Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

De auteurs zijn dank verschuldigd aan alle leden van Pinto-Ken-Ó laboratorium voor relevante kritische bespreking. Dit werk werd gesteund door Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) kader van het project "CARDIOSTEM-Engineered cardiale weefsels en stamcel gebaseerde therapieën voor cardiovasculaire toepassingen" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. is een ontvanger van een FCT fellowship [SFRH/BD/88780/2012] en M.J.O. is een FCT Fellow (FCT-onderzoeker 2012).

Alle van de beschreven methoden werden goedgekeurd door de i3S dier ethische Commissie en Direção Geral de Veterinária (DGAV) en zijn volgens de Europese Parlement richtlijn 2010/63/EG.
1. bereiding van de oplossingen van de decellularization
Opmerking: Alle decellularization oplossingen moeten worden gefilterd door een 0,22 μm membraanfilter en opgeslagen voor een maximum van 3 maanden, behalve anders vermeld.
<ol><li>Voor 1 x PBS: Meng 8 g NaCl, 1.01 g nb<su...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

De extracellulaire matrix (ECM) is een zeer dynamische en complexe Zitschalen van vezelig en zelfklevende glycoproteïnen, bestaande uit een reservoir van tal van bioactieve peptiden en prikroller groeifactoren. Als de grote modulator van cel adhesie, cytoskelet dynamiek, beweeglijkheid/migratie, proliferatie, differentiatie en apoptosis regelt ECM actief cellulaire functie en gedrag. Wetende dat cellulaire gedrag in 2D- en 3D-culturen verschilt, zijn er inspanningen voor de ontwikkeling van nieuwe organotypic modellen d...

De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamisch netwerk van moleculen die belangrijke cellulaire processen, namelijk de lot-besluit, de proliferatie en differentiatie van de1,2te reguleren. Het onderzoek van de cel-ECM interacties heeft verricht voornamelijk in tweedimensionale (2D) in vitro culturen bekleed met ECM componenten, die vormen een vereenvoudiging van de inheemse ECM eigenschappen gevonden in vivo. Decellularization genereert Acellulair 3D-achtige ECM bioscaffolds dat grotendeels de extracellulaire architectuur en samenstelling van inheemse weefsels en organen3,4 behouden. Naast bioactieve steigers voor weefselengineering bijeenkomen, zijn decellularized 3D ECM biomaterialen opkomst als nieuwe platformen te beoordelen van de biologie van de cel-ECM die parallel de in vivo milieu.
Beoordeling van het differentiële rol van de ECM-componenten van verschillende weefsels, organen en leeftijd zullen profiteren met het gebruik van soortgelijke protocollen van het genereren van de inheemse bioscaffolds. In het hart, hebben we een veelzijdige protocol voor decellularization van foetale en volwassene afkomstige monsters, ontwikkeld als een alternatieve benadering voor het uitvoeren van vergelijkende studies van de orgel-communicatie. Met behulp van deze methode, wij gevangen de inheemse cardiale communicatie en toonde dat foetale ECM hogere opbrengsten van de herbevolking van hartcellen5 bevordert. Decellularization verstrekt verdere identificatie van resident structurele verschillen tussen de foetale en volwassen ECM op het niveau van de kelder lamina en pericellular matrix mesh regeling en vezel samenstelling5. Voorafgaand aan dit werk, is er alleen head-to-head vergelijking van weefsels in verschillende ontogenic stadia met behulp van dezelfde decellularization aanpak gemeld voor rhesus monkey nieren en knaagdier harten. Bovendien, verslag een beperkt aantal studies foetaal weefsel/orgel decellularization per se5,6,7. Dit werd bereikt met behulp van SDS als een agent van de unieke decellularization; echter, verschillende SDS concentraties werden gebruikt voor de decellularization van foetale en volwassen cardiale weefsel7,8. SDS is een van de meest effectieve Ionische detergentia voor goedkeuring van de cytoplasmatische en nucleair materiaal, en op grote schaal gebruikt in de decellularization van verschillende weefsels en specimens9,10. Oplossingen met hoge concentraties van SDS en langere blootstellingsduur hebben zijn gecorreleerd met denaturatie van eiwit, glycosaminoglycaan (GAGs) verlies en verstoring van collageen fibrillen10,11, en dus een evenwicht tussen ECM behoud en cel verwijdering is noodzakelijk. Als u wilt dezelfde procedure foetale en volwassen hartweefsel, het protocol hierin beschreven is verdeeld in drie opeenvolgende stappen: lysis van de cel door osmotische schok (hypotone buffer); solubilisatie van DNA-eiwit, lipide-eiwit en eiwit-eiwit interacties (0,2% SDS); en nucleaire materiaal verwijderen (DNase behandeling).
Ons protocol toont verschillende voordelen: ik) de mogelijkheid van gelijkwaardige decellularization van de cardiale weefsels leeftijds-specifieke door de toepassing van dezelfde decellularization strategie; II) geen vereisten voor gespecialiseerde methoden of apparatuur; III) klaar aanpassing aan andere weefsels en soorten als het succesvol is vereffend met kleine veranderingen in de menselijke darm biopsieën12 en muis Long13; en, belangrijker, iv) ECM biomechanische eigenschappen terwijl het toelaten van de vergadering van 3D-achtige organotypic culturen dat meer nauw na te de moleculaire eigenschappen van het oorspronkelijke weefsel communicatie bootsen kunnen worden aangepakt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Huidige kennis van extracellulaire matrix (ECM)-cel communicatie vertaalt naar grote tweedimensionale (2D) in vitro Cultuurwetenschappen waar ECM componenten worden gepresenteerd als een oppervlaktecoating. Deze cultuur systemen vormen een vereenvoudiging van de complexe aard van het weefsel ECM die biochemische samenstelling, structuur en mechanische eigenschappen omvat. Beter wordt geëmuleerd doordat de ECM-cel communicatie vormgeven van de cardiale communicatie, ontwikkelden we een protocol waarmee voor de decellularization van het hele foetale hart en volwassen linkerventrikel weefsel explants gelijktijdig voor vergelijkende studies. Het protocol combineert het gebruik van een hypotone buffer, een detergens van anionogene oppervlakteactieve stof eigenschappen en DNase behandeling zonder enige eis voor gespecialiseerde vaardigheden of apparatuur. De toepassing van dezelfde decellularization strategie over weefselmonsters van onderwerpen van verschillende leeftijd is een alternatieve benadering vergelijkende studies te verrichten. Dit protocol maakt de identificatie van unieke structurele verschillen over foetale en volwassen cardiale ECM mesh en biologische cellulaire reacties. Bovendien, de hierin methodologie toont een bredere toepassing wordt met succes toegepast in andere weefsels en soorten met kleine aanpassingen, zoals in de menselijke darm biopsieën en muis longkanker.

