Name: cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00
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著者は NIH/日の出からのサポートを認める (HJN、R01GM084135) 水谷糖質科学 (HJN にグラント #110071) トム V. Lee を議論と、アッセイの提案に感謝している財団と Spyros Artavanis-Tsakonas、ヒューゴ ・ Bellenロバート ・ フレミング、ケン アーバイン校とプラスミドのセルラインショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC)。

1.シャムスノックダウンのため二重鎖 RNA (dsRNA) の準備
<ol>
	<li>Pcr の製品の
	<ol>
		<li>DsRNA の合成に使用される DNA のフラグメントを増幅するのにテンプレート、次のプライマーのペアとして野生型黄色白(y w) ゲノム DNA とpAc5.1 EGFPを使用します。次の PCR の熱プロファイルを使用: 変性 (95 ° C、30 s)、焼鈍 (58 ° C、30 s) と拡張子 (72 ° C、1 分)。 
		緑色...

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis.">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li><li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila.">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

正規 Notch シグナルは、Notch 受容体とそのリガンド5間の相互作用に依存します。ノッチのパスに関するほとんどの研究は、主にノッチと隣接セル (トランス) の配位子の結合を検討、ノッチと同じ細胞リガンドが影響しあうか、およびこれらのいわゆるcis-ノッチの抑制的役割を果たす相互作用3,4をシグナリングします?...

正規 Notch シグナルは、隣接するノッチの受容体とそのリガンド1間の相互作用を促進する細胞の物理的な接触を必要とする短距離の細胞コミュニケーション メカニズムです。(信号受信細胞の表面上に存在) Notch 受容体リガンドとの相互作用 (信号送信の表面に細胞) Notch シグナルを開始し、トランスとして知られている-活性化2。その一方で、ノッチと同じセル内とそのリガンドの相互作用のノッチ経路の阻害につながるし、 cisとして知られている-抑制3。トランス- とcisのバランス-相互作用が最適なリガンド依存性 Notch4をシグナルのために必要です。ショウジョウバエは 4 ノッチの受容体と 5 配位子を持つ哺乳類とは異なり (デルタと Serrate) 2 つの配位子 1 つのノッチの受容体を持ちます [ジャグ 1 (JAG1)、JAG2、デルタのような 1 (DLL1) DLL3 および DLL4]5。このシンプルさを持つショウジョウバエモデルはノッチ-リガンド相互作用とその後 Notch シグナル経路の修飾子の効果の分析・研究に使いやすさを提供しています。(ショウジョウバエの翼の開発を含む)、動物の開発時に特定のコンテキストで両方cis- および-適切な Notch シグナルを達成し、運命1,6 セルの相互作用が関与しています。.シス-トランス対にこれらのコンテキストでノッチ経路の修飾子の効果を区別することが重要だ-ノッチとそのリガンドとの相互作用。
当社グループは、ショウジョウバエのノッチにキシロースを否定的と呼ばれる炭水化物残留物の添加が翼開発7を含む、特定のコンテキストで Notch シグナルを調節することを報告しました。シャムスの損失 (酵素、xylosylates ノッチ)「翼の静脈の損失」表現型7に 。最近では、クローン解析と遺伝子投与実験は、シャムスの損失がデルタ介したノッチ名指しを強化することを使用されました。シャムス変異体で強化された Notch シグナルが減少したcisの結果かどうかを区別するために-抑制または増加トランス-活性化、幼虫翅成虫原基におけるノッチ ligands の異所性発現の研究dpp GAL4ドライバーを使用して行われました。これらの実験は証拠を示唆シャムスがトランスを調節することを提供-ノッチcisに影響を与えずにデルタでノッチの活性化-8配位子による抑制。ただし、フィード バック規制と内因性リガンドの作用の異所性発現研究1,6,9の解釈を複雑にします。
ショウジョウバエS2 細胞10を用いて, この問題を解決するには、ノッチ-リガンド相互作用研究11,12の簡単な生体外でシステムが得られます。S2 細胞しない内因性 Notch 受容体とデルタ リガンド11を表現し、鋸歯状の13ノッチ リガンド凝集実験8に影響しない低レベルを表現します。したがって、S2 細胞をノッチおよび/または個々 の配位子 (デルタまたは Serrate) 専ら Notch 受容体またはその配位子の 1 つを表すセルを生成するまたはそれらの組み合わせによって、その安定または一過性を導入することができます。S2 のノッチを表現する細胞の受容体リガンド結合11,12,14を介した血液凝集体の形成に配位子を表現する S2 細胞結果を混ぜてください。集計の形成の定量化は、トランスの測定を提供します-ノッチとその配位子15 (図 1) との結合します。同様に、S2 細胞が cotransfected ノッチとデルタまたは Serrate 配位子とすることができます (すなわち cis-配位子)。Cis-これらのノッチ表現 S2 細胞における配位子はトランスとノッチのバインディングを破棄する-配位子との結果集計形成8,12,14を減少しました。Cisによる会合体形成の相対的な減少-配位子は、 cisの抑制効果の測定を提供します-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-配位子 (図 2)。したがって、細胞凝集アッセイが活かされて -トランス・シスの xylosylation の損失の影響を調べるためのノッチとそのリガンドの相互作用。
ここでは、提案する詳細なプロトコル細胞凝集アッセイはトランスとノッチの結合を評価する目的のため-配位子とcisによるその阻害-ショウジョウバエS2 細胞を用いた配位子。例として、我々 はノッチ xylosylation のノッチとトランス間のバインディングへの影響を判断できるようにデータを提供-デルタ8。これらの簡単な試金はノッチ-リガンド相互作用の in vitroの半定量的評価を提供し、ノッチ経路修飾子の生体内での効果発現の分子機構を調べる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

