Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o departamento de neurobiologia, Duke University School of Medicine e gabinete do reitor para a ciência básica, Duke University. Agradecemos também a membros do núcleo do vetor Viral Duke para comentários sobre o manuscrito. Plasmídeo pLenti CRISPRv2 foi presente do Feng Zhang (Broad Institute). O sistema de LV-embalagem, incluindo o psPAX2 de plasmídeos, VSV-G, pMD2.G e pRSV-Rev foi um presente tipo de Didier Trono (EPFL, Suíça). Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido pela Universidade de Carolina do Sul escola de medicina, conceda RDF18080-E202 (Rafaella).

1. cultivo de células HEK-293T e propagação de células para transfeccao
Nota: Rim embrionário humano 293T (HEK-293T) as células são cultivadas em DMEM, mídia de alta glicose suplementada com soro 10% bezerro suplementado com promotores de crescimento e de ferro e 1 x solução de antibiótico antimicótico (100 x de solução contém 10.000 penicilina unidades estreptomicina 10 mg e 25 µ g anfotericina B por mL). A mídia também é complementada com piruvato de sódio 1 x, 1 x mix de a...

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IDLVs começaram a emergir como o veículo de escolha para na vivo gene-edição, especialmente no contexto de doenças genéticas, devido em grande parte para o baixo risco de mutagênese associado a estes vetores, em comparação com a integração de plataformas de entrega22 , 28. no manuscrito atual, nós procuramos detalhar o protocolo associado com a produção do sistema melhorada para a IDLV-CRISPR/Cas9 tudo-em-um que foi recentemente desenvolvid...

