Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

الكتاب مدينون لجميع الأعضاء في مختبر بينتو-دو-Ó للمناقشة الهامة ذات الصلة. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا Programa الفقرة Ciência ه تكنولوجيا (إقليم العاصمة الاتحادية) في إطار مشروع "المهندسة كارديوستيم أنسجة القلب والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للقلب والأوعية الدموية التطبيقات" (ميتب-السل/اللجنة الاقتصادية لأوروبا/0013/2013). A.C.S. حاصلة على زمالة إقليم العاصمة الاتحادية [سفره/BD/88780/2012] و M.J.O. وهو "زميل إقليم العاصمة الاتحادية" (إقليم العاصمة الاتحادية-المحقق عام 2012).

وقد أقر جميع المنهجيات ووصف i3S لجنة الأخلاقيات الحيوان و Direção دي Geral Veterinária (دجاف)، وهي وفقا للبرلمان توجيه 2010/63/الأوروبي.
1-إعداد الحلول ديسيلولاريزيشن
ملاحظة: ديسيلولاريزيشن جميع الحلول ينبغي تصفيتها من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر والمخزنة لمدة أقصاها 3 أشهر، ...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو meshwork ديناميكية للغاية ومعقدة من glycoproteins الليفي ولاصقة، تتكون من خزان من الببتيدات النشطة بيولوجيا وفخ النمو عوامل عديدة. المغير الرئيسية التصاق الخلايا وديناميات cytoskeleton، حركية والهجرة، وانتشار، والتمايز والمبرمج، تنظم إدارة المحتوى في المؤسسة بنشاط وظيفة ال?...

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكة دينامية من الجزيئات التي تنظم العمليات الخلوية الهامة، إلا وهي مصير قرار،1،انتشار والتفريق2. وقد أجريت التحقيق في تفاعلات الخلية-ECM أساسا في ثنائي الأبعاد (2D) في الثقافات الأنابيب المغلفة مع مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تشكل تبسيط خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية الموجودة في فيفو. ديسيلولاريزيشن يولد اللاخلوي بيوسكافولدس ECM 3D تشبه إلى حد كبير الحفاظ على بنية الخلية وتكوين الأنسجة الأصلية والأجهزة3،4. بالإضافة إلى خدمة السقالات النشطة بيولوجيا لهندسة الأنسجة، الخارجة ديسيلولاريزيد الحيوية ECM 3D كمنصات جديدة لتقييم بيولوجيا الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة هذا التوازي المجراة في البيئة.
تقييم الدور التفاضلية لمكونات ECM أنسجة متميزة وأجهزة والعمر ستستفيد باستخدام بروتوكولات مماثلة لتوليد بيوسكافولدس الأصلية. في القلب، وقمنا بتطوير بروتوكول متعدد الاستخدامات ديسيلولاريزيشن عينات الأجنة والمستمدة من الكبار، كنهج بديل لإجراء دراسات مقارنة المكروية الجهاز. استخدام هذه المنهجية، استولت المكروية القلب الأصلي وأظهرت أن يعزز ECM الجنين غلات تعمير لخلايا القلب5. ديسيلولاريزيشن توفير مزيد من تحديد هوية المقيم الاختلافات الهيكلية بين ECM الجنين والكبار على مستوى ترتيب شبكة مصفوفة الصفيحة الطابق السفلي وبيريسيلولار والألياف تكوين5. قبل هذا العمل، أبلغ مقارنة وجها لوجه للأنسجة في مختلف مراحل التحور باستخدام نفس النهج ديسيلولاريزيشن فقط للقرد الريسوسي الكليتين وقلوب القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يقدم عدد محدود من الدراسات الأنسجة الجنينية/الجهاز ديسيلولاريزيشن في حد ذاتها5،،من67. وقد تم ذلك باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي كعامل ديسيلولاريزيشن فريدة من نوعها؛ ومع ذلك، استخدمت متميزة الحزب الديمقراطي الصربي تركيزات ديسيلولاريزيشن الجنين والكبار من أنسجة القلب7،8. الحزب الديمقراطي الصربي هو واحد من المنظفات الأيونية الأكثر فعالية لإزالة المواد النووية وحشوية، وتستخدم على نطاق واسع في ديسيلولاريزيشن لمختلف الأنسجة والعينات9،من10. المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من الحزب الديمقراطي الصربي، وفترات طويلة من التعرض لها قد يرتبط تمسخ البروتين، فقدان glycosaminoglycan (الكمامات) واضطراب ييفات الكولاجين10،11، ومن ثم التوازن بين إزالة الحفاظ عليها وخلية إدارة المحتوى في المؤسسة أمر ضروري. لتطبيق نفس الإجراء على أنسجة قلب الجنين والكبار، يتم تقسيم البروتوكول الموضحة هنا في ثلاث خطوات متتابعة: خلية تفسخ بصدمة ناضح (المخزن المؤقت ناقص التوتر)؛ سولوبيليزاتيون تفاعلات البروتينات الدهنية والبروتين الحمض النووي والبروتين-بروتين (الحزب الديمقراطي الصربي 0.2 ٪)؛ وإزالة المواد النووية (الدناز المعاملة).
لدينا بروتوكول يظهر العديد من المزايا: أنا) إمكانية أي ما يعادل ديسيلولاريزيشن من أنسجة القلب سن معينة من تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن؛ ثانيا) أي متطلبات للأساليب المتخصصة أو المعدات؛ ثالثا) جاهزة التكيف للأنسجة والأنواع الأخرى كما أنها قد طبقت بنجاح مع تعديلات طفيفة في خزعات الأمعاء البشرية12 والماوس الرئة13؛ والأهم من ذلك، رابعا) يمكن معالجة خصائص النشاط الحيوي ECM حين تمكن الجمعية العامة الثقافات مثل 3D أورجانوتيبيك أكثر عن كثب تحاكي ملامح الجزيئية المكروية الأنسجة الأصلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

