Name: cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands at JoVE.com

המחברים לאשר תמיכה NIH/NIGMS (R01GM084135 כדי HJN), מיזוטני Glycoscience (מענק #110071 HJN), שיטות מודה טום (פ') לי על דיונים והצעות מבחני, והיסוד ספירו Artavanis-Tsakonas, הוגו Bellen, רוברט פלמינג, קן אירווין, את דרוזופילה גנומיקה משאב מרכז (DGRC) פלסמידים וקווים התא.

1. הכנה של RNA תקועים כפול (dsRNA) נוקאאוט שמס
<ol>
	<li>PCR הגברה של המוצרים
	<ol>
		<li>להשתמש DNA גנומי פראי-סוג לבן צהוב (y w) ו pAc5.1-EGFP כמו תבנית זוגות פריימר הבאים כדי להגביר את שברי DNA המשמשים סינתזה dsRNA. להשתמש בפרופיל תרמי PCR הבאים: דנטורציה (95 ° C, 30 s), מחזק (58 ° C, 30 s) והסיומת (72 ° ...

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis.">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li><li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila.">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

איתות חריץ הקנוני תלוי האינטראקציות בין הקולטן החריץ שלה ליגנדים5. אמנם רוב המחקרים על השביל חריץ לשקול בעיקר הכריכה של חריץ, ליגנדים בתאים הסמוכים (טרנס), דרגה, לאותו תא ליגנדים אינטראקציה, ואת אלה כביכול cis-האינטראקציות יכולים לשחק תפקיד מעכבות בחריץ איתות<sup class="xref"...

איתות חריץ קאנוני הוא מנגנון תקשורת לתא לטווח קצר הדורש מגע פיזי של השכנה תאים כדי להקל על האינטראקציה בין קולטני חריץ שלהם ליגנדים1. האינטראקציה של חריץ קולטן (קיים על פני תאי קליטת אות) עם ליגנדים (בהווה על פני השטח של שליחת אות תאים) יוזם חריץ איתות, המכונה הטרנס-הפעלת2. מצד שני, האינטראקציה בין החריץ שלה ליגנדים באותו התא מוביל אל עיכוב של מסלול חריץ, ידועה בשם cis-עיכוב3. האיזון בין הטרנס- cis-האינטראקציות נדרש כדי להבטיח חריץ תלויות ליגנד-אופטימלי איתות4. דרוזופילה יש קולטן חריץ אחד, שני ליגנדים (דלתא ו Serrate) לעומת יונקים, אשר יש קולטנים דרגה ארבע חמש ליגנדים [משוננים 1 (JAG1), JAG2, כמו דלתא 1 (DLL1), DLL3, DLL4]5. המודל דרוזופילה נתקל הפשטות, מציע את הקלות כדי לנתח/לימוד ההשפעות של מסלול מכפילי על אינטראקציות חריץ-ליגנד ובעקבות כך על חריץ איתות. בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים (כולל אגף פיתוח בדרוזופילה), הן cis- והן הטרנס-האינטראקציות מעורבים איתות חריץ המתאים ושאיפה תא גורל1,6 . חשוב להבחין את ההשפעות של חריץ מכפילי מסלול בהקשרים אלה ב- cis- לעומת הטרנס-האינטראקציות של חריץ עם ליגנדים שלה.
הקבוצה שלנו דיווחו בעבר כי תוספת של משקע פחמימות שנקרא xylose כדי חריץ דרוזופילה שלילית מווסת את חריץ איתות בהקשרים מסוימים, כולל אגף פיתוח7. אובדן שמס (האנזים הזה xylosylates דרגה) שמוביל פנוטיפ "אובדן וריד כנף"7. לאחרונה, ג'ין המינון ניסויים וניתוח המשובטים שימשו כדי להראות כי אובדן שמס מגבירה את חריץ בתיווך דלתא להתמקד. כדי להבחין בין אם באיתות חריץ משופרת במוטציות שמס הוא תוצאה של ירידה cis-עיכוב או מוגבר טרנס-הפעלה, ביטוי חוץ רחמי מחקרים של ליגנדים דרגה ב דיסקים דמותי כנף זחל בוצעו באמצעות מנהל התקן dpp-GAL4 . ניסויים אלה סיפק ראיות שמרמזות על כך שמס מווסת את טרנס-הפעלה של חריץ על ידי דלתא מבלי להשפיע על הרמה cis-עיכוב על ידי ליגנדים8. עם זאת, הזנה-בחזרה תקנות, ההשפעות של ליגנדים אנדוגני עלול לסבך את הפרשנות של ביטוי חוץ רחמי מחקרים1,6,9.
כדי לפתור בעיה זו, תאים S2 דרוזופילה 10 שימשו, אשר מספקים מערכת פשוטה במבחנה חריץ-ליגנד אינטראקציה מחקרים11,12. תאים S2 לא אקספרס אנדוגני חריץ קולטן ו- ליגנד דלתא11 ולבטא רמה נמוכה של מסורית13, אשר אינה משפיעה על הרמה-ליגנד צבירה ניסויים8. לכן, S2 תאים יכולים להיות stably או transiently transfected על ידי חריץ ו/או ליגנדים בודדים (דלתא או Serrate) כדי ליצור תאים המבטאים באופן בלעדי את הקולטן חריץ או באחד ליגנדים שלה, או שילוב של אותם. ערבוב של תאים לבטא חריץ S2 עם הבעת-ליגנד S2 תאים תוצאות להיווצרות של אגרגטים heterotypic מתווכת על-ידי ליגנד קולטן איגוד11,12,14. כימות של היווצרות צבירה מספק מידה של טרנס-מחייב בין החריץ שלה ליגנדים15 (איור 1). באופן דומה, תאים S2 יכול להיות שותף transfected עם ליגנדים חריץ, דלתא או Serrate (דהיינו cis-ליגנדים). Cis-ליגנדים בתאים אלה S2 לבטא חריץ מחסלים. את הכריכה של חריץ עם טרנס-תוצאה של ליגנדים ירד היווצרות הצבירה8,12,14. הירידה היחסית במבנה הצבירה הנגרמת על ידי חבר העמים-ליגנדים מספק מדד ההשפעה המעכבת של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-ליגנדים (איור 2). בהתאם לכך, מבחני צבירת תא נוצלו לבחון את ההשפעה של אובדן xylosylation על טרנס- ו - cis-האינטראקציות בין דרגה ליגנדים שלה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור תא צבירת מבחני שנועדה להעריך את הכריכה של חריץ עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים באמצעות תאים S2 דרוזופילה . לדוגמה, אנו מספקים את הנתונים אפשרה לנו לקבוע את ההשפעה של חריץ xylosylation על איגוד בין הרמה הטרנס-דלתא8. אלה מבחני ישירה לספק הערכה כמותית למחצה של חריץ-ליגנד אינטראקציות במבחנה , לעזור לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההשפעות ויוו ממגבילי מסלול חריץ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

