T DMEM, 10% 소 송아지 혈 청 철 및 성장 발기인 및 항생제 antimycotic 솔루션 x 1 보충으로 보충 하는 높은 포도 당 미디어에서에서 재배 되 고 (HEK 293T) 세포 (100 x 솔루션 포함 10000 단위 페니실린 10 mg 스와 25 µ g 암포 B mL 당). 미디어는 또한 1 x 나트륨 pyruvate, 1 x 비 필수 아미노산 믹스, 그리고 2 mM L-글루타민...

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IDLVs는 vivo에서 유전자-편집, mutagenesis 배달 플랫폼22 통합에 비해 이러한 벡터와 관련 된의 낮은 위험 때문에 크게 유전 질병의 맥락에서 특히 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다. , 28. 현재 원고, 우리는 우리의 실험실28에 최근 개발한 향상 된 모든-에-하나의 IDLV-CRISPR/Cas9 시스템의 생산과 관련 된 프로토콜에 자세히 설명...

정확한 유전자 편집 유전 질병을 해결 하기 위해 새로운 전략의 개발을 포함 하는 주요 생물 의학 발전의 초석을 형성 한다. 유전자 편집 기술의 최전선 이다는 c광택 regularly-난nterspaced s읽힌 palindromic repeats (CRISPR)의 사용에 의존 하는 방법 / 처음 확인 된 Cas9 시스템 으로 바이러스 유전 물질 (참조1,2검토)의 침공에 대 한 세균의 구성 요소입니다. 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 등 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) (참조3에서 검토 한 결과), 다른 유전자 편집 도구 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 이점은 이다 플라스 미드 디자인의 상대적 단순 하 고 CRISPR 구성 요소 건설-기능 유전자 편집, 몇 가지 전문된 실험실에서 훨씬 더 광범위 한 연구 공동체의 확장을 강화 했다. 또한, CRISPR/Cas9 프로그래밍의 단순 하 고 다중화 대상 인식에 대 한 용량 추가 비용 효율적이 고 사용 하기 쉬운 기술로 인기를 연료 있습니다. 셀에 같은 유전자 편집 구성 요소를 제공 하는 연구자를 사용할 수 있는 다양 한 방법 중에서 바이러스 성 벡터 남아 지금까지 가장 인기 있는 하 고 효율적인 시스템.
Lentiviral 벡터 (LVs) CRISPR/Cas9 시스템에 비보에 대 한 다양 한 응용 프로그램4,5,,67의 구성 요소를 제공 하는 선택의 수단으로 떠오르고 있다. 몇 가지 주요 기능 LVs 셀 분할 및 분할 비, 낮은 immunogenicity 및 최소한의 세포 독성 (참조8에서 검토) 감염을 그들의 능력을 포함 하 여이 프로세스에 대 한 인기 있는 선택을 하십시오. 결과적으로, LV-중재 유전자 치료는 고용, HBV, 및 HSV-1, 등 전염 성 질병의 치료 뿐만 아니라 인간의 유전 질병, 낭 성 섬유 증, 신 혈관 황 반 변성 등을 기본 결함의 수정에 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. 게다가, LVs 효과적으로 수정 된 다중 유전자 단일 벡터 시스템12을 사용 하 여 고유한 게놈 loci에서 편집을 수행 하.
그러나, 호스트 게놈으로 통합 하는 LVs의 고유의 속성 기지가 될 수 있으며 종종 오답 임상 설정에서 특히 transgene 배달 차량으로 그들의 유틸리티. 또한, 안정적 통합 LVs 지속적으로 높은 수준에서 그들의 transgenes 표현, 이후이 시스템은 적합 CRISPR/Cas9; 같은 구성 요소를 편집 하는 유전자의 전달 Cas9 가이드 RNA (gRNA), 그리고 ZFNs, 같은 유사한 단백질의 overexpression 오프 대상 효과, 바람직하지 않은 돌연변이13,14,,1516 를 포함 하는 높은 수준의와 관련 된 , 17 그리고 잠재적으로 세포 독성18을 향상 시킬 수 있습니다. 따라서, 정확 하 게 달성 하기 위해 최소한의 대상에서 효과, 유전자 편집 그것은 구성 요소를 편집 하는 유전자의 변이 표현에 대 한 수 있도록 시스템을 설계 하는 것이 필수적.
최근 몇 년 동안, 전송 플랫폼의 다양 한 정도 셀16,19,,2021 (참조22검토) CRISPR/Cas9을 표현 하기 위해 개발 되었습니다. 직접 소개 적절 한 가이드 RNAs 함께 순화 Cas9 셀으로 타겟 유전자를 플라스 미드 중재 transfection16에 비해 편집에 더 효과적일 표시 했다에 의존 하는 방법이 포함 됩니다. 그 ribonucleoprotein (RNP)을 증명 하는 연구 단지의 구성 된 가이드 RNA/Cas9 입자는 이러한 부품의 단기 식 달성 하기에 충분을 제안 하는 그들의 목표에서 DNA 분열 중재 후 급속 하 게 인계 16편집 하는 강력한 유전자. 비 통합 adeno 관련 바이러스 성 벡터 (AAVs) 같은 바이러스 성 벡터 플랫폼 세포에 유전자 편집 기계를 제공 하는 대안을 제공할 수 있습니다. 불행히도, AAV capsids LVs 보다 크게 낮은 포장 기능 보유 (< 5 kb)는 심각 하 게 단일 벡터 (검토 참조8) 내에서 다중 구성 요소 CRISPR 툴킷을 포장 하는 그들의 능력을 방해 한다. 히스톤 deacetylases (예를 들면, 나트륨 낙 산 염23)을 억제 하거나 (예를 들어, 카페인24) 세포 주기를 방해 하는 화합물의 추가 lentiviral titers을 증가 표시 되었습니다 지적 가치가 있다. 몇 가지 단점, 낮은 생산 효율성 등 감소 바이러스 titers을 통해 생성 하는 바이러스의 낮은 변환 효율성 있는 최근 진도도 불구 하 고 지금까지 개발 된 과도 식 시스템 장애가 여전히는 같은25를접근 한다.
