Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00
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MG es apoyado por becas K08DK101608 y R03DK111473 de los institutos nacionales de salud, marzo de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, los niños Discovery Institute de Washington University de St. Louis los niños Hospital y el Departamento de Pediatría de la Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL es apoyado por R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital descubrimiento Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños.

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por la Universidad de Washington en St. Louis institucional Animal cuidado uso Comité (protocolo 20160187) o atención Animal institucional de la Universidad de Pittsburgh y uso Comité (protocolo 14103918). Intestino fetal humano en menos de 24 semanas de gestación se obtuvo siguiendo las directrices de contratación de Universidad de Pittsburgh anatómica del tejido después de la aprobación de la Junta de revisión institucional (protocolo PRO141005...

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El epitelio intestinal se compone de muchos subtipos celulares que son responsables de proporcionar la defensa del huésped frente a patógenos, mantener la integridad de la barrera del intestino y pueden ser violados en la patogenia de varias enfermedades. Mientras que los modelos animales pueden recapitular algunas facetas de la enfermedad, el modelo ex vivo de enteroids derivadas del intestino de los ratones y los seres humanos proporciona una plataforma para probar efectos de varios tratamientos. La importan...

La enterocolitis necrotizante (NEC) es la principal causa de muerte por enfermedades gastrointestinales en los niños prematuros, que afecta a casi 1 en 10 bebés nacidos antes de las 29 semanas de gestación1,2,3. La mitad de los niños con el progreso de NEC para la forma más severa, donde la supervivencia es sólo 10-30%4,5. En los Estados Unidos, un estimado 2 billones USD al año se gastan tratando a niños con NEC6,7, sin embargo, la tasa de supervivencia ni terapia ha cambiado en los últimos 30 años. La patogenia de la NEC se caracteriza por lesiones intestinales y alteración mucosa curación8,9,10,11, sin embargo, las vías de señalización que conduce a una exacerbación respuesta inflamatoria y los mecanismos para revertir la inflamación permanecen incompleto entendidos.
La administración de leche humana se ha encontrado que la estrategia solamente protección contra NEC para recién nacidos prematuros. Previamente hemos demostrado que la leche materna protege contra el desarrollo de NEC mediante la inhibición de lo receptores inmunes innatas peaje-como el receptor 4 (TLR4) en el epitelio intestinal vía receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) señalización vía11. La suplementación de la leche materna a un fórmula experimental de NEC atenúa la respuesta inflamatoria en NEC según lo demostrado por inhibición de la apoptosis del enterocyte y restauración de la proliferación del enterocyte en una manera que depende de crecimiento epidérmico factor (EGF) y EGFR11. En otro estudio, se demostró que el nitrato, otro componente de la leche materna, contribuye a su naturaleza protectora modulando la perfusión intestinal, en comparación con fórmula infantil, que carece de nitrato y puede contribuir a la mayor frecuencia de NEC en fórmula alimentó a niños de12,13. Otros compuestos presentes en la leche materna que han demostrado para estar implicado en la protección contra el NEC son oligosacáridos de leche humana, L-arginina, glutamina y lactoferrina14,15,16, 1718,de,19. Estos elementos beneficiosos de la leche materna revelan la necesidad de su uso en la prevención de ECN, pero también subrayan la importancia de estudiar los mecanismos de señalización de vías y efectos celulares implicados en cómo la leche materna es mediar la protección contra el NEC .
En orden para otro estudio las propiedades protectoras de la leche materna en un modelo murino de NEC, hemos desarrollado una técnica novedosa, fácil de usar por que ratón puede extraerse leche materna de una presa anestesia mediante un pecho humano eléctrico bomba11,12 . Esta estrategia de adquirir leche de ratón es ventajosa, no sólo porque los extractores de leche humana son fácilmente disponibles y eficaces en la adquisición de la leche materna, sino también porque este método permite el análisis de leche de mama específicos. Como resultado, pueden comparar los efectos de la leche materna de ratón con los de la leche materna humana expresada como pasteurizada leche humana de donante de un banco de leche en modelos específicos. Esta técnica permite el estudio de los componentes de la leche materna en relación con su contribución a la prevención de NEC. Otros investigadores han desarrollado métodos de extracción de leche materna, sin embargo, estas técnicas son manuales y requieren típicamente más de un laboratorio miembro20,21,22. Aquí se presenta una técnica fácil que puede ser utilizada mediante la modificación de un extractor de leche eléctrico humano para recoger la leche de un ratón. Esta técnica puede aplicarse también a otras especies.