المعرفة الحالية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)-الاتصالات خلية يترجم إلى الدراسات الكبيرة الثقافة في المختبر (2D) ثنائي الأبعاد حيث يتم عرض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة كطلاء سطح. وهذه النظم الثقافة تشكل تبسيطا للطبيعة المعقدة للأنسجة ECM التي تشمل تشكيل البيوكيميائية وهيكل وخصائص ميكانيكية. لمحاكاة أفضل الاتصالات ECM-خلية تشكيل المكروية القلب، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ديسيلولاريزيشن قلب الجنين كله وأنسجة البطين الأيسر الكبار اكسبلانتس في نفس الوقت للدراسات المقارنة. البروتوكول يجمع بين استخدام مخزن مؤقت ناقص التوتر، مطهر خصائص السطح أنيونى، ومعاملة الدناز دون أي اشتراط للمهارات المتخصصة أو المعدات. تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن عبر عينات الأنسجة من مواضيع عصر مختلف نهج بديل لإجراء دراسات مقارنة. يسمح هذا البروتوكول تحديد الاختلافات الهيكلية فريدة من نوعها عبر الجنين والكبار القلب ECM مش والبيولوجية الخلوية الردود. وعلاوة على ذلك، هذه الوثيقة يوضح منهجية تطبيق أوسع نطاقا يجري تطبيقها بنجاح في أنسجة أخرى والأنواع مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة، كما هو الحال في خزعات الأمعاء البشرية والرئة الماوس.

وينبغي تقييم كفاءة ديسيلولاريزيشن من خلال التقنيات الرئيسية الثلاثة: المراقبة العيانية، وعلم الأنسجة والكمي الحمض النووي. ويؤثر العيانية مظهر عينات بوست--الحزب الديمقراطي الصربي العلاج غير مباشر فعالية إزالة خلية. بعد حضانة الحزب الديمقراطي الصربي، يجب أن تظهر العينا?...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.

ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الهامة في مجال القلب والأوعية الدموية حول تأثير المصفوفة خارج الخلية خلال المراحل الفسيولوجية والتنموية المختلفة للقلب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل مقارن بين مصفوفات خارج الخلية للجنين والبالغين من خلال تطبيق طريقة مماثلة للفك الخلوي على كلا النوعين من الأنسجة. لذلك كانت هذه الطريقة ناجحة تطبيقها على أجهزة أخرى مثل استئصالات جراحية من مرضى السرطان مما يسهل دراسة المصفوفة خارج الخلية في سياقات مختلفة.تبدأ من خلال الشطف لفترة وجيزة قلوب الماوس الجنين والكبار مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. ثم ضع الأنسجة تحت مجهر تشريح واستخدام مقص صغير مستقيم لإزالة الأذين ، البطين الأيمن ، وsa من قلوب الماوس الكبار. نقل البطين الأيسر إلى طبق بيتري جديد وتقسيم الجدار الأيسر خالية من البطين إلى شرائط طولية سميكة اثنين ملليمتر.استخدام الماوس الكبار البطين الأيسر explantle من حجم متجانس أمر ضروري لكفاءة إزالة الخلية متسقة. استخدام مشرط وملاقط مسننة مع طرف منحني لإزالة العضلات الحليمة قبل استخدام اثنين من اثنين من ملليمتر الشبكة لمزيد من الشرائط المفروم إلى أجزاء أصغر الأنسجة. عندما تم مفر من جميع الأنسجة، شطف لفترة وجيزة القطع مع برنامج تلفزيوني ما يكفي لتغطية explants.ونقل قلوب الجنين وقطع من أنسجة القلب الكبار إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر microcentuge تحتوي على 250 ميكرولترات من درجة حرارة القطع الأمثل أو مركب أكتوبر لكل أنبوب. ثم، تجميد عينات أنسجة القلب في الجليد الجاف تبريد إيسوبنتين لتخزينها في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. لفك الخلايا الأنسجة المحفوظة بالتبريد وضع العينات المجمدة في طبق بيتري تحتوي على ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية تماما explants.بعد أن ذاب أكتوبر، غمر العينات في طبق بيتري جديد من برنامج تلفزيوني وغسل العينات ثلاث مرات على شاكر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 60 دورة في الدقيقة في كل غسل. بعد الغسيل الأخير، إضافة ملليلتر واحد من العمل العازلة الهابتة إلى كل بئر من العقيمة 24-جيدا لوحة الأنسجة ثقافة واستخدام الملباب غرامة لنقل جزء واحد إلى كل بئر. احتضان لوحة في 25 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، في 165 دورة في الدقيقة تليها ثلاثة يغسل ساعة واحدة في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر، في غسل.بعد الغسيل الأخير، أضف ملليلتر واحد من سلفات دوديسيل الصوديوم الطازجة أو محلول SDS لكل بئر لاحتضان لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. في اليوم التالي، شطف العينات مع ثلاث غسل 20 دقيقة في ملليلتر واحد من عازلة غسل تحت ضغط الدم لكل غسل تليها إضافة ملليلتر واحد من العلاج DNase حل لكل بئر لمدة ثلاث ساعات الحضانة، في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، يجب أن تفقد العينات التي تم إزالة الخلايا من خلاياها اتساقها الشبيه بالجيلاتين.ثم غسل شظايا الأنسجة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة لكل غسل تليها غسل بين عشية وضحاها في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد في البئر في درجة حرارة الغرفة و 60 دورة في الدقيقة. لتقييم إزالة بقايا الخلايا من الأنسجة منزوعة الخلايا، في صباح اليوم التالي إصلاح العينات في ملليلتر واحدة من جديد أعد 10٪ صيغة عازلة محايدة تكملة مع 0.03٪ من يوسين مائي في بئر لمدة 2.5 إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، وغسل العينات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر.واستخدام قالب عينة الفينيل المتاح لتغليف شظايا decellularized في هلام معالجة الأنسجة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. بعد ذلك، نقل الأجزاء المغلفة إلى خزعة معالجة تضمين كاسيت. وعملية العينات لالبارافين تضمين من خلال حضانات متتالية لمدة 30 دقيقة في تركيزات تصاعدية من الإيثانول، محلول الهيدروكربون الأليفاتيك الأليفاتيك متساوي الوباليك واثنين من 56 درجة مئوية البرافين يظهر.بعد البارافين الناشئة الثانية، قم بتركيب عينات في كتلة البارافين واستخدام ميكروتوم للحصول على ثلاثة ميكرومتر سميكة المقاطع. ثم تحقق من كفاءة إزالة الخلايا عن طريق تلطيخ المقاطع مع البقع ثلاثية الألوان haematoxylin وeosin وماسون وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد غسل برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها مع اهتزاز، إضافة 500 ميكرولترات من DPBS أعدت حديثا، تستكمل مع 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من أمفوتريسين B 1٪ محلول المضادات الحيوية لكل سقالة.وتخزين العينات لمدة يوم إلى سبعة أيام في أربع درجات مئوية. قبل الجلوس في الخلايا، استبدال حل DPBS مع 500 ميكرولترات من المتوسطة القاعدية الخلية تكملها المضادات الحيوية. واحتضان السقالات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، استخدم المجهر لإضافة أربعة قطرات ميكرولتر من DPBS إلى مركز بئر واحد من 96-جيدا لوحة لكل سقالة. واستخدام ملاقط مستقيمة رقيقة لنقل سقالة واحدة decellularized إلى الجزء العلوي من كل قطرة. قم بإزالة أي DPBS إضافية عن طريق الطموح وتأكد من أن السقالة غير مطوية أو مجعدة.عندما جفت السقالات على الحواف، ببطء مقعد تعليق خلية واحدة من الخلايا ذات الاهتمام على الجزء العلوي من كل سقالة. تتميز الأنسجة المزيلة الخلايا الجنينية 18 بهيكل شفاف للغاية بينما تظهر الإكراميات البالغة مظهرًا شفافًا إلى اللون الأبيض. هيماتيوكسيلين وosin وماسون trichome البقع تأكيد إزالة الخلايا كفاءة من خلال وجود شبكة مسامية.يتم تخفيض المواد النووية بنسبة 99.8٪ تقريبًا بعد إزالة الخلايا ، مقارنة بالأنسجة غير المتلاعب بها والتي تعد ضرورية لتجنب إثارة استجابة التهابية غير مرغوب فيها عند الزرع. يمكن رصد قابلية الخلية للحياة داخل السقالات الجالسة أثناء الثقافة في المختبر عن طريق تلطيخ الكالسين. يمكن أيضا إجراء تحليل المحطة الطرفية لإعادة تكدس الخلايا وتوزيعها عبر السقالات ، بعد معالجة البارافين كما لوحظ في هذه الصور التمثيلية لقسم bioscaffold المركزي.لذلك مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في استكشاف الخصائص النشطة بيولوجيا من مصفوفة خارج الخلية من قلوب الماوس الجنين والكبار ولكن أيضا من الأنسجة الأخرى.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

تغليف الخلايا العضلية في هيدروجيل الفايبرين للهندسة الأنسجة القلبية

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

هندسة الأنسجة ل3D الإنسان<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ورم اختبار

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

بروتوكول لنقل ميكرورنا إلى المشتقة من نخاع العظام المكونة للدم الخلايا الجذعية البالغة لتمكينها هندسة الخلايا جنبا إلى جنب مع استهداف المغناطيسي

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

طريقتين ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية لتطبيقات هندسة الأنسجة

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...