Name: neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity at JoVE.com

Questo protocollo è supportato da un grant NRF-2015R1A2A1A01003410 dal Ministero della scienza, ICT e pianificazione del futuro, Repubblica di Corea.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparazione del neurone dissociata DRG adulto
<ol><li>Prima di impostare le impostazioni cultura, pre-cappotto una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Incubare una piastra a 6 pozzetti con 0,01% poli-D-lisina a 37° C per 2 h o a 4° C durante la notte. Quindi, lavare la piastra due volte con acqua distillata.</l...

<ol>
	<li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection,+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li><li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+neuroprotects,+reduces+microgliosis,+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury.">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li><li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury:+an+increasingly+philosophical+debate.">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li><li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling.">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li><li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+the+devil+is+in+the+details.">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li><li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury.">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration.">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells.">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li><li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity.">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li><li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration.">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li><li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury.">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li><li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration.">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li><li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury.">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li><li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury.">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li><li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism.">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li><li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice.">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li><li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate.">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li></ol>

Ci sono diversi passaggi critici per la generazione di questo sistema di co-coltura. È importante garantire che i neuroni DRG mouse e macrofagi peritoneali sono preparati fresco e sano. Abbiamo sperimentato attività di conseguenza diminuita del neurite del CM quando la dissezione di tutti i DRG ha preso più di 30 min. Inoltre, la contaminazione di emocomponenti in macrofagi peritoneali inoltre ha condotto ad una diminuzione di attività la conseguenza del neurite in CM. Al fine di suscitare l'interazione neurone-macro...

Vari studi hanno cercato di migliorare la rigenerazione dell'assone di CNS dopo le lesioni del midollo spinale o del cervello. Reazioni infiammatorie, che inevitabilmente accompagnano le lesioni nel sistema nervoso, sono tradizionalmente pensate di partecipare a processi patologici secondari che conduce ai risultati deleteri1,2. Infatti, il methylprednisolone che possa sopprimere le reazioni infiammatorie è l'unica terapia approvata per acuta del midollo spinale lesioni3. Tuttavia, gli studi più recenti hanno fornito la prova che i macrofagi, un tipo di cellula infiammatoria rappresentative, possano partecipare la rigenerazione o la riparazione del sistema nervoso feriti4,5,6. Ad esempio, infiltrazione macrofagi seguendo una molecole pro-rigenerativa del produrre lesioni di lente per promuovere la rigenerazione dei neuroni ganglionari7,8. Inoltre, trapiantati neuroni DRG aumentata crescita assonale nella regione dove sono stati attivati i macrofagi di zymosan9. Inoltre, i macrofagi al luogo della lesione possono creare un ambiente permissivo in crescita per nervi periferici feriti10.
Il nostro lavoro anche fornito la prova ben fondata che i macrofagi possono contribuire alla capacità di rigenerazione dell'assone in neuroni adiacenti. Abbiamo dimostrato che l'attivazione dei macrofagi a livello dei gangli della radice dorsale (DRG) era essenziali per la capacità rigenerativa migliorata delle DRG neuroni sensoriali seguendo un precondizionamento periferico del nervo ferita11. Simile ricerca è stata segnalata in modo indipendente da un altro laboratorio12. Abbiamo anche dimostrato che l'iniezione intragangliari di dibutirrile AMP ciclico (db-cAMP), che è una molecola ben nota per migliorare la capacità di rigenerazione dell'assone13, ha indotto l'attivazione dei macrofagi. La disattivazione dei macrofagi ha abolito gli effetti di db-cAMP sull'attività di conseguenza del neurite. Lavori successivi identificati espressione indotta da lesione di CCL2 nei neuroni come un segnale per stimolare i macrofagi con un fenotipo pro-rigenerativa14,15.
In base ai risultati sperimentali sopra, abbiamo stabilito un modello in vitro simile ad eventi molecolari che si verificano in DRGs seguendo un precondizionamento ferita modello11,14. In questo modello, db-cAMP viene applicato alle co-culture neurone-macrofago suscitando intercellulare segnalazione che conduce all'attivazione dei macrofagi con un fenotipo pro-rigenerativa. Qui, descriviamo protocolli dettagliati mediante il quale possiamo generare i macrofagi che secernono fattori molecolari che promuovono neuriti (Figura 1). Questo modello sperimentale illustra un concetto che i macrofagi possono essere stimolati o indotti a sostenere la rigenerazione assonale dopo le lesioni al sistema nervoso. Il nostro modello sarà anche utile per studiare i meccanismi di segnalazione intercellulare che porta all'attivazione dei macrofagi pro-rigenerativa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture insert transparent PET membrane 0.4&#956;m pore size</td>
			<td>Corning,Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Transparent PET membrane with 0.4-&#956;m pore size, for 6-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well culture slide</td>
			<td>Biocoat</td>
			<td>354632</td>
			<td>with a uniform application of Poly-D-Lysine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement, serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;, 5&#39;-cyclic monophosphate, N6,O2&#39;-dibutyryl-, sodium salt</td>
			<td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td>
			<td>28745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16210072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Daejung Chemical and Metal Co</td>
			<td>8566-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &#946; III tubulin (Tuj-1)</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>G7121</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twist shaker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>Tw3t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus America Inc</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>VWR International, Hyclone</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Pearson Rongeurs</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>Stainless steel, 14cm, curved, single joint action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Tungsten Carbide &#38; ToughCut</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>14558-11</td>
			<td>sharp, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>straight, 3mm cutting-edge, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>DW-41</td>
			<td>Input Voltage: 115VAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity

C'è forte evidenza che i macrofagi possono partecipare la rigenerazione o la riparazione del sistema nervoso danneggiato. Qui, descriviamo un protocollo in cui i macrofagi sono indotti a produrre condizionata medio (CM) che promuove la conseguenza del neurite. Neuroni gangliari (DRG) adulto radice dorsale sono acutamente dissociati e placcati. Dopo avere collegati stabilmente i neuroni, i macrofagi peritoneali sono co-coltivati su un inserto di cultura cellulare sovrapposto sullo stesso bene. Dibutyryl che amp ciclico (db-accampamento) viene applicato per la co-colture per 24 h, dopo di che la coltura delle cellule ins contenente i macrofagi viene spostato in un altro pozzo di raccogliere CM per 72 h. Il CM da co-colture trattate con db-cAMP, quando applicato a una cultura separata per la neuroni DRG adulta, esibisce l'attività di escrescenza robusto del neurite. Il CM ottenuto dalle colture del db-cAMP-trattati che consiste di tipo singola cella da solo, o neuroni DRG o dei macrofagi peritoneali, non ha esibito del neurite escrescenza attività. Questo indica che l'interazione tra macrofagi e neuroni è indispensabile per l'attivazione dei macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di conseguenza del neurite in CM. Così, il nostro paradigma di co-coltura sarà anche utile per studiare segnalazione intercellulare nell'interazione neurone-macrofago per stimolare i macrofagi di essere dotato di un fenotipo pro-rigenerativa.

Descriviamo un protocollo che può generare i macrofagi in grado di secernere fattori molecolari con attività di conseguenza del neurite. Il macrofago CM ottenuti da co-colture trattate con db-cAMP ha provocato neuriti robusto quando applicato a una cultura separata di neuroni DRG (Figura 2A). In confronto, CM ottenuti dalle co-culture PBS-trattati non ha indotto la conseguenza del neurite nella nostra durata coltura 15h (Figura 2B</stro...

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Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti

Il protocollo attuale presenta procedure sperimentali per stimolare macrofagi coltivati a essere dotati di capacità di rilasciare fattori molecolari che promuovono la conseguenza del neurite. Trattamento dell'accampamento per la co-colture di neuroni-macrofago induce i macrofagi a produrre medium condizionato che possiede l'attività la conseguenza del neurite forte.

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

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Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

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Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

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