Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Forfatterne står i gæld til alle medlemmer af Pinto--Ó laboratorium for relevante kritisk diskussion. Dette arbejde blev støttet af Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) under projektet "CARDIOSTEM-manipuleret hjerte væv og stem cell-baserede terapier for hjerte-kar-programmer" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. er en modtager af en FCT stipendium [SFRH/BD/88780/2012] og M.J.O. er en FCT fyr (FCT-Investigator 2012).

Alle metoderne beskrevet blev godkendt af de i3S dyr etiske komité og Direção Geral de Veterinária (DGAV) og er i overensstemmelse med det europæiske Parlamentet direktiv 2010/63/EU.
1. forberedelse af decellularization løsninger
Bemærk: Alle decellularization løsninger skal filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter og gemt i en periode på højst 3 måneder, medmindre andet angives.
<ol><li>For 1 x PBS: Bland 8 g NaCl, 1,01 g Na2HPO4</sub...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en meget dynamisk og kompleks meshwork af fiber og klæbende glykoproteiner, bestående af et reservoir af mange bioaktive peptider og fanget vækstfaktorer. Som den store modulator celle vedhæftning, cytoskeleton dynamics, motilitet/migration, spredning, differentiering og apoptose regulerer ECM aktivt cellefunktion og adfærd. Vel vidende at cellulære adfærd afviger i 2D og 3D kulturer, har der været bestræbelser på at udvikle nye organotypic modeller, der kan præcist replike...

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk netværk af molekyler, der regulerer vigtige cellulære processer, nemlig skæbne-beslutning, spredning og differentiering1,2. Undersøgelsen af celle-ECM interaktioner er udført primært i todimensionale (2D) i vitro kulturer belagt med ECM komponenter, der udgør en forenkling af indfødte ECM egenskaber findes i vivo. Decellularization genererer acellulær 3D-lignende ECM bioscaffolds, der i høj grad bevarer den ekstracellulære arkitektur og sammensætningen af indfødte væv og organer3,4. Ud over at fungere som bioaktive stilladser for vævsmanipulering, decellularized 3D ECM biomaterialer fremstår som nye platforme at vurdere celle-ECM biologi at parallel in vivo miljø.
Vurdering af ECM komponenter af forskellige væv, organer og alder differential rolle vil gavne med brug af lignende protokoller at generere indfødte bioscaffolds. I hjertet, har vi udviklet en alsidig protokol for decellularization af føtale og voksne-afledte prøver, som en alternativ tilgang til at udføre sammenlignende undersøgelser af orgel mikromiljø. Du bruger denne metode, vi fanget den indfødte hjerte mikromiljø og viste, at fostrets ECM fremmer højere genindsættelse udbytter af cardiac celler5. Decellularization fastsat yderligere identifikation af hjemmehørende strukturelle forskelle mellem føtale og voksne ECM på niveau med kælder lamina og pericellular matrix mesh arrangement og fiber sammensætning5. Forud for dette arbejde, er head-to-head sammenligning af væv på forskellige ontogenic faser ved hjælp af den samme decellularization tilgang kun blevet rapporteret til rhesus abe nyrer og gnaver hjerter. Derudover rapport et begrænset antal undersøgelser føtalt væv/organ decellularization i sig selv5,6,7. Dette er opnået ved hjælp af SDS som en unik decellularization agent; dog blev særskilt SDS koncentrationer brugt til decellularization af føtale og voksne hjerte væv7,8. SDS er en af de mest effektive Ioniske detergenter for clearance af cytoplasmatisk og nukleart materiale, og udbredt i decellularization af forskellige væv og prøver9,10. Opløsninger indeholdende høje SDS koncentrationer og længere perioder af eksponering er blevet korreleret med protein denaturering, glykosaminoglykan (gag) tab og forstyrrelser af kollagen fibriller10,11, og derfor en balance mellem ECM bevarelse og celle fjernelse er nødvendige. For at anvende samme procedure føtale og voksne hjerte væv, protokollen beskrevet heri er opdelt i tre sekventielle trin: celle lysering af osmotisk chok (hypotonic buffer); oploesning af lipid-proteiner, DNA-protein og protein-protein interaktioner (0,2% SDS); og nukleare materialeaftagning (DNase behandling).
Vores protokollen viser flere fordele: Jeg) muligheden for tilsvarende decellularization af aldersspecifikke hjerte væv ved anvendelse af den samme decellularization strategi; II) ingen krav til specialiserede metoder eller udstyr; III) klar tilpasning til andre væv og arter, som det har været anvendt med succes med mindre ændringer i human tarmen biopsier12 og mus lunge13; og, vigtigst, iv) kan løse ECM biomekaniske egenskaber samtidig med at forsamlingen af 3D-lignende organotypic kulturer, mere nøje efterligne de molekylære funktioner af den oprindelige væv mikromiljø.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Nuværende viden af ekstracellulære matrix (ECM)-celle kommunikation kan oversættes til store todimensionale (2D) in vitro kultur studier hvor ECM komponenter er præsenteret som en overfladebehandling. Systemerne kultur udgør en forenkling af den komplekse karakter af væv ECM, der omfatter biokemiske sammensætning, struktur og mekaniske egenskaber. For at bedre emulere ECM-celle kommunikation forme den kardiale mikromiljø, vi udviklede en protokol, der giver mulighed for decellularization af den hele fosterets hjerte og voksen venstre ventrikel væv explants samtidigt for sammenlignende undersøgelser. Protokollen kombinerer brugen af et hypotonic buffer, et rengøringsmiddel af anioniske overfladeaktive egenskaber, og DNase behandling uden krav til specialiserede færdigheder eller udstyr. Anvendelse af den samme decellularization strategi på tværs af vævsprøver fra fag af forskellige alder er en alternativ metode til at udføre sammenlignende undersøgelser. Denne protokol giver mulighed for identifikation af unikke strukturelle forskelle på tværs af føtale og voksne hjerte ECM mesh og biologiske cellulære svar. Desuden, den heri metode viser et bredere program anvendes med succes i andre væv og arter med mindre justeringer, som i human tarmen biopsier og mus lunge.

