Name: neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity at JoVE.com

Этот протокол поддерживается грантом СР 2015R1A2A1A01003410 из министерства науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея.

Все эксперименты с участием животных были одобрены институциональные животное уход и использование Комитета из АДЖУ школы медицины университета.
1. Культура подготовка диссоциированных взрослых DRG нейрона
<ol><li>Перед настройкой культуры, предварительно Покройте 6-ну пл...

<ol>
	<li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection,+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li><li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+neuroprotects,+reduces+microgliosis,+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury.">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li><li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury:+an+increasingly+philosophical+debate.">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li><li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling.">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li><li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+the+devil+is+in+the+details.">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li><li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury.">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration.">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells.">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li><li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity.">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li><li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration.">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li><li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury.">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li><li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration.">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li><li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury.">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li><li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury.">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li><li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism.">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li><li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice.">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li><li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate.">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li></ol>

Существует несколько важных шагов для создания этой системы совместного культуры. Это важно обеспечить что мыши DRG нейронов и перитонеальные макрофаги готовятся свежие и здоровые. Мы испытали снижение neurite активности нарост см, когда вскрытие всех ДРГ приняла более 30 мин. Кроме того за?...

Целый ряд исследований стремились к повышению регенерации аксона ЦНС после травмы спинного или головного мозга. Воспалительные реакции, неизбежно сопутствующих травм нервной системы, традиционно считаются участвовать в вторичной патологических процессов, ведущих к пагубным результатам1,2. Действительно метилпреднизолон, который может подавить воспалительные реакции является только утвержденные терапия острого спинного мозга травмы3. Однако более поздние исследования представили доказательства того, что макрофаги, представитель воспалительных клеток типа, могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы4,5,6. Например проникнув макрофаги после про восстановительной молекул объектив травмы производят регенерации сетчатки ганглия нейронов7,8. Кроме того пересаженные нейроны DRG увеличение роста аксона до региона, где были активированы макрофаги, zymosan9. Кроме того макрофаги в месте поражения можно создать роста разрешительной окружение для10раненых периферических нервов.
Наша работа также представил сильные доказательства того, что макрофаги могут способствовать способности регенерации аксона в соседних нейронов. Мы показали, что активация макрофагов в спинной корень ганглиев (DRG) были в расширенной регенеративной способностью DRG сенсорных нейронов после предварительной подготовки периферической нерв травмы11. Подобные исследования сообщили независимо от другой лаборатории12. Мы также показали, что intraganglionic инъекции иммунобиологический ЦАМФ (db лагерь), который является известным молекулы для повышения способности регенерации аксона13, индуцированной активации макрофагов. Деактивация макрофаги отменил эффекты db лагерь на neurite нарост активность. Последующие работы определены травмы индуцированной выражение CCL2 в нейронах как сигнал для стимулирования макрофагов с про восстановительной фенотип14,15.
На основании выше экспериментальные результаты, мы создали модель в пробирке , напоминающие молекулярные события, которые происходят в ДРГ после предварительной травмы модель11,14. В этой модели db лагерь применяется к нейрон макрофагального Сопредседатель культур, вызывая межклеточной сигнализации, что приводит к активации макрофагов с про восстановительной фенотип. Здесь мы описываем подробные протоколы, по которым мы можем генерировать макрофаги, которые выделяют молекулярные факторы, содействующие нарост neurite (рис. 1). Эта экспериментальная модель иллюстрирует концепцию, что макрофаги могут быть стимулировали или индуцированной поддержать регенерации аксона после травмы нервной системы. Наша модель будет также полезно в изучении механизмов в межклеточной сигнализации, что приводит к активации про восстановительной макрофагов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture insert transparent PET membrane 0.4&#956;m pore size</td>
			<td>Corning,Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Transparent PET membrane with 0.4-&#956;m pore size, for 6-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well culture slide</td>
			<td>Biocoat</td>
			<td>354632</td>
			<td>with a uniform application of Poly-D-Lysine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement, serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;, 5&#39;-cyclic monophosphate, N6,O2&#39;-dibutyryl-, sodium salt</td>
			<td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td>
			<td>28745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16210072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Daejung Chemical and Metal Co</td>
			<td>8566-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &#946; III tubulin (Tuj-1)</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>G7121</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twist shaker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>Tw3t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus America Inc</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>VWR International, Hyclone</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Pearson Rongeurs</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>Stainless steel, 14cm, curved, single joint action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Tungsten Carbide &#38; ToughCut</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>14558-11</td>
			<td>sharp, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>FST (Fine Science Tools)</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>straight, 3mm cutting-edge, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>DW-41</td>
			<td>Input Voltage: 115VAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity

Существует убедительные доказательства того, что макрофаги могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы. Здесь мы описываем протокол, в котором макрофаги вынуждены производят кондиционером среднего (см), что способствует neurite нарост. Взрослый Спинной корень нейроны ганглии (DRG) остро в отрыве и покрытием. После того, как нейроны стабильно прикреплены, перитонеальных макрофагов совместно культивируемых на вставке культуры клеток, накладывается на то же хорошо. Иммунобиологический циклических AMP (db лагерь) применяется для совместного культур за 24 ч, после чего содержащий макрофаги вставить культуры клеток перемещается в другой хорошо для сбора см за 72 ч. СМ от совместного культур, относились с db лагерь, когда применяется к культуре, нейрон отдельный взрослый DRG, экспонаты надежные neurite результатом деятельности. СМ, полученные из db лагерь лечение культур, состоящий из одной ячейки типа только, DRG нейрон или перитонеальных макрофагов, не проявляют neurite активность нарост. Это означает, что взаимодействия между нейронами и макрофагами незаменима для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с neurite результатом деятельности см. Таким образом наш парадигмы сотрудничества культуры также будет полезным для изучения межклеточной сигнализации в нейрон макрофагального взаимодействия стимулировать макрофаги быть наделен про восстановительной фенотип.

Мы описываем протокол, который может генерировать Макрофаги способны секреции молекулярные факторы с neurite результатом деятельности. Макрофага см, полученные из совместного культур, относились с db лагерь в результате нарост надежные neurite при применении к отдельной ку?...

Watch this Scientific Journal Video about Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity at JoVE.com

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Нейрон макрофагального Сопредседатель культур для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с Neurite результатом деятельности

Текущий протокол представляет экспериментальные процедуры для стимулирования культивировали макрофаги быть наделен способность освободить молекулярные факторы, которые способствуют neurite нарост. Лечение лагеря нейрон макрофагального Сопредседатель культур индуцирует макрофаги производить кондиционером среда, которая обладает сильным neurite результатом деятельности.

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Опробование двигательную активность по изучению циркадные ритмы сна и параметров в Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Вывод Обогащенный олигодендроцитов культур и олигодендроцитов / Нейрон Myelinating сотрудничества культур от Послеродовые мышей тканей

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Разбор и культуры Чик Statoacoustic ганглия и спинного мозга при эксплантов Коллаген Гели для нейритов Анализы вырост

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Трехмерные вестибулярного рефлекса Тестирование с помощью шестью степенями свободы движения платформы

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Одновременное пред-и пост-синаптические Электрофизиологические Запись с<em&gt; Xenopus</em&gt; Нервно-мышечного Co-культуры

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Подготовка нейронных сопредседателей культур с одной клетки Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Прижизненной визуализации аксонов Взаимодействие с микроглии и макрофагов у мышей Спинной колонки Давка травмы

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

Человеко-машинного интерфейса Интеграция низкозатратных датчики с Стимуляция системы нейромышечной электростимуляции для постинсультной реабилитации Balance

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Исследуя функциональное Регенерация в Органотипической спинного мозга сопредседателей культур, выращенных на нескольких электродов массивов

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

В естественных условиях Микродиализом метод для сбора крупных внеклеточных белков от мозга межклеточной жидкости с высокой молекулярный вес отсечения зонды

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...