De efficiëntie van de decellularization moet worden beoordeeld door middel van de drie belangrijkste technieken: macroscopische observatie, histologie en kwantificering van het DNA. De macroscopische verschijning van monsters post-SDS behandeling heeft niet indirect invloed op de werkzaamheid van cel verwijderen. Na een incubatieperiode van SDS, monsters moeten worden weergegeven als doorschijnend onder witachtig (Figuur 1 c). Fetal (E18) decellularized weef...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

De cardiale extracellulaire matrix (ECM) is een complex netwerk van moleculen die orkestreren van belangrijke processen in weefsels en organen terwijl blijvende fysiologische remodelleren gedurende het hele leven. Gestandaardiseerde decellularization van foetale en volwassen hart toelaat vergelijkende experimentele studies van beide weefsels in een 3D-kader door het vastleggen van inheemse architectuur en biomechanische eigenschappen.

Vergelijkbare Decellularization van foetale en volwassen cardiale weefsel explantaten als 3D-achtige platformen voor In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van belangrijke vragen in het cardiovasculaire veld over de impact van de extracellulaire matrix heeft tijdens verschillende fysiologische en ontwikkelingsstadia van het hart. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een vergelijkende analyse tussen foetale en volwassen extracellulaire matrices mogelijk maakt door een vergelijkbare decellularisatiemethode toe te passen op beide soorten weefsel. Dus deze methode is succesvol toegepast op andere organen, zoals chirurgische resecties van kankerpatiënten die de studie van de extracellulaire matrix in verschillende contexten vergemakkelijken.Begin met het kort spoelen van de foetale en volwassen muisharten met ijskoude PBS. Plaats vervolgens de weefsels onder een ontledenmicroscoop en gebruik rechte kleine schaar om de atria, rechter ventrikel, en de septa van de volwassen muis harten te verwijderen. Breng de linker ventrikel over op een nieuwe Petrischaal en verdeel de linker ventrikelvrije muur in twee millimeter dikke longitudinale strips.Het gebruik van volwassen muis linker ventrikel explants van een homogene grootte is essentieel voor een consistente decellularisatie-efficiëntie. Gebruik de scalpel en gekartelde pincet met gebogen punt om de papillaire spier te verwijderen voordat u een raster van twee bij twee millimeter gebruikt om de strips verder te gehakt in kleinere weefselfragmenten. Wanneer al het weefsel is gehakt, kort spoelen de stukken met voldoende PBS om de explants te dekken.En breng de foetale harten en stukjes volwassen hartweefsel over in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen met 250 microliter van optimale snijtemperatuur of OCT-verbinding per buis. Bevries vervolgens de hartweefselmonsters in droogijs gekoelde isopentane voor opslag bij negatieve 80 graden Celsius. Om de cryo-bewaarde weefsels te decellulariseren, worden de bevroren monsters in een petrischaaltje geplaatst met voldoende PBS om de explants volledig te bedekken.Nadat de OCT gesmolten is, dompel de monsters onder in een nieuwe petrischaal van PBS en was de monsters drie keer op een shaker gedurende 10 tot 15 minuten bij 60 RPM per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt een milliliter werkende hypotonische buffer toe aan elke put van een steriele weefselkweekplaat van 24 put en gebruik fijne tangen om één fragment naar elke put over te brengen. Incubeer de plaat op 25 graden Celsius gedurende 18 uur, bij 165 RPM, gevolgd door drie wasbeurten van een uur in een milliliter PBS per put, per wasbeurt.Voeg na de laatste wasbeurt een milliliter vers bereid natriumdoekcylsulfaat of SDS-oplossing toe aan elke put voor een 24-uurs incubatie bij 25 graden Celsius. De volgende dag, spoel de monsters met drie 20 minuten wast in een milliliter hypotonische wasbuffer per wasbeurt, gevolgd door de toevoeging van een milliliter van DNase behandeling oplossing om elke put voor een drie uur durende incubatie, op 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie moeten de gecellulariseerde monsters hun gelatineachtige consistentie verliezen.Was vervolgens de weefselfragmenten drie keer met een milliliter PBS gedurende 20 minuten per wasbeurt, gevolgd door een nachtelijke wasbeurt in één milliliter verse PBS per put bij kamertemperatuur en 60 RPM. Om de verwijdering van cellulaire resten uit het gedecelluleerde weefsel te beoordelen, stelt u de volgende ochtend de monsters vast in een milliliter vers bereide 10%-formuleneutrale buffer aangevuld met 0,03% waterige eosine per put gedurende 2,5 tot drie uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de monsters in een milliliter PBS per put.En gebruik een wegwerp vinyl monster mal om de gedecellulariseerde fragmenten in histologie verwerking gel kapselen volgens de specificaties van de fabrikant. Breng vervolgens de ingekapselde fragmenten over naar een biopsieverwerkingscassette. En verwerk de monsters voor paraffine inbedding door opeenvolgende 30-minuten incubaties in opgaande concentraties ethanol, isoparaffinic aliphatische koolwaterstofoplossing en twee 56 graden Celsius paraffine emergens.Na de tweede paraffine emergent, mount monsters in een paraffine blok en gebruik een microtome om drie micrometer dikke secties te verkrijgen. Controleer vervolgens de decellularisatie-efficiëntie door de secties te bevlekken met hematoxylin en eosine en Masson's trichrome vlekken volgens standaardprotocollen. Na de nachtelijke PBS wassen met schudden, voeg 500 microliter vers bereide DPBS, aangevuld met 2,5 microgram per milliliter amphotericine B 1%antibioticum oplossing aan elke steiger.En bewaar de monsters voor een tot zeven dagen op vier graden Celsius. Voordat u de cellen plaatst, vervangt u de DPBS-oplossing door 500 microliter van celbasaal medium aangevuld met antibiotica. En broeden de steigers voor een uur op 37 graden Celsius.Gebruik aan het einde van de incubatie een microliterdrop van DPBS aan het midden van een put van een 96-putplaat per steiger. En gebruik dunne rechte pincet om een gedecellulariseerde steiger naar de bovenkant van elke druppel over te brengen. Verwijder eventuele extra DPBS door aspiratie en bevestig dat het schavot niet is gevouwen of gerimpeld.Wanneer de steigers aan de randen zijn gedroogd, plaats dan langzaam een enkele cel suspensie van de cellen van belang op de bovenkant van elk schavot. Embryonale dag 18 gedecellulariseerde weefsels worden gekenmerkt door een zeer doorschijnende structuur, terwijl volwassen explants vertonen een doorschijnend tot wit uiterlijk. Hematoxylin en eosine en Masson's trichome vlekken bevestigen een efficiënte celverwijdering door de aanwezigheid poreuze mesh.Het kernmateriaal wordt verminderd met ongeveer 99,8%na decellularisatie, in vergelijking met niet-gemanipuleerde weefsels die essentieel zijn om te voorkomen dat een ongewenste ontstekingsreactie bij implantatie wordt geactiveerd. De levensvatbaarheid van de cel in de steigers kan tijdens de in-vitrocultuur worden gecontroleerd door calceine vlekken. Terminale analyse van de celherbevolking en -distributie over steigers, kan ook worden uitgevoerd na paraffineverwerking zoals waargenomen in deze representatieve beelden van een centrale bioscaffold sectie.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in de verkenning van de bioactieve eigenschappen van de extracellulaire matrix uit foetale en volwassen muizenharten, maar ook van andere weefsels.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatale Cardiac Steigers: Novel Matrices voor Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...