LVs의 포장 능력을 결합 하 여 셀에서 AAV 같은 episomal 유지 보수의 추가 혜택으로 Integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs) 유전자 배달 차량 개발에서 큰 발전을 나타냅니다. 이러한 기능을 통합 벡터, 마주-à-마주 연속 overexpression 잠재적으로 차적인 요소 및 통합 중재 변이와 관련 된 주요 문제를 크게 우회 하는 IDLVs 있습니다. 그것은 이전 IDLVs 성공적으로 episomal 유전자 식26,27향상을 수정할 수 있습니다 시연 했다. CRISPR/Cas9 IDLV 중재 배달에 관하여 낮은 생산 titers 및 낮은 표현의 integrase 능숙 lentiviral 시스템 상대적인 episome 부담 게놈 게놈 편집 제공 하기 위한 진실 fide 도구로 그들의 유틸리티 제한 유전자 변형 구문입니다. 우리는 최근 transgene 표현과 IDLV 생산과 관련 된 바이러스 titers 크게 바이러스 성 식 카세트28내 녹음 방송 요인 s p 1에 대 한 사이트 바인딩을 포함 하 여 향상 된 시연. 수정 된 IDLVs 튼튼하게 CRISPR 중재 하는 유전자는 해당 ICLV 중재에 비해 최소한의 대상에서 돌연변이 유도 하는 동안 생체 외에서 (HEK 293T 세포)에서 그리고 vivo에서 (포스트 mitotic 뇌 신경)에 편집 지원 시스템28. 전반적으로, 우리는 소설을 개발, 소형, 모든-에-하나의 CRISPR 툴킷 IDLV 플랫폼에서 실시 하 고 향상 된 유전자 편집에 대 한 배달 차량을 사용 하 여 다양 한 이점을 설명.
여기, IDLV-CRISPR/Cas9 시스템의 생산 프로토콜은 설명, 어셈블리, 정화, 농도, 그리고이 벡터의 유전자 편집 효능을 확인 하기 위해 전략 뿐만 아니라 IDLVs, 적정에 관련 된 다양 한 단계를 포함 하 여. 이 프로토콜은 다른 수 사관 들의 요구를 충족 하도록 쉽게 확장 가능한 고 성공적으로 1 x 1010 단위 (TU) 시험의 범위에서 titers와 LV 벡터를 생성 하도록 설계 되었습니다 / mL. 이 프로토콜을 통해 생성 된 벡터 효율적으로 여러 다른 세포 유형, 어려운 transduce 배아 줄기 세포, 조 혈 모 세포 (T 세포와 대 식 세포)를 포함 하 여 그리고 교양 및 시내 vivo-감염에 이용 될 수 있다 주입된 하는 신경. 또한, 프로토콜은 동등 하 게 잘 비슷한 수량 integrase 유능한 lentiviral 벡터의 생산에 적합 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> 그림 1: IDLV 포장. 수정 된 플라스 미드는 psPAX2에서 파생 된 야생 타입 integrase 단백질 (b) 의 (a) 회로도 (방법, 플라스 미드 건설에 대 한 자세한 내용은 참조). 클론 돌연변이 integrase 클론에 대 한 검사의 대표 agarose 젤 이미지. DNA 샘플 표준 플라스 미드 DNA 분리 미니 키트를 사용 하 여 준비 EcoRV와 SphI 소화에 의해 분석 되었다. 제대로 소화 클론 (5 번, 파선된 빨간색 상자) 직접 (생어) 연속 D64E 대체 INT에 대 한 추가 확인 했습니다. Integrase 불충분 한 포장 카세트 pBK43 선정 됐다. (c) 과도 transfection 프로토콜의 회로도 고용 IDLV-CRISPR/Cas9 벡터 생성 하 293T 세포 VSV G, 포장, 및 transgene 카세트 (s p 1-CRISPR/Cas9-에-하나의 플라스 미드)와 페 보여주는. 바이러스 성 입자를 세포 막에서 밖으로 새싹 (transgene 카세트에서 표현) 벡터의 길이 RNA 포함. 그리고 IDLV-포장 시스템의 두 번째 세대 사용, 규제 단백질 문신 포함 목사 계 식 추가 별도 카세트 (RSV-레 브-플라스 미드)에서 보완. Abbrev: LTR 긴 터미널 반복, VSV G vesicular 구내 염 바이러스 G-단백질, pCMV 세포 발기인; 라우 스 육 종 바이러스 (RSV) 발기인; RRE-(계 응답 요소)입니다. 다른 규제 요소 식 카세트에 포함 Sp1 바인딩 사이트, 레 브 응답 요소 (RRE), 마 형 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소 (WPRE), 코어-신장 요인 1α 발기인 (EFS-NC), 벡터 포장 요소 ψ (psi), 인간의 세포 (hCMV) 발기인, 그리고 인간의 U6 발기인. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