חריץ איתות הינה מערכת תקשורת תא שנשמרת אבולוציונית-תא בשימוש נפוץ חיות פיתוח ותחזוקה למבוגרים. האינטראקציה של הקולטן חריץ עם ליגנדים מגבולות התאים גורם ההפעלה של מסלול איתות (טרנס-הפעלה), תוך אינטראקציה עם ליגנדים מאותו תא מעכב איתות (cis-עיכוב). האיזון הראוי בין הטרנס-הפעלה ו- cis-עיכוב מסייעת בהקמת רמות אופטימלית של חריץ איתות בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים. בגלל על התחומים ביטוי חופפים בין החריץ שלה ליגנדים סוגי תאים רבים על קיום מנגנוני משוב, לומד את ההשפעות של שינוי post-translational נתון על טרנס- לעומת cis-האינטראקציות של דרגה, קשה שלה ליגנדים ויוו . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שימוש בתאים דרוזופילה -S2 תא-צבירת מבחני כדי להעריך את ההשפעות של מפילה את צירוף מסלול חריץ על הכריכה של חריץ כדי כל ליגנד טרנס , ב- cis. S2 תאים stably או transiently transfected עם חריץ-להביע וקטור מעורבבים עם תאים לבטא כל ליגנד דרגה (S2-דלתא או מסורית-S2). טרנס-מחייבים בין קולטן ליגנדים גורמת להיווצרות של אגרגטים תא heterotypic, נמדד במונחים של מספר אגרגטים לכל mL המורכב &#62; 6 תאים. כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של cis-S2 תאים משותפת להביע חריץ ואת כל ליגנד מעורבבים עם תאים S2-דלתא או S2-מסורית של ליגנדים, המספר של אגרגטים הוא לכמת כמתואר לעיל. הירידה היחסית במספר של אגרגטים בשל נוכחותם של cis-ליגנדים מספק מידה של cis-ליגנד-מתווכת עיכוב של טרנס-איגוד. אלה מבחני פשוטה יכול לספק נתונים כמותיים למחצה על ההשפעות של גנטית או תרופתי מניפולציות על הכריכה של חריץ כדי ליגנדים שלה, יכול לעזור לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ויוו השפעות כזה מניפולציות על חריץ איתות.

התצפיות ויוו הציע כי אובדן של ג'ין xylosyltransferase שמס התוצאות ברווח של חריץ איתות בשל מוגבר בתיווך דלתא הטרנס-הפעלה של חריץ מבלי להשפיע על cis-עיכוב של חריץ על ידי ליגנדים8. כדי לבדוק את הרעיון הזה, במבחנה תא צבירת מבחני בוצעו. ראשית, הביטוי <em...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands at JoVE.com

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

המורכבות של מערכות ויוו מקשה להבחין בין הפעלת עיכוב של קולטן חריץ על ידי טרנס- ו - cis-ליגנדים, בהתאמה. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מבוסס על במבחנה תא-צבירת מבחני הערכה כמותיים למחצה של הכריכה של חריץ דרוזופילה טרנס-ליגנדים vs cis-ליגנדים.

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

וזמינותו מבוססת תא לחקור שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II Contractility ויה gastrulation מקופל איתות לשביל בתאים S2R + דרוזופילה

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...