Name: cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00
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Die Autoren erkennen Unterstützung von NIH/NIGMS (R01GM084135, HJN) und Mizutani Stiftung für Glycoscience (#110071 Finanzhilfe für HJN) und sind dankbar, Tom V. Lee für Diskussionen und Anregungen auf die Assays und Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine und Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) für Plasmide und Zell-Linien.

1. Vorbereitung von Double-Stranded RNA (DsRNA) für Shams Knockdown
<ol>
	<li>PCR-Amplifikation der Produkte
	<ol>
		<li>Verwenden Sie genomischer DNA Wildtyp gelb weiß (w y) und pAc5.1-EGFP als Vorlage und die folgende Primer-Paaren, um die DNA-Fragmente in DsRNA Synthese verwendet zu verstärken. Verwenden Sie die folgenden PCR Temperaturprofil: Denaturierung (95 ° C, 30 s), Glühen (58 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 1 min). 
		Grünes fluoreszie...

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis.">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li><li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila.">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

Kanonische Notch signaling hängt die Wechselwirkungen zwischen den Notch-Rezeptor und seine Liganden-5. Obwohl die meisten Studien auf der Notch-Signalweg in erster Linie die Bindung von Notch und Liganden in benachbarten Zellen (Trans) betrachten, Kerbe und dieselbe Zelle Liganden wirken zusammen, und diese sogenannten GUS-Interaktionen können eine hemmende Rolle in Aussparung 3,4-Signalisierung. Entsprechend, um die M...

Kanonische Kerbe Signalisierung ist ein Nahbereichskommunikation von Zelle zu Zelle-Mechanismus, der Körperkontakt der benachbarten Zellen, um die Interaktion zwischen Notch Rezeptoren und ihre Liganden1erfordert. Interaktion des Notch-Rezeptors (vorhanden auf der Oberfläche der Signal-Empfang Zellen) mit Liganden (auf der Oberfläche des Signal senden Zellen) initiiert, Kerbe Signalisierung und ist bekannt als Trans-Aktivierung2. Auf der anderen Seite Interaktion zwischen Kerbe und seine Liganden in derselben Zelle führt zur Hemmung der Notch-Signalweg und ist bekannt als Cis-Hemmung3. Die Balance zwischen Trans- und Cis-Interaktionen ist erforderlich, um optimale Liganden-abhängige Kerbe4Signalisierung zu gewährleisten. Drosophila ist ein Notch-Rezeptor und zwei Liganden (Delta und Serrate) im Gegensatz zu Säugetieren, die vier Notch Rezeptoren und fünf Liganden haben [gezackt 1 (JAG1), JAG2, Delta-Like 1 (DLL1), DLL3 und DLL4]5. Diese Einfachheit bietet, der Drosophila -Modell die Leichtigkeit zu sezieren/Studie die Auswirkungen der Weg-Modifikatoren auf Notch-Liganden Interaktionen und anschließend auf Kerbe Signalisierung. In bestimmten Kontexten während der tierischen Entwicklung (einschließlich Flügel Entwicklung in Drosophila), Cis- und Trans-Interaktionen zu erreichen, richtige Kerbe Signalisierung und Schicksal1,6 Zelle beteiligt sind . Es ist wichtig zu unterscheiden, die Beeinflussung der Kerbe Weg Modifikatoren in diesen Kontexten Cis- und Trans-Interaktionen der Kerbe mit seinen Liganden.
Unsere Fraktion berichtete zuvor, dass Zusatz von ein Kohlenhydrat-Rückstand genannt Xylose, Drosophila Kerbe negativ Notch signaling in bestimmten Kontexten reguliert, einschließlich Flügel Entwicklung7. Verlust der Shams (das Enzym, dass Xylosylates Kerbe) führt zu einem "Verlust der Flügel Vene" Phänotyp7. In jüngerer Zeit, dienten die gen Dosierung Experimente und klonale Analyse zeigen, dass Verlust der Shams Delta-vermittelten Kerbe Vereinzelung verbessert. Zu unterscheiden, ob die verbesserte Kerbe Signalisierung in Shams Mutanten eine Folge der verminderten Cis ist-Hemmung oder erhöhten Trans-Aktivierung, ektopische Überexpression Studien von Notch-Liganden in Larven Flügel imaginalen Scheiben mit dem Dpp-GAL4 -Treiber wurden durchgeführt. Diese Experimente zur Verfügung gestellt, Anhaltspunkte dafür, dass Shams regelt Trans-Aktivierung des Notch von Delta ohne Kerbe Cis-Hemmung durch Liganden8. Jedoch Feed-Back-Regeln und Auswirkungen der endogenen Liganden möglicherweise erschweren die Interpretation von ektopische Überexpression Studien1,6,9.
Beheben Sie dieses Problem, Drosophila S2 Zellen10 wurden verwendet, die einen einfachen in Vitro -System für Notch-Liganden Interaktion Studien11,12vorsehen. S2-Zellen nicht endogene Notch-Rezeptor und Delta Ligand11 ausdrücken und Ausdrücken ein niedriges Niveau der gesägt13, der Notch-Liganden Aggregation Experimente8nicht beeinflusst. Daher können S2 Zellen stabil oder vorübergehend transfiziert werden durch Kerbe und/oder einzelne Liganden (Delta oder Serrate), um Zellen zu generieren, die ausschließlich den Notch-Rezeptor oder eines ihrer Liganden ausdrücken oder eine Kombination davon. Mischen von S2 Kerbe exprimierenden Zellen mit Liganden exprimierenden S2 Zellen führt zur Bildung von heterotypen Aggregate vermittelt durch Rezeptor-Ligand verbindliche11,12,14. Quantifizierung der Aggregatbildung liefert ein Maß für Trans-Bindung zwischen Kerbe und seine Liganden15 (Abbildung 1). In ähnlicher Weise können S2 Zellen Co transfected mit Notch und Delta oder Serrate Liganden werden (d.h. Cis-Liganden). CIS-Liganden in diese Kerbe exprimierenden S2-Zellen aufheben die Bindung der Kerbe mit Trans-Liganden und führt zu verringerte Aggregatbildung8,12,14. Der relative Rückgang der Aggregatbildung verursacht durch GUS-Liganden liefert ein Maß für die hemmende Wirkung von Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Liganden (Abbildung 2). Dementsprechend Zelle Aggregation Assays wurden genutzt, um untersuchen die Auswirkungen des Verlustes von Xylosylation auf Trans- und Cis-Wechselwirkungen zwischen Kerbe und seine Liganden.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für Zelle Aggregation Assays zielte darauf ab, die Bindung der Kerbe mit Transbewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden mit Drosophila S2 Zellen. Als Beispiel, wir liefern die Daten, die uns erlaubt, die Wirkung der Kerbe Xylosylation auf Bindung zwischen Kerbe und Transbestimmen-Delta8. Diese einfachen Tests eine semi-quantitative Beurteilung der Notch-Liganden Interaktionen in-vitro- und helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Notch-Signalweg-Modifikatoren zu bestimmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

