Name: cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands at JoVE.com

Yazarlar NIH/NIGMS destek kabul (HJN R01GM084135) ve Glycoscience (hibe #110071 HJN) ve are minnettar Tom V. Lee için tartışma ve öneriler deneyleri, Mizutani Vakfı ve Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine ve Plazmidler ve hücre hatları için Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC).

1. Şems nakavt için çift telli RNA (dsRNA) hazırlanması
<ol>
	<li>PCR güçlendirme ürünleri
	<ol>
		<li>Vahşi tipi sarı beyaz (y w) genomik DNA ve pAc5.1-EGFP dsRNA sentezinde kullanılan DNA parçalarının yükseltmek için şablon ve aşağıdaki astar çiftleri kullanın. Aşağıdaki PCR termal profili kullan: denatürasyon (95 ° C, 30 s), tavlama (58 ° C, 30 s) ve uzantı (72 ° C, 1 dk.). 
		Yeşil flüoresan Protein gelişmiş (EGF...

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis.">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li><li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila.">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

Kurallı sinyal çentik çentik reseptör ve onun ligandlar5arasındaki etkileşimler bağlıdır. Çentik yolu en çalışmaları, öncelikle çentik ve ligandlar komşu hücrelere (trans) bağlama dikkate rağmen çentik ve aynı hücre ligandlar etkileşim ve bu sözde CIS-etkileşimleri çentik bir inhibitör rol oynayabilir 3,4sinyal. Buna göre kurallı çentik sinyal üzerinde bir değiştirici etkileri altında ya...

Kurallı sinyal çentik çentik reseptörleri ve onların ligandlar1arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hücreler komşu fiziksel temas gerektiren bir kısa menzilli hücre-hücre iletişim mekanizmasıdır. Çentik reseptör (sinyal alma hücrelerinin yüzeyinde mevcut) etkileşim ligandlar (sinyal gönderme yüzeyinde mevcut hücreleri) çentik sinyal başlatır ve transbilinen-harekete geçirmek2. Öte yandan, çentik ve onun ligandlar aynı hücrede arasındaki etkileşimi çentik yolu inhibisyonu yol açar ve CISbilinmektedir-inhibisyon3. Trans- ve BDTarasındaki denge-etkileşimleri optimum ligand-bağımlı çentik4sinyal sağlamak için gereklidir. Drosophila vardır bir çentik reseptörü ve iki ligandlar (Delta ve Serrate) dört çentik reseptörleri ve beş ligandlar var memeliler aksine [1 (JAG1), JAG2, pürüzlü delta benzeri 1 (DLL1), DLL3 ve DLL4]5. Bu basitlik sahip, Drosophila model çentik-ligand etkileşimleri ve daha sonra üzerinde çentik sinyal yolu değiştirici etkilerini incelemek/çalışma için kolaylığı sağlar. (Kanat geliştirme Drosophiladahil olmak üzere), hayvan gelişimi sırasında belirli bağlamlarda CIS- ve trans-etkileşimleri çentik uygun sinyal elde etmek ve kader1,6 hücre için söz konusu . BDT- transkarşı çentik yolu değiştiriciler Bu içeriklerde etkilerini ayırt etmek önemlidir-çentik etkileşimleri ile onun ligandlar.
Bizim grup daha önce ksiloz Drosophila çentik için olumsuz olarak adlandırılan bir karbonhidrat kalıntı ilavesi çentik kanat geliştirme7de dahil olmak üzere belirli bağlamlarda sinyal düzenleyen bildirdi. Şems kaybı (enzim o xylosylates çentik) için bir "kayıp kanat damarın" fenotip7açar. Daha yakın zamanlarda, gen dozaj deneyler ve klonal analiz shams kaybı Delta-aracılı çentik singling geliştirir göstermek için kullanılmıştır. Gelişmiş çentik shams mutantlar sinyal azalmış CISbir sonucu olup ayırt etmek için-inhibisyon veya artmış trans-harekete geçirmek, içinde larva kanat Imaginal diskler ligandlar çentik Ektopik overexpression çalışmaları dpp-GAL4 sürücüyü kullanarak uygulandı. Bu deneyler Shams transdüzenleyen kanıt düşündüren sağlanan-harekete geçirmek-in Delta tarafından çentik çentik CISetkilemeden-inhibisyon ligandlar8tarafından. Ancak, düzenlemeler geri besleme ve endojen ligandlar etkileri Ektopik overexpression çalışmalar1,6,9yorumu karmaşık.
Drosophila S2 hücreleri10 kullanıldı, bu sorunu gidermek için hangi çentik-ligand etkileşim çalışmaları11,12için basit vitro sistem sağlamak. S2 hücreleri değil endojen çentik reseptör ve Delta ligand11 hızlı ve çentik-ligand toplama deneyler8etkilemez Serrate13, düşük düzeyde ifade eder. Bu nedenle, S2 hücreleri stabil veya geçici çentik ve/veya bireysel ligandlar (Delta veya Serrate) sadece çentik reseptör veya onun ligandlar biri hızlı hücre oluşturmak için veya bunların bir kombinasyon tarafından transfected. Çentik ifade S2 hücrelerinin ligand ifade S2 hücreleri sonuçlarında heterotypic toplamları Reseptör-ligand bağlayıcı11,12,14tarafından aracılı oluşumu ile karıştırma. Miktar toplam oluşumu sağlar bir ölçüsü trans-çentik ve onun ligandlar15 (şekil 1) bağlama. Benzer şekilde, S2 hücreler çentik ve Delta veya Serrate ligandlar ile ortak transfected olabilir (Yani CIS-ligandlar). BDT-bu çentik ifade S2 hücrelerde ligandlar iptal etmek çentik bağlama ile trans-ligandlar ve sonucu azalmıştır toplama oluşumu8,12,14. Toplama oluşumu CIStarafından neden göreli düşüş-ligandlar CISinhibitör etkisini ölçüsü sağlar-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-ligandlar (Şekil 2). Buna göre hücre toplama deneyleri xylosylation kaybı trans- ve BDTüzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır-çentik ve onun ligandlar arasındaki etkileşimler.
Burada, çentik bağlama ile transdeğerlendirmek için hücre toplama deneyleri amaçlayan için detaylı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar Drosophila S2 hücreleri kullanarak. Örnek olarak, biz bize çentik ve transarasında bağ çentik xylosylation etkisini belirlemek izin verilen veri sağlar-Delta8. Bu basit deneyleri çentik-ligand etkileşimleri vitro yarı nicel bir değerlendirme sağlar ve çentik yolu değiştiriciler vivo içinde etkileri altında yatan moleküler mekanizmalar belirlemek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