Edição de gene preciso constitui a pedra angular das grandes avanços biomédicos que envolvem o desenvolvimento de novas estratégias para combater doenças genéticas. Na vanguarda das tecnologias de edição de gene é o método baseando-se no uso do cabrilhantado regularly -eunterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que foi inicialmente identificado como um componente da imunidade bacteriana contra a invasão de material genético viral (revisto em referências1,2). Uma grande vantagem do sistema CRISPR/Cas9 sobre outras ferramentas de edição de gene, como nucleases dedo de zinco (ZFNs) e as nucleases efetoras como ativador da transcrição (TALENs) (revistas em referência3), é a relativa simplicidade de design do plasmídeo e construção de componentes CRISPR — um recurso que tem alimentado a expansão do gene-edição de alguns laboratórios especializados para uma comunidade de pesquisa muito mais ampla. Além disso, a simplicidade de programação CRISPR/Cas9 e sua capacidade de reconhecimento do alvo multiplexado alimentaram ainda mais sua popularidade como uma tecnologia de baixo custo e fácil de usar. Entre os vários métodos disponíveis para pesquisadores entregar tais componentes de edição de gene para as células, vetores virais continuam a ser de longe o sistema mais popular e eficiente.
Vetores de Lentivirus (LVs) têm emergido como o veículo de escolha para entregar os componentes do CRISPR/Cas9 sistema na vivo para diversas aplicações4,5,6,7. Vários recursos chaves fazem LVs uma escolha popular para este processo, incluindo a sua capacidade de infectar células de divisão e não dividindo, baixa imunogenicidade e mínima toxicidade celular (revisto em referência8). Como resultado, a terapia gênica mediada por LV tem sido empregada em tratamentos de doenças infecciosas, tais como o HBV, HIV-1 e HSV-1, bem como na correção de defeitos subjacentes humanas doenças hereditárias, como fibrose cística e degeneração macular neo-vascular 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Além disso, a LVs foram efetivamente modificados para realizar a edição de gene multiplex em distinta loci genômicos usando um vetor único sistema12.
No entanto, a propriedade inerente de LVs para integrar o genoma do hospedeiro pode ser mutagênico e frequentemente desfavorecem sua utilidade como veículos de entrega do transgene, especialmente em situações clínicas. Além disso, desde que integrado estàvel LVs expressam seus transgenes níveis elevados sustentavelmente, este sistema é suficientemente adaptados para a entrega de componentes de edição de gene como CRISPR/Cas9; superexpressão de RNA Cas9-guia (gRNA) e proteínas similares, tais como ZFNs, estão associados com níveis elevados de efeitos fora do alvo, que incluem mutações indesejáveis13,14,15,16 , 17 e que potencialmente pode melhorar a citotoxicidade18. Portanto, para obter precisão edição de gene com efeitos mínimos fora do alvo, é imperativo para design de sistemas que permitem a expressão transiente de gene editando componentes.
Nos últimos anos, uma variedade de plataformas de entrega foram desenvolvidos para expressar transitoriamente CRISPR/Cas9 em células16,19,20,21 (revisto em referência22). Estes incluem métodos que dependem diretamente introduzir Cas9 purificado, juntamente com as guia apropriada RNAs em células, que foi mostrado para ser mais eficaz no gene alvo-edição em comparação com a transfeccao mediada por plasmídeo16. Estudos têm demonstrado que ribonucleoprotein (RNP) complexos consistindo de guia RNA/Cas9 partículas são rapidamente virou depois da mediação de clivagem de DNA em seus alvos, sugerindo que a expressão a curto prazo desses componentes é suficiente para alcançar gene robusto edição16. É concebível, não-integração de plataformas de vetor viral como vetores de vírus adeno-associado (AAVs) podem fornecer uma alternativa viável para entregar máquinas edição de gene em células. Infelizmente, capsids AAV possuem capacidade de embalagem significativamente menor do que o LVs (< 5KB), que dificulta severamente sua capacidade para empacotar o toolkit CRISPR multi-componentes dentro de um único vetor (revisto em referência8). É interessante notar que a adição de compostos que inibem a histona deacetilases (por exemplo, o butirato de sódio23) ou impedir o ciclo celular (por exemplo, cafeína24) foram mostrados para aumentar a concentração de particulas de Lentivirus. Apesar dos progressos recentes, os sistemas de expressão transiente desenvolvidos até agora ainda são impedidos por várias deficiências, tais como a baixa eficiência da produção, que levam a reduzida concentração viral e transdução de baixa eficiência dos vírus gerados através de tais abordagens25.
Vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) representam um grande avanço no desenvolvimento de veículos de entrega de gene, como eles combinam a capacidade de empacotamento de VLS com o benefício adicionado de AAV-como manutenção epissomal nas células. Esses recursos ajudam IDLVs largamente contornar as principais questões associadas com a integração de vetores, vis-à-vis a superexpressão contínua do potencial genotóxico de elementos e mutagenicidade mediada por integração. Foi previamente demonstrado que IDLVs podem ser modificadas com êxito para melhorar a expressão de gene epissomal26,27. Com relação à entrega de mediada por IDLV CRISPR/Cas9, títulos de baixa produção e menor expressão dos genomas episome-suportado em relação a sistemas de Lentivirus integrase-proficiente limita sua utilidade como ferramentas de bona fide para a entrega de genoma-edição construções de transgénicas. Recentemente demonstramos que tanto a expressão do transgene e títulos virais associados à produção de IDLV são significativamente melhorados através da inclusão de binding sites para o fator de transcrição Sp1 dentro da gaveta de expressão viral28. Os IDLVs modificados robustamente suportado gene mediada por CRISPR edição tanto in vitro (em células HEK-293T) e na vivo (no pós mitóticas neurônios), enquanto a indução de mutações de fora do alvo mínimas comparadas com o correspondente mediada por ICLV sistemas de28. Em geral, desenvolvemos um romance, compacto, tudo-em-um kit de ferramentas CRISPR executados em uma plataforma IDLV e descritas as várias vantagens de usar esse veículo entrega para edição avançada do gene.
Aqui, o protocolo de produção do sistema de IDLV-CRISPR/Cas9 é descrito, incluindo as diversas etapas envolvidas em assembly, purificação, concentração e titulação da IDLVs, bem como estratégias para validar a eficácia de gene-edição destes vetores. Este protocolo é facilmente escalável para atender as necessidades de diferentes investigadores e é projetado para gerar com êxito vetores de LV, com uma concentração na faixa de 1 x 1010 transducing unidades (TU) / mL. Os vetores gerados através deste protocolo podem ser utilizados para infectar eficientemente vários diferentes tipos de células, incluindo células-tronco embrionárias difícil-para-transduce, células hematopoiéticas (células T e macrófagos) e culta e vivo em- neurônios injetados. Além disso, o protocolo é igualmente adequado para a produção de vetores de Lentivirus integrase-competente em quantidades semelhantes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> Figura 1: embalagem de IDLV. (a) esquema do tipo selvagem integrase proteína (b) o plasmídeo modificado foi derivado de psPAX2 (ver métodos, construção de plasmídeo para detalhes). Imagem de gel de agarose representante dos clones selecionados para clones mutantes integrase. Preparado usando um isolamento de DNA plasmídeo padrão mini kit de amostras de DNA foram analisadas por digestão com EcoRV e SphI. O clone digerido corretamente (número 5, caixa vermelha tracejada) verificou-se ainda mais por sequenciamento direto (Sanger) para a substituição de D64E em INT. A fita de empacotamento deficiente integrase foi nomeada pBK43. (c) diagrama esquemático do protocolo do transfection transiente empregadas para gerar vetores de IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando 293T células transfectadas com VSV-G, embalagens e fitas do transgene (Sp1-CRISPR/Cas9 tudo-em-um plasmídeo). Partículas virais que brote para fora da membrana celular contêm o RNA completo do vetor (expressado o transgene cassete). A segunda geração do sistema de embalagem-IDLV foi usada, que inclui as proteínas reguladoras Tat e expressão de Rev. Rev é complementada ainda mais de uma gaveta separada (RSV-REV-plasmídeo). Abrev: vírus de repetição, VSV-G, estomatite vesicular LTR-Long-terminal G-proteína, promotor de pCMV-citomegalovírus; Promotor de Rous sarcoma vírus (RSV); RRE-(elemento de resposta Rev). Outros elementos reguladores na gaveta a expressão incluem locais Sp1-obrigatórios, elemento Rev Response (RRE), marmota hepatite vírus Posttranscriptional regulamentar elemento (WPRE), um promotor de 1 α fator núcleo-alongamento (EFS-NC), a embalagem de vetor elemento ψ (psi), promotor de citomegalovírus (CMV) humano e humano U6 promotor. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