Notch シグナルは、動物の開発および成人のメンテナンスに幅広く使用されて進化的に保存された細胞間コミュニケーション システムです。隣接セルからのリガンドと Notch 受容体の相互作用を誘導するシグナル伝達経路の活性化 (トランス-活性化)、同じ細胞から配位子との相互作用を阻害するシグナル伝達 (cis-抑制)。トランスとの間の適切なバランス-活性化とcis-抑制は、ノッチは動物の開発時にいくつかのコンテキストにおけるシグナル伝達の最適なレベルを確立するのに役立ちます。ノッチと多くの細胞タイプの有機配位子の重複式ドメインとフィードバック機構の存在のためトランス-シス対に与えられた翻訳後修飾の効果の研究-ノッチの相互作用とその配位子生体内で困難です。ここでは、ノッチのトランスとcis各リガンドへのバインドをノッチ経路修飾子をノックダウンの効果を評価する細胞凝集アッセイでショウジョウバエS2 細胞を使用するためのプロトコルについて述べる。S2 細胞安定または一過性発現するノッチ表現のベクトル (S2 デルタまたは S2 鋸歯) 各ノッチ リガンドを発現する細胞と混在しています。トランス-リガンドと受容体の結合は異型細胞集塊の形成に結果し、成る mL あたりの集計の数の点では測定 &#62; 6 セル。Cisの抑制効果を検討する-配位子、ノッチとそれぞれの ligand の共発現 S2 細胞が S2 デルタまたは S2 鋸歯状細胞混在、集計数は上記のように定量化します。Cisの存在のため集計数の相対的な減少-配位子によりcis-リガンド-トランスの阻害を介した-バインド。これらの簡単な試その配位子にノッチのバインディングの遺伝的または薬理学的操作の効果の半定量的なデータを提供できるし、の生体内で効果の基礎となる分子メカニズムの解明に役立つことができます。Notch シグナルのような操作。

私たちの生体内観察提案、Notch シグナルによる利得の xylosyltransferase 遺伝子のシャムス結果の損失増加デルタ介したトランス-シスに影響を与えずにノッチの活性化-の抑制配位子8ノッチ。この概念をテストするための in vitro細胞凝集アッセイを行った。まず、S2 細胞におけるシャムス発現ノックダウンされた<e...

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

-トランス・シスによる活性化と Notch 受容体の阻害の区別が困難な体内システムの複雑さ-配位子、それぞれ。ここでは、トランスにショウジョウバエノッチのバインディングの定性・半定量評価のための in vitro細胞凝集アッセイに基づくプロトコルを提案する-配位子 vs cis-配位子。

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための<em&gt;インビトロ</em&gt;髄鞘形成アッセイ

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

非筋ミオシン II 収縮を介して折り返されている陥シグナル伝達経路ショウジョウバエS2R + 細胞を調査する細胞ベースのアッセイ

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...