Decellularization effektivitet skal vurderes gennem tre vigtigste teknikker: makroskopisk observation, histologi og DNA kvantificering. Den makroskopiske udseende af prøver post-SDS behandling påvirker indirekte effektiviteten af cellen fjernelse. Efter SDS inkubation, skal prøver vises som gennemsigtige ved hvidlig (figur 1 c). Føtalt (E18) decellularized væv er karakteriseret ved en meget gennemsigtig struktur, mens voksne explants har en gennemskinnel...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Den kardiale ekstracellulære matrix (ECM) er et komplekst netværk af molekyler, der orkestrere centrale processer i væv og organer mens enduring fysiologiske remodeling hele livet. Standardiseret decellularization af føtale og voksne hjerter tillader sammenlignende eksperimentelle undersøgelser af både væv i forbindelse med 3D ved at indfange indfødte arkitektur og biomekaniske egenskaber.

Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Denne metode kan hjælpe med at løse vigtige spørgsmål i det kardiovaskulære område om den virkning, den ekstracellulære matrix har under forskellige fysiologiske og udviklingsmæssige stadier af hjertet. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for en sammenlignende analyse mellem føtale og voksne ekstracellulære matricer ved at anvende en lignende decellularisering metode til begge typer af væv. Så denne metode har været en succes anvendes til andre organer såsom kirurgiske resektion fra kræftpatienter lette studiet af den ekstracellulære matrix i forskellige sammenhænge.Begynd med kort at skylle de føtale og voksne musehjerter med iskold PBS. Derefter placere væv under en dissekere mikroskop og bruge lige lille saks til at fjerne atria, højre hjertekammer, og septa fra den voksne mus hjerter. Overfør venstre hjertekammer til en ny petriskål og del venstre ventrikel fri væg i to millimeter tykke langsgående strimler.Brugen af voksne mus venstre ventrikel explants af en homogen størrelse er afgørende for en konsekvent decellularization effektivitet. Brug skalpel og savtakkede pincet med buet spids til at fjerne papillærmusklen, før du bruger en to med to millimeter gitter til yderligere hakke strimlerne i mindre væv fragmenter. Når alt vævet er hakket, skylles stykkerne kortvarigt med nok PBS til at dække explants.Og overføre føtale hjerter og stykker af voksne hjertevæv i individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, der indeholder 250 mikroliter af optimal skæretemperatur eller OCT sammensatte pr rør. Derefter fryse hjertevæv prøver i tøris afkølet isåbnet til opbevaring ved negative 80 grader Celsius. For at decellularisere kryokonserverede væv placere de frosne prøver i en petriskål, der indeholder nok PBS til helt at dække explants.Når OLT er smeltet, nedsænkes prøverne i en ny petriskål af PBS, og prøverne vaskes tre gange på en shaker i 10 til 15 minutter ved 60 omdr.//vaskes. Efter den sidste vask, tilsæt en milliliter af arbejdende hypotonisk buffer til hver brønd af en steril 24-godt væv kultur plade og bruge fine kraftbelining til at overføre et fragment til hver brønd. Pladen inkuberes ved 25 grader Celsius i 18 timer ved 165 omdr./min. efterfulgt af tre times vask i en milliliter PBS pr. brønd pr. vask.Efter den sidste vask tilsættes en milliliter frisklavet natriumdycylsulfat eller SDS-opløsning til hver brønd til en 24-timers inkubation ved 25 grader Celsius. Den næste dag skylles prøverne med tre 20 minutters vask i en milliliter hypotonisk vask buffer pr vask efterfulgt af tilsætning af en milliliter DNase behandlingsopløsning til hver brønd for en tre-timers inkubation, ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning skal de decellulariserede prøver miste deres gelatinelignende konsistens.Vævsfragmenterne vaskes tre gange med en milliliter PBS i 20 minutter pr. vask efterfulgt af en natvask i en milliliter frisk PBS pr. brønd ved stuetemperatur og 60 omdr./min. For at vurdere fjernelsen af cellulære rester fra det decellulariserede væv, den næste morgen fastsætte prøverne i en milliliter frisklavet 10% formel neutral buffer suppleret med 0,03% af vandig eosin per brønd i 2,5 til tre timer ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne i en milliliter PBS pr. brønd.Og bruge en engangs vinyl prøve skimmel til at indkapsle decellulariserede fragmenter i histologi forarbejdning gel i henhold til producentens specifikationer. Dernæst overføre de indkapslede fragmenter til en biopsi behandling indlejring kassette. Og bearbejde prøverne til paraffinindlejring gennem successive 30-minutters inkubationer i stigende koncentrationer af ethanol, isoparaffinisk alifatisk kulbrinteopløsning og to 56 grader Celsius paraffin opstår.Efter den anden paraffin emergent monteres prøverne i en paraffinblok, og der anvendes en mikrotom til at opnå tre mikrometer tykke sektioner. Kontroller derefter decellulariseringseffektiviteten ved at farvning af sektionerne med hæmatoxylin og eosin og Massons trikrompletter i henhold til standardprotokollerne. Efter natten PBS vask med omrystning, tilsættes 500 mikroliter frisklavet DPBS, suppleret med 2,5 mikrogram pr. milliliter amphotericin B 1%antibiotikumopløsning til hvert stillads.Og opbevar prøverne i en til syv dage ved fire grader Celsius. Før du sidder cellerne, skal DPBS-opløsningen udskiftes med 500 mikroliter celle basalt medium suppleret med antibiotika. Og inkuber stilladserne i en time ved 37 grader Celsius.I slutningen af inkubationen skal du bruge et mikroskop til at tilføje en fire mikroliter dråbe DPBS til midten af en brønd på en 96-brøndplade pr. stillads. Og brug tynde lige pincet til at overføre en decellulariseret stillads til toppen af hver dråbe. Fjern eventuelle ekstra DPBS ved aspiration og bekræfte, at stilladset ikke er foldet eller rynket.Når stilladserne er tørret i kanterne, langsomt sæde en enkelt celle suspension af celler af interesse på toppen af hvert stillads. Embryonale dag 18 decellulariserede væv er karakteriseret ved en meget gennemsigtig struktur, mens voksne explants udviser en gennemsigtig til hvidt udseende. Hematoxylin og eosin og Masson's trichome pletter bekræfte en effektiv celle fjernelse af tilstedeværelsen porøse mesh.Det nukleare materiale reduceres med ca. 99,8% efter decellularisering sammenlignet med ikke-manipuleret væv, som er afgørende for at undgå at udløse en uønsket inflammatorisk reaktion ved implantation. Cellens levedygtighed inden for siddende stilladser kan overvåges under in vitro-kulturen ved kalceinfarvning. Terminalanalyse af cellerepopulation og distribution på tværs af stilladser, kan også udføres efter paraffinbehandling som observeret i disse repræsentative billeder af en central bioscaffold sektion.Så denne teknik banede vejen for forskere i udforskningen af de bioaktive egenskaber af den ekstracellulære matrix fra føtale og voksne mus hjerter, men også af andre væv.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillarkraft Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering af et menneske 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal Cardiac Stilladser: Nye Matricer til regenerativ Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikation af ekstracellulære matrix-afledte Skum og Mikrobærere som Tissue-specifikke cellekultur og Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

To metoder til Decellularization af plantevæv til Tissue Engineering applikationer

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...