Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00
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MG est pris en charge par des subventions K08DK101608 et R03DK111473 de l’hôpital le National Institutes of Health, mars des Dimes Foundation Grant No 5-FY17-79, l’HME Discovery Institute de Washington University et Saint-Louis pour l’enfance et le service des Pédiatrie à la Washington University School of Medicine, Saint-Louis. CJL est pris en charge par R01DK104946 (PI : Silverman), hôpital Discovery Institute de Washington University des enfants et Saint-Louis pour l’enfance.

Toutes les procédures animaux dans cette étude ont été approuvées par soit l’Université de Washington à animalier institutionnels St.Louis et Comité de l’urbanisme (protocole 20160187) ou animalier institutionnel d’Université de Pittsburgh et Comité de l’urbanisme (protocole 14103918). Humain intestin fœtal à moins de 24 semaines de grossesse a été obtenue conformément aux directives marchés publics tissus anatomiques Université de Pittsburgh après approbation Institutional Review Board (protoco...

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

L’épithélium intestinal est constitué de nombreux sous-types cellulaires qui sont chargé de la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, maintenir l’intégrité de barrière intestinale et peuvent être rompues dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Alors que les modèles animaux peuvent récapituler quelques facettes de la maladie, le modèle ex vivo d’enteroids dérivé de l’intestin des souris et des hommes constitue une plate-forme pour tester les effets de divers traitements. L?...

L’entérocolite nécrosante (NEC) est la principale cause de décès par maladie gastro-intestinale chez les nouveau-nés prématurés, affectant près de 1 sur 10 enfants nés avant 29 semaines de gestation1,2,3. La moitié des nourrissons avec les progrès de NEC à la forme la plus sévère, où la survie est seulement 10-30 %4,5. Aux États-Unis, environ 2 milliards USD/année sont passées à traiter les enfants avec NEC6,7, mais le taux de survie ni d’une thérapie a changé au cours des 30 dernières années. La pathogenèse de l’entérocolite nécrosante est caractérisée par des lésions intestinales et atteinte muqueuse guérison8,9,10,11, cependant, les voies de signalisation conduisant à un exacerbée la réponse inflammatoire et mécanismes d’inverser l’inflammation restent incomplètement compris.
L’administration de lait maternel s’est avérée pour être la stratégie de protection seulement contre NEC pour les bébés prématurés. Nous avons déjà montré que le lait maternel protège contre NEC développement par le biais de l’inhibition du récepteur toll-like récepteurs immunitaires innées 4 (TLR4) dans l’épithélium intestinal par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)11de la voie de signalisation. La supplémentation du lait maternel à une formule expérimentale de NEC a atténué la réponse inflammatoire chez NEC, tel que démontré par l’inhibition de l’apoptose de l’entérocyte et restauration des entérocytes prolifération d’une manière qui dépendait de croissance épidermique Factor (EGF) et EGFR11. Dans une autre étude, il a été démontré que des nitrates, une autre composante du lait maternel, contribue à son caractère protecteur en modulant la perfusion intestinale, comparativement aux préparations pour nourrissons, qui manque de nitrate et peuvent contribuer à l’augmentation de la fréquence de l’entérocolite nécrosante dans formule nourris les bébés12,13. Autres composés présents dans le lait maternel qui sont sont révélées être impliquées dans la protection contre le NEC incluent des oligosaccharides de lait humain, L-arginine, glutamine et lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Ces éléments bénéfiques du lait maternel révèlent la nécessité de son utilisation dans la prévention de l’entérocolite nécrosante, mais soulignent également l’importance d’étudier les mécanismes de signalisation des voies et les effets cellulaires impliqués dans la façon dont le lait maternel est médiation la protection contre le NEC .
Dans l’ordre afin d’étudier les propriétés protectrices du lait maternel dans un modèle murin de NEC, nous avons développé une technique innovatrice et facile à utiliser, par où la souris le lait maternel peut être extraite d’un barrage anesthésié à l’aide d’un maternel électrique pompe11,12 . Cette stratégie d’acquisition de lait maternel de la souris est avantageuse, non seulement parce que humain tire-laits sont facilement accessibles et efficaces dans l’achat de lait maternel, mais aussi parce que cette méthode permet des analyses de lait maternel propres à chaque espèce. En conséquence, nous permet de comparer les effets du lait maternel de la souris avec celles du lait maternel humain comme donneur humain le lait pasteurisé provenant une banque de lait dans les modèles spécifiques à l’espèce. Cette technique permet l’étude des composants du lait maternel en ce qui concerne leur contribution à la prévention de la NEC. Autres chercheurs ont mis au point des méthodes d’extraction lait maternel, mais ces techniques sont manuelles et nécessitent plus d’un laboratoire membre20,21,22. Une technique simple qui peut être utilisée en modifiant un tire-lait électrique humain pour collecter le lait d’une souris est présentée ici. Cette technique peut également être appliquée à d’autres espèces.
Afin de bien interroger les voies de signalisation impliquées avec NEC, modéliser les systèmes sont nécessaires pour évaluer tous les types de cellules différents connus pour être affectés dans le processus de la maladie. Ici, nous discutons un tel système de modèle - enteroids - et leur mise en place de la souris et de l’intestin humain. Enteroids intestinaux humains (Eih) en particulier fournir des promesses importantes, parce qu’ils offrent un modèle humain novateur, génétiquement diverse le ex vivo pour faciliter l’étude des processus physiopathologiques qui se déroulent dans le tractus gastro-intestinal 23. Enteroids ont été trouvés à être cultivées à long terme et peuvent être congelés pour plus tard utilisation23, et contrairement à l’humain organoïdes intestinale (HIOs), dont les cultures sont développées à partir des cellules souches pluripotentes inductible, enteroids sont générés à partir des cellules souches dans les cryptes intestinales isolées24. Enteroids exigent moins d’entretien, peut être infecté rapidement25et peut être facilement établie puisque des cryptes intestinales sont plus différenciés que HIOs23. Donc, HIEs offrent de nombreux avantages par rapport aux techniques existantes car ils peuvent être développés pour exposer des propriétés de compositions et les fonctions spécifiques à une région de l' épithélium gastro-intestinal humain23. L’utilisation d’enteroids est un choix très efficace lorsque le besoin d’un modèle humain de l’intestin, avec respect des limites propres à chaque région et facilité d’utilisation. Nous démontrons la technique d’isoler et de maintenir les principales cellules souches dérivées petit intestinale enteroids de souris et les humains prématurés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin N (Insulin)</td>
			<td>Eli Lilly And Company</td>
			<td>0002-8315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030700112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030722116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030723112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G 1.5 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Double Electric Breast Pump</td>
			<td>Lansinoh</td>
			<td>044677530163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stoppers</td>
			<td>Frey Scientific</td>
			<td>560761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mki67 primer F: 5&#39;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#39; R: 5&#39;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Enteroids intestinales petits humains proviennent des cryptes et lorsqu’il est cultivé dans une niche de cellules souches contiennent tous les types de cellules épithéliales. La capacité d’établir des enteroid humaines ex vivo systèmes de culture sont importantes de physiopathologie intestinale de modèle et d’étudier les réponses cellulaires particuliers impliqués. Ces dernières années, enteroids de souris et les humains sont cultivées, repiquées et mis en banque loin pour une utilisation future dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Cette plate-forme d’enteroid peut être utilisée pour tester les effets de divers traitements et des médicaments et quels sont les effets sont exercent sur les différents types de cellules dans l’intestin. Ici, un protocole pour l’établissement primaire enteroids intestinale petites cellules souches dérivées provenant de souris néonatales et intestin humain prématuré est fourni. En outre, ce système de culture enteroid a été utilisé pour tester les effets du lait maternel propres à chaque espèce. Lait maternel de la souris peut être obtenu efficacement à l’aide d’un tire-lait humains modifiés et lait exprimé souris peut ensuite être utilisé pour plus amples recherches expérimentales. Nous maintenant de démontrer les effets de souris exprimée, humaine, et lait maternel donneur sur la croissance et la prolifération des enteroids dérivés de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré.

Tout d’abord, nous avons voulu étudier si avec du lait maternel ou du lait maternel pasteurisé donneur a eu un effet sur petit enteroids intestinale. En effet, lait maternel et le lait maternel donneur augmentent la croissance des souris néonatale (Figure 1 a) et prématurée humaine dérivée enteroids (Figure 1 b).
Étant donné que le lait maternel humain a augm...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire

Ce protocole décrit comment mettre en place un système de culture enteroid de souris néonatale ou intestin prématurée de l’homme, mais aussi une méthode efficace pour recueillir le lait de souris.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

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Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Recherche

Médecine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

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Un humain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

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Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo l&#39;imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Un modèle de souris orthotopique du sein spontané Cancer Métastase

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Un petit modèle Animal de Perfusion hépatique normothermique Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...