Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants à tous les membres du laboratoire de Pinto--Ó pour une discussion critique pertinente. Ce travail a été soutenu par MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) au titre du projet « CARDIOSTEM-ingénierie des tissus cardiaques et thérapies à base de cellules souches pour des applications cardiovasculaires » (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. est récipiendaire d’une bourse de la CFPI [SFRH/BD/88780/2012] et M.J.O. est un camarade de la CFPI (FCT-détective 2012).

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par l’i3S Animal Ethics Committee et Direção de Geral Veterinária (DGAV) et le sont conformément à la Directive 2010/63/UE de la Parlement européen.
1. préparation des solutions décellularisation
Remarque : Tous les décellularisation solutions devraient être filtrées à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et conservées pendant un maximum de 3 mois, sauf indication contraire.
<ol><li>Pour PBS...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau très dynamique et complex de glycoprotéines fibreuses et adhésifs, composé d’un réservoir de nombreux peptides bioactifs et emprisonné des facteurs de croissance. Comme le modulateur majeur de l’adhésion cellulaire, la dynamique du cytosquelette, motilité/migration, prolifération, différenciation et l’apoptose, ECM régule activement comportement et la fonction cellulaire. Sachant que le comportement cellulaire diffère dans les cultures 2D et 3D, y ont ét?...

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau dynamique de molécules qui régulent les processus cellulaires importants, à savoir sort-décision, prolifération et la différenciation de1,2. L’enquête des interactions cellule-ECM a été effectuée principalement dans deux dimensions (2D) dans les cultures in vitro recouvert de composantes d’ECM, qui constituent une simplification des propriétés natives de ECM dans vivo. Décellularisation génère acellulaire bioscaffolds ECM de style 3D qui conservent en grande partie l’architecture extracellulaire et la composition des tissus natifs et organes3,4. En plus de servir d’échafaudages bioactifs pour l’ingénierie tissulaire, decellularise biomatériaux 3D de ECM se présentent comme nouvelles plates-formes pour évaluer la biologie cellulaire-ECM qui répliquent l’environnement in vivo.
Évaluation du rôle différentiel des composants ECM de différents tissus, organes et l’âge profiteront avec l’utilisation de protocoles similaires de générer bioscaffolds native. Dans le coeur, nous avons développé un protocole polyvalent pour décellularisation des échantillons foetales et dérivés adulte, comme approche alternative pour effectuer des études comparatives du microenvironnement de l’orgue. En utilisant cette méthode, nous avons capturé le microenvironnement cardiaque natif et a montré que ECM foetale favorise des rendements plus élevés de repeuplement des cellules cardiaques5. Décellularisation fournie également une identification des résidents différences structurelles entre ECM foetale et adulte au niveau du sous-sol lamina et péricellulaire arrangement de maille de matrice et fibre composition5. Avant ce travail, une comparaison entre des tissus à différents stades ontogéniques utilisant la même approche de décellularisation signale seulement pour les reins de singe rhésus et coeurs rongeurs. En outre, un nombre limité d’études rapport de tissus ou d’organes foetaux décellularisation soi5,6,7. Ceci a été réalisé à l’aide de SDS comme un agent unique décellularisation ; Cependant, les concentrations distinctes de SDS étaient utilisées pour la décellularisation du tissu cardiaque foetale et adultes7,8. SDS est l’un des plus efficaces détergents ioniques pour le dédouanement du matériel cytoplasmique et nucléaire et largement utilisé dans la décellularisation de différents tissus et spécimens9,10. Des solutions contenant des concentrations élevées de SDS et longues périodes d’exposition ont été corrélées avec la dénaturation des protéines, la perte de glycosaminoglycanes (gag) et perturbation des fibrilles de collagène10,11et donc une équilibre entre la suppression de préservation et de la cellule ECM est nécessaire. Pour appliquer la même procédure au tissu cardiaque foetale et adulte, le protocole décrit ci-après est divisé en trois étapes successives : la lyse de la cellule par choc osmotique (tampon hypotonique) ; solubilisation des interactions lipides-protéines, ADN-protéine et protéine-protéine (0,2 % SDS) ; et enlèvement de matière nucléaire (traitement de DNase).
Notre protocole présente plusieurs avantages : J’ai) la possibilité de décellularisation équivalente de l’âge des tissus cardiaques par l’application de la stratégie de décellularisation même ; II) pas d’exigences pour les méthodes spécialisées ou de l’équipement ; III) adaptation prête à d’autres tissus et les espèces qu’elle a été appliquée avec succès avec des modifications mineures dans la biopsie intestinale humaine12 et souris poumon13; et, surtout, iv) peut adresser des propriétés biomécaniques ECM tout en permettant à l’Assemblée des cultures de style 3D organotypique qu’imite mieux les caractéristiques moléculaires du microenvironnement tissus natifs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Les connaissances actuelles de la matrice extracellulaire (ECM)-communication cellulaire se traduit par études grand bidimensionnel (2D) in vitro culture où les composantes d’ECM sont présentés comme un revêtement de surface. Ces systèmes de culture constituent une simplification de la complexité du tissu ECM qui englobe la composition biochimique, structure et propriétés mécaniques. Pour mieux imiter la communication ECM-cellule mise en forme du microenvironnement cardiaque, nous avons développé un protocole qui permet la décellularisation du coeur entier foetale et tissu adulte ventricule gauche des explants simultanément pour des études comparatives. Le protocole combine l’utilisation d’un tampon hypotonique, un détergent de propriétés tensioactif anionique et le traitement de la DNase sans aucune exigence de compétences spécialisées ou de l’équipement. L’application de la stratégie de décellularisation même dans des échantillons de tissus provenant de sujets d’âge différents est une autre approche pour effectuer des études comparatives. Le présent protocole permet l’identification des différences structurelles uniques entre foetales et adultes ECM maille et biologique cellulaires réponses cardiaques. En outre, la présente méthodologie illustre une application plus large étant appliquée avec succès dans d’autres tissus et les espèces avec des ajustements mineurs, comme dans les biopsies intestins humains et les poumons de souris.

L’efficacité de décellularisation devrait être évaluée par le biais de trois techniques principales : observation macroscopique, histologie et quantification de l’ADN. L’aspect macroscopique du traitement post-SDS échantillons agit indirectement sur l’efficacité de l’enlèvement de la cellule. Après incubation de SDS, échantillons doivent apparaître comme translucides à blanchâtre (Figure 1