Para interrogar adecuadamente las vías de señalización involucradas con NEC, modelo de los sistemas es necesarios para evaluar todos los tipos de células diferentes a ser afectados en el proceso de la enfermedad. Aquí, discutimos una tal sistema modelo - enteroids - y su establecimiento del intestino humano y ratón. Enteroids intestinales humanos (HIEs) proporcionan en particular promesa significativa, ya que ofrecen un modelo humano innovador, genéticamente diversas ex vivo para ayudar en el estudio de procesos fisiopatológicos que ocurren en el tracto gastrointestinal 23. Enteroids se han encontrado para ser cultivadas a largo plazo y puede ser congelados para su posterior uso23, y a diferencia de los organoides Intestinal humano (HIOs), cuyos cultivos se desarrollan de células madre pluripotentes inducible, enteroids son generados a partir de células madre dentro de las criptas intestinales aislados24. Enteroids requieren menos mantenimiento, puede ser infectado rápidamente25y fácilmente se puede establecer desde las criptas intestinales se diferencian más que HIOs23. Por lo tanto, HIEs ofrecen muchas ventajas sobre las técnicas existentes porque puede ser desarrollados para cada región propiedades compositivas y funcionales del epitelio gastrointestinal humano23. El uso de enteroids es una opción altamente efectiva cuando se necesita un modelo humano del intestino, con apego a las limitaciones de cada región y facilidad de uso. Aquí se demuestra la técnica de aislamiento y mantenimiento de enteroids intestinal pequeño derivado de la célula de vástago primario de ratones y humanos prematuros.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin N (Insulin)</td>
			<td>Eli Lilly And Company</td>
			<td>0002-8315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030700112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030722116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030723112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G 1.5 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Double Electric Breast Pump</td>
			<td>Lansinoh</td>
			<td>044677530163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stoppers</td>
			<td>Frey Scientific</td>
			<td>560761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mki67 primer F: 5&#39;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#39; R: 5&#39;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Enteroids intestinales pequeño humanos se derivan de las criptas y cuando se cultiva en un nicho de células madre contienen todos los tipos de células epiteliales. La habilidad de establecer enteroide humanas ex vivo sistemas de cultivo son importantes Fisiopatología intestinal modelo y estudiar las respuestas celulares particulares involucrados. En los últimos años, enteroids de ratones y humanos son se cultiva, los e inclinada lejos para usarlos en varios laboratorios en todo el mundo. Esta plataforma enteroide puede utilizarse para probar los efectos de diversos tratamientos y medicamentos y qué efectos se ejercen sobre los diferentes tipos de células en el intestino. Aquí, un protocolo para el establecimiento de primaria enteroids intestinal pequeño derivados de células madre derivadas de ratones neonatales y proviene de intestino humano prematuro. Por otra parte, este sistema de cultivo enteroide fue utilizado para probar los efectos de la leche materna específica. Leche de ratón puede obtenerse eficientemente usando un extractor de leche humana modificada y leche de ratón expresa entonces puede ser utilizada para experimentos de investigación adicionales. Ahora nos demuestran los efectos de ratón expresado, humano, y leche materna de donante en el crecimiento y la proliferación de las enteroids derivadas de ratones neonatales o intestino humano prematuro.

Primero intentamos investigar ya sea leche materna o leche materna de donantes pasteurizada tuvo un efecto en pequeños enteroids intestinal. De hecho, la leche materna y leche materna de donante aumentan el crecimiento de ratón neonatal (figura 1A) y enteroids derivados humanos prematuros (figura 1B).
Puesto que la leche materna humana aumentó el crecimiento de peque...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Investigación

Medicina

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Un humano<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudiar la lesión Biología

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...