Kerbe-Signalisierung ist ein evolutionär konservierte Zell-Zell-Kommunikations-System im großen und ganzen in Tierentwicklung und Erwachsenen Wartung verwendet. Interaktion des Notch-Rezeptors mit Liganden von benachbarten Zellen induziert Aktivierung der Signalweg (Trans-Aktivierung), während der Interaktion mit Liganden aus der gleichen Zelle Signalisierung hemmt (Cis-Hemmung). Richtige Balance zwischen Trans-Aktivierung und Cis-Hemmung hilft optimale Notch signaling in einigen Kontexten während Tierentwicklung festzusetzen. Aufgrund der überlappenden Ausdruck Domänen der Kerbe und seine Liganden in vielen Zelltypen und die Existenz der Feedback-Mechanismen, studieren die Auswirkungen einer bestimmten Post-translationale Modifikation auf Trans- im Vergleich zu Cis-Interaktionen der Kerbe und die Liganden in Vivo ist schwierig. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung von Drosophila S2 Zellen in Zelle Aggregation Tests zur Beurteilung der Auswirkungen der eine Kerbe Weg Modifikator auf die Bindung von Kerbe an jeder Ligand in Trans und in GUSumzuwerfen. S2-Zellen stabil oder vorübergehend mit einer Kerbe exprimierenden Vektor transfiziert werden mit Zellen, die mit dem Ausdruck jeder Notch-Liganden (S2-Delta oder S2 gesägt) gemischt. Trans-Bindung zwischen Rezeptor und Liganden führt zur Bildung der heterotypen Zelle Aggregate und ist gemessen an der Anzahl der Aggregate pro mL bestehend aus &#62; 6 Zellen. Zu prüfen, die hemmende Wirkung von Cis-Liganden, S2-Zellen Co Ausdruck Kerbe und jede Liganden sind gemischt mit S2-Delta oder S2 gesägt Zellen und die Anzahl der Aggregate wird quantifiziert, wie oben beschrieben. Der relative Rückgang in der Anzahl der Aggregate durch die Anwesenheit von Cis-Liganden liefert ein Maß für GUS-Liganden-vermittelte Hemmung der Trans-Bindung. Diese einfache Assays können semi-quantitative Angaben über die Auswirkungen der genetischen oder pharmakologische Manipulationen auf die Bindung der Kerbe an seinen Liganden und können helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Entschlüsselung solche Manipulationen auf Kerbe zu signalisieren.

Unsere Beobachtungen in Vivo vorgeschlagen, dass Verlust der Xylosyltransferase gen Shams führt zu Gewinn von Notch Signalisierung durch Delta-vermittelten Transerhöht-Aktivierung des Notch ohne Beeinträchtigung der Cis-Hemmung der Kerbe von Liganden8. Um diese Idee zu testen, wurden in-vitro- Zelle Aggregation Assays durchgeführt. Erstens wurde Shams Ausdruck in S2-Zellen abgerissen mit Shams DsRNA...

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Komplexität von in-Vivo -Systemen erschwert die Unterscheidung zwischen Aktivierung und Hemmung des Notch-Rezeptors durch Trans- und Cis-Liganden, beziehungsweise. Hier präsentieren wir ein Protokoll basiert auf in-vitro- Zelle-Aggregation-Assays für die semi-quantitative und qualitative Bewertung der Bindung von Drosophila -Kerbe zu Trans-Liganden Vs GUS-Liganden.

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Myelinisierung Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...