Particulas de Lentivirus vetores são uma escolha ideal para a entrega de componentes de edição de gene de células devido à sua capacidade para estàvel transducing uma ampla variedade de células e mediando a altos níveis de expressão gênica. No entanto, sua capacidade de integrar o genoma celular do hospedeiro aumenta o risco de mutagenicidade insercional e assim gera preocupações de segurança e limita o seu uso em situações clínicas. Além disso, a expressão persistente de gene-editando componentes entregues por estes aumentos de integração-competente Lentivirus vetores (ICLVs) a probabilidade de promíscuo gene alvejar. Como alternativa, foi desenvolvida uma nova geração de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) que aborda muitas dessas preocupações. Aqui o protocolo de produção de uma nova e melhorada plataforma IDLV para edição de genes mediada por CRISPR e lista as etapas envolvidas na purificação e concentração de tais vetores é descrita e sua transdução e gene-edição eficiência usando HEK-293T demonstrou-se células. Este protocolo é facilmente escalável e pode ser usado para gerar IDLVs foram capazes de transducing células in vitro e in vivo. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a produção de ICLVs.

Validação da nocaute-eficiência dos vetores de IDLV-CRISPR/Cas9 Usamos as células GFP-expressando 293T como um modelo para validar a eficiência de nocaute de gene CRISPR/Cas9-mediada. Células GFP + foram geradas pela transdução de células HEK-293T com pLenti-GFP (vBK201a) em um MOI de 0.5 (Figura 3b, painel de "no-virus"). A fita de sgRNA-para-GFP/Cas9 tudo-em-um vetor foi empacotada em partículas IDLV ou ICLV e a eficiência da ...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Descrevemos a estratégia de produção de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) como veículos para a entrega CRISPR/Cas9 para as células. Com uma capacidade de mediar a edição de gene rápido e robusto nas células, IDLVs apresentar um mais seguro e plataforma de vector igualmente eficazes para a entrega do gene comparado com vetores integrase-competentes.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...