Çentik sinyal geniş hayvan geliştirme ve yetişkin bakım ve kullanılan bir evrimsel korunmuş hücre-hücre iletişim sistemidir. Çentik reseptör hücreleri komşu gelen ligandlar ile etkileşimi sinyal aktivasyonu neden olmaktadır (trans-harekete geçirmek), sinyal ligandlar aynı hücreden ile etkileşim inhibe ederken (CIS-inhibisyon). Transarasındaki uygun dengeyi-harekete geçirmek ve BDT-inhibisyon yardımcı olur çentik bazı bağlamlarda hayvan geliştirme sırasında sinyal en uygun belirlemektedir. Üst üste gelen ifade etki alanları çentik ve birçok hücre tipleri içinde onun ligandlar ve geri bildirim mekanizmaları varlığı nedeniyle verilen translasyonel modifikasyon trans- CISkarşı üzerinde etkileri eğitimi-çentik etkileşimleri ve onun ligandlar vivo içinde zordur. Burada, Drosophila S2 hücrelerde hücre toplama deneyleri çentik bağlama trans ve CISher ligand için üzerinde bir çentik yol değiştirici aşağı vurma etkilerini değerlendirmek amacıyla kullanmak için bir iletişim kuralı açıklar. Stabil veya geçici bir çentik ifade vektör ile transfected S2 hücreleri her çentik ligand (S2-Delta veya S2 Serrate) ifade hücreleri ile karıştırılır. Trans-reseptör ligandlar arasındaki bağı heterotypic hücre toplamları oluşumuna neden olur ve oluşan mL başına toplamları sayısı açısından ölçülür &#62; 6 hücreler. CISinhibitör etkisini incelemek için-ligandlar, çentik ve her ligand ortak ifade S2 hücreleri S2-Delta veya S2 Serrate hücreleri ile karıştırılır ve toplamları sayısı yukarıda açıklandığı gibi sayılabilir. CISvarlığı nedeniyle toplamları sayısı göreli düşüş-ligandlar CISölçüsü sağlar-ligand- transinhibisyonu aracılı-bağlama. Bu basit deneyleri genetik veya farmakolojik işlemler bağlama üzerinde çentik için onun ligandlar etkileri üzerinde yarı Nicel veri sağlayabilir ve in vivo etkileri altında yatan moleküler mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir Çentik sinyal üzerinde böyle manipülasyonlar.

Vivo gözlemlerimiz xylosyltransferase gen shams sonuçlarında çentik nedeniyle sinyal kazanç kaybı Delta-aracılı transartış önerdi- CISetkilemeden çentik aktivasyonu-inhibisyonu Çentik ligandlar8tarafından. Bu kavramı sınamak için vitro hücre toplama deneyleri gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, S2 hücre deyimde Şems Şems dsRNA kullanarak yere düştü. EGFP dsRNA denetim...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands at JoVE.com

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Vivo sistemlerinin karmaşıklığı trans- ve BDTtarafından harekete geçirmek ve çentik reseptör inhibisyonu birbirinden ayırmak zor yapar-ligandlar, anılan sıraya göre. Burada, vitro hücre toplama deneyleri için nitel ve yarı kantitatif değerlendirmesi Drosophila çentik transiçin bağlama dayalı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar vs CIS-ligandlar.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...