Lentiviral 벡터 셀 안정적으로 세포의 광범위 한 범위를 시험 하 고 높은 수준의 유전자 발현의 중재에 대 한 자신의 능력 때문에 유전자 편집 구성 요소를 제공 하기 위한 이상적인 선택입니다. 그러나, 호스트 세포 게놈으로 통합 하는 능력 강화 insertional 변이의 위험 하 고 따라서 안전 우려를 제기 하 고 임상 조정에 있는 그들의 사용을 제한. 또한, 유전자 편집 구성의 영구 식 무차별 유전자 타겟팅의 확률이 통합 관할 lentiviral 벡터 (ICLVs) 증가 의해 전달. 대신, integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 새로운 세대 개발 되었습니다 많은 이러한 문제를 해결 하는. 여기 CRISPR 중재 유전자 편집 및 목록에 대 한 새로운 기능 및 향상 된 IDLV 플랫폼의 생산 프로토콜 단계 정화에 관여 하 고 설명 하는 같은 벡터의 농도 변환 및 HEK 293T를 사용 하 여 유전자 편집 효율성 셀 시연 했다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능한 고 시험 세포 생체 외 고 에 비보수 있는 높은 titer IDLVs를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ICLVs의 생산을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

IDLV-CRISPR/Cas9 벡터의 녹아웃 효율성의 유효성 검사 우리는 유전자 녹아웃 CRISPR/Cas9-중재의 효율성을 확인 하기 위해 모델 GFP 표현 293T 세포를 사용. GFP + 셀 HEK 293T 세포 pLenti-GFP (vBK201a) 0.5 (그림 3b, "no 바이러스" 패널)의 나에의 변환에 의해 생성 되었다. SgRNA-GFP/Cas9 모든-에-하나의 벡터 카세트 IDLV 또는 ICLV 입자에 포장 되었다 그리고 생?...

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A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

연구

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...