Name: neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity at JoVE.com

このプロトコルは、NRF-2015R1A2A1A01003410 科学省、ICT および将来計画、韓国政府からの助成金によってサポートされます。

すべての実験動物を含む制度動物ケアおよび使用委員会の亜洲大学医学部によって承認されました。
1. 文化解離アダルト後根神経節ニューロンの準備
<ol><li>文化をセットアップする前にあらかじめポリ-D-リジンとラミニン 6 ウェル プレートをコートします。0.01% ポリ-D-リジン 2 h の 37 ° C、4 ° C で 6 ウェル プレート、一晩インキュベートします。蒸留水で 2 回プレー?...

<ol>
	<li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection,+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li><li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+neuroprotects,+reduces+microgliosis,+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury.">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li><li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury:+an+increasingly+philosophical+debate.">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li><li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling.">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li><li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+the+devil+is+in+the+details.">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li><li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury.">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration.">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells.">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li><li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity.">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li><li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration.">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li><li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury.">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li><li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration.">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li><li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury.">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li><li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury.">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li><li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism.">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li><li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice.">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li><li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate.">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li></ol>

この共培養システムの生成のいくつかの重要な手順があります。マウス後根神経節ニューロンと腹腔マクロファージが新鮮な準備されていることを確認することが重要であり、健康です。我々 はすべての Drg の郭清を 30 分以上取ったとき CM の減少した神経突起伸長活性を経験しています。さらに、マクロファージの血液成分の汚染はまた CM の神経突起伸長活性の減少につながった。Db キャ?...

負傷後脊髄や脳の中枢神経系軸索の再生を高めるために様々 な研究を求めています。炎症反応、神経系に傷害を必然的に伴う伝統的成果劇物1,2につながる二次の病理学プロセスに参加する考えられています。確かに、炎症反応を抑制するステロイドは急性脊髄傷害3の唯一の承認された治療です。しかしより最近の研究では、マクロファージ、代表的な炎症性細胞の種類が再生または負傷した神経系4,5,6の修復に参加できることを証拠を提供しています。たとえば、浸潤マクロファージ網膜神経節ニューロン7,8の再生を促進させるレンズ損傷生成プロ再生分子を次します。さらに、移植後根神経節ニューロンは、マクロファージがザイモサン9によってアクティブ化されている領域を軸索成長を増加しました。また、病変のサイトでマクロファージは、傷ついた末梢神経10成長寛容な環境を作成できます。
私たちの仕事は、マクロファージは、隣接するニューロンの軸索再生の能力に貢献できる強力な証拠も提供。後根神経節 (DRG) におけるマクロファージの活性化が示されている DRG の強化された再生能力に不可欠な感覚ニューロンの前処理末梢神経傷害11。同様の研究は独立して別の所12から報告。また、軸索再生13の能力を強化するよく知られている分子である amp (db キャンプ)、intraganglionic 注射誘発マクロファージの活性化したことを示した。マクロファージの非アクティブ化は、神経突起伸長活性に及ぼす db キャンプを廃止しました。後続の作品は、傷害による発現 CCL2 ニューロンのプロ再生表現型14,15マクロファージを刺激するために信号として識別されます。
上記の実験結果に基づき, 前処理傷害モデル11,14以降 drg コードで発生する分子のイベントに似た生体外モデルを設けています。このモデルでは、db-キャンプはプロ再生表現型とマクロファージの活性化につながるシグナル伝達細胞間を引き出す神経細胞・ マクロファージの共培養に適用されます。ここでは、我々 は我々 が神経突起伸展 (図 1) を促進する分子の要因を分泌するマクロファージを生成できます詳細なプロトコルを説明します。この実験モデルは、マクロファージを刺激または傷害神経系の軸索再生をサポートに誘導できるコンセプトを示しています。我々 のモデルはプロ再生マクロファージの活性化につながる細胞間情報伝達機構の勉強に役に立ちます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture insert transparent PET membrane 0.4&#956;m pore size</td>
			<td>Corning,Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Transparent PET membrane with 0.4-&#956;m pore size, for 6-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well culture slide</td>
			<td>Biocoat</td>
			<td>354632</td>
			<td>with a uniform application of Poly-D-Lysine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement, serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;, 5&#39;-cyclic monophosphate, N6,O2&#39;-dibutyryl-, sodium salt</td>
			<td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td>
			<td>28745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16210072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Daejung Chemical and Metal Co</td>
			<td>8566-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &#946; III tubulin (Tuj-1)</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>G7121</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twist shaker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>Tw3t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus America Inc</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>VWR International, Hyclone</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Pearson Rongeurs</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>Stainless steel, 14cm, curved, single joint action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Tungsten Carbide &#38; ToughCut</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>14558-11</td>
			<td>sharp, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>straight, 3mm cutting-edge, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>DW-41</td>
			<td>Input Voltage: 115VAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity

マクロファージが再生または負傷した神経系の修復に参加できることを強力な証拠があります。ここでは、マクロファージ、神経突起伸長を促進するエアコン生産媒体 (CM) に誘導されるプロトコルについて述べる。大人の後根神経節 (DRG) ニューロンは急性解離、メッキします。ニューロンは接続安定、マクロファージが文化のセル挿入も同じにオーバーレイで共培養です。サイクリック AMP (db キャンプ)、24 h、その後細胞培養は大食細胞を含む挿入の共培養に適用されます調節は 72 h の CM を収集する別よくに移動されます。共培養別アダルト後根神経節ニューロンの文化に適用されるとき、db キャンプで治療から CM は、堅牢な神経突起伸長活性を発揮します。単一のセルの種類だけから成る db キャンプ治療文化から得られる CM、DRG ニューロンまたは腹腔マクロファージ、神経突起伸長活性に表わさなかった。これは、神経細胞とマクロファージの相互作用はない CM に神経突起伸長活性分子因子を分泌するマクロファージの活性化のため不可欠であることを示します。したがって、私たちの共培養のパラダイムは、恵まれているプロ再生表現型マクロファージを刺激する神経細胞・ マクロファージの相互作用における細胞間情報伝達の研究に有用もなります。

大食細胞の神経突起伸長活性分子因子を分泌することができる生成することができますプロトコルについて述べる。堅牢な神経突起伸長別の DRG ニューロン文化 (図 2 a) に適用されるマクロファージ db キャンプで治療共培養から得られた CM となりました。比較では、PBS 処理共培養から得られる CM でしたいない当社の 15 h 文化期間 (<strong class="xfi...

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Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養

現在のプロトコルは、神経突起伸長を促進する因子の分子を解放する能力が備わっている培養マクロファージを刺激する実験の手順を示します。神経細胞・ マクロファージの共培養にキャンプの治療は、強力な神経突起伸長作用を有している馴化培地を生成するマクロファージを誘導します。

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

フリーダムモーションプラットフォーム度6を使用した三次元前庭眼反射テスト

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

単セルの精度で神経共培養の調製

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

脳卒中後のバランスリハビリテーションのための神経筋電気刺激システムで低コストのセンサーを統合ヒューマンマシンインターフェース

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

生体内で高分子量カットオフと間質液を脳から大規模な細胞外タンパク質を収集するマイクロダイアリシス法プローブします。

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養

アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・マクロファージ共培養