Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00
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MG wird unterstützt durch Zuschüsse, K08DK101608 und R03DK111473 von den National Institutes of Health, März des Dimes Foundation Grant Nr. 5-FY17-79, die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital und dem Department of Pediatrics an der Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL stützt sich auf R01DK104946 (PI: Silverman), die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital.

Alle tierische Verfahren in dieser Studie wurden von entweder der Washington University in St. Louis institutionelle Animal Care und Use Committee (Protokoll 20160187) oder institutionelle Tierbetreuung University of Pittsburgh und Use Committee (Protokoll 14103918) genehmigt. Menschlichen fetalen Dünndarm in weniger als 24 Wochen Schwangerschaft wurde im Einklang mit der University of Pittsburgh Leitlinien für die Auftragsvergabe des anatomischen Gewebe nach Institutional Review Board Genehmigung (Protokoll PRO1410053...

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Das Darmepithel besteht aus vielen zellulären Subtypen, die sind verantwortlich für die Bereitstellung von Host-Abwehr von Krankheitserregern, Darm Barriere Integrität, und in der Pathogenese verschiedener Krankheiten durchbrochen werden kann. Während Tiermodelle einige Facetten der Krankheit zusammenfassen können, bietet die ex-Vivo -Modell des Enteroids, abgeleitet aus dem Dünndarm von Mäusen und Menschen eine Plattform, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen zu testen. Die Bedeutung des Ent...

Nekrotisierende Enterokolitis ist (NEC) die führende Ursache des Todes von Magen-Darm-Erkrankung bei Frühgeborenen, die betreffen fast 1 in 10 Neugeborenen vor 29 Wochen Schwangerschaft1,2,3. Die Hälfte der Säuglinge mit NEC Fortschritte, die schwerste Form, wo überleben befindet sich nur 10-30 %4,5. In den Vereinigten Staaten einem geschätzten 2 Milliarden USD pro Jahr ausgegeben werden, Behandlung von Säuglingen mit NEC6,7, doch weder die Überlebensrate noch Therapie hat in den vergangenen 30 Jahren verändert. Die Pathogenese der NEC zeichnet sich durch intestinale Verletzungen und beeinträchtigt mukosalen Heilung8,9,10,11, jedoch die Signalwege führt zu einer verschärften entzündliche Reaktion und Mechanismen, die Entzündung umzukehren bleiben unvollständig verstanden.
Die Verwaltung der menschlichen Muttermilch hat sich herausgestellt, die nur Schutzstrategie gegen NEC für Frühgeborene zu sein. Wir haben bereits gezeigt, dass Muttermilch gegen NEC Entwicklung durch Hemmung des angeborenen Immunsystems Rezeptor Abgabe-wie Rezeptors 4 (TLR4) in das Darmepithel über den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR schützt) Signalisierung Weg11. Ergänzung der Muttermilch auf eine experimentelle NEC Formel gedämpft, die entzündliche Reaktion in NEC wie durch Hemmung der Enterozyten Apoptose und Wiederherstellung der Enterozyten Verbreitung in einer Weise, die abhängig von epidermalen Wachstum war, gesehen Factor (EGF) und EGFR-11. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass Nitrat, ein weiterer Bestandteil der Muttermilch, trägt zu seiner schützenden Natur durch Modulation der intestinalen Perfusion, im Vergleich zu Säuglingsnahrung, die Nitrat fehlt und kann dazu beitragen, die erhöhte Häufigkeit von NEC in Formel gefüttert Kleinkinder12,13. Andere Verbindungen, die in der Muttermilch, die nachweislich in den Schutz gegen NEC einbezogen sind Muttermilch-Oligosaccharide, L-Arginin, Glutamin und Lactoferrin14,15,16, 17,18,19. Diese positiven Elemente der Muttermilch zeigen die Notwendigkeit, seine Verwendung in der Prävention von NEC, aber auch betonen, wie wichtig es ist, die Mechanismen, Signalisierung, Wege und zelluläre Effekte wie Muttermilch ist den Schutz gegen NEC Vermittlung beteiligt .
In Ordnung, weiter zu studieren die Schutzeigenschaften der Muttermilch in einem Mausmodell der NEC, entwickelten wir eine neuartige, einfach zu bedienende-Technik durch die Maus Muttermilch aus einem narkotisierten Damm mit einer elektrischen Muttermilch Pumpe11,12 extrahiert werden können . Diese Strategie des Erwerbs von Maus-Muttermilch ist vorteilhaft, nicht nur weil Muttermilch Pumpen leicht zugänglich und effizient bei der Beschaffung von Muttermilch, sondern auch weil diese Methode ermöglicht eine artspezifische Brust Milch Analysen. Infolgedessen, wir können die Auswirkungen der Maus Muttermilch mit denen des menschlichen abgepumpte Milch vergleichen sowie pasteurisiert menschlichen Spender Milch von einer Milch-Bank in artspezifische Modelle. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Brust Milchkomponenten in Bezug auf ihren Beitrag zur Prävention von NEC. Andere Forscher haben Brust Milch Extraktionsverfahren entwickelt, aber diese Techniken sind manuell und erfordert in der Regel mehr als ein Labor Mitglied20,21,22. Hier ist eine einfache Technik, die genutzt werden kann, indem Sie ändern eine menschliche elektrische Milchpumpe um Milch von einer Maus zu sammeln vorgestellt. Diese Technik kann auch auf andere Arten angewendet werden.
Um die Signalwege mit NEC angemessen zu verhören, sind Modellsysteme erforderlich, um die verschiedenen Zelltypen im Krankheitsprozess betroffenen bewerten. Hier diskutieren wir ein solches Modell - Enteroids- und deren Etablierung von Mäusen und menschlichen Dünndarm. Menschlichen Darm Enteroids (HIEs) bieten vor allem bedeutende versprechen, denn sie eine innovative, genetisch vielfältigen ex Vivo Menschmodell bieten um die Untersuchung pathophysiologischer Prozesse zu unterstützen, die im Magen-Darm-Trakt stattfinden 23. Enteroids sind gefunden worden, um langfristige kultiviert werden und kann für spätere Verwendung23eingefroren werden, und im Gegensatz zu menschlichen Darm Organellen (Chios), deren Kulturen von induzierbaren pluripotente Stammzellen entwickelt werden, Enteroids entstehen aus Stammzellen innerhalb von isolierten Darm Krypten24. Enteroids erfordern weniger Wartung, kann schnell25infiziert, und kann leicht festgestellt werden, da Darm Krypten als Chios23differenzierter sind. Deshalb bieten HIEs viele Vorteile gegenüber bestehenden Techniken, weil sie entwickelt werden können, um regionsspezifische kompositorischen und funktionellen Eigenschaften des menschlichen Magen-Darm-Epithel23aufweisen. Die Verwendung von Enteroids ist eine hochwirksame Wahl wenn diese ein menschliches Modell des Darmes, mit Einhaltung der Region-spezifische Einschränkungen und Ease of Use. Hier zeigen wir die Technik der Isolierung und Aufrechterhaltung primäre Stammzellen gewonnenen kleinen Darm Enteroids von Mäusen und menschlichen Säuglingen verfrüht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin N (Insulin)</td>
			<td>Eli Lilly And Company</td>
			<td>0002-8315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030700112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030722116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030723112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G 1.5 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Double Electric Breast Pump</td>
			<td>Lansinoh</td>
			<td>044677530163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stoppers</td>
			<td>Frey Scientific</td>
			<td>560761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mki67 primer F: 5&#39;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#39; R: 5&#39;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Menschlichen kleinen intestinalen Enteroids ergeben sich aus den Krypten und wenn Sie in einer Stammzellnische angebaut enthalten alle Epithelzelle Typen. Die Fähigkeit, menschliche Enteroid ex Vivo Kultur Systeme einzurichten sind wichtig, Modell Darm Pathophysiologie und studieren die bestimmten zellulären Reaktionen beteiligt. In den letzten Jahren sind Enteroids von Mäusen und Menschen, passagiert und Querneigung Weg für die zukünftige Verwendung in mehreren Labors auf der ganzen Welt kultiviert wird. Diese Enteroid-Plattform kann verwendet werden, testen Sie die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen und Medikamente und welche Auswirkungen auf verschiedene Zelltypen im Darm ausgeübt werden. Hier ein Protokoll für die Gründung der primäre Stammzellen gewonnenen kleinen intestinalen Enteroids abgeleitet von neugeborenen Mäusen und vorzeitige menschlichen Darm wird zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus wurde dieses Enteroid-Kultur-System eingesetzt, um die Auswirkungen der artspezifische Muttermilch zu testen. Maus-Muttermilch erhalten Sie effizient mit einer veränderten menschliche Milchpumpe und ausgedrückt Maus Milch kann dann für weitere Forschung Experimente verwendet werden. Wir zeigen nun die Auswirkungen der zum Ausdruck gebrachten Maus, Mensch, und Spender Muttermilch auf das Wachstum und die Verbreitung von Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm abgeleitet.

Zuerst wollten wir untersuchen, ob die Muttermilch ausgedrückt oder pasteurisierte Spender Muttermilch wirkten sich auf kleinen Darm Enteroids. In der Tat erhöht die Muttermilch und Spender Muttermilch das Wachstum des Neugeborenen Maus (Abbildung 1A) und vorzeitige menschlichen abgeleiteten Enteroids (Abbildung 1 b).
Da die Muttermilch das Wachstum der kleinen intest...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid-Kultur-System von Neugeborenen Maus oder vorzeitige menschlichen Darm sowie eine effiziente Methode um Milch von Mäusen zu sammeln.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Forschung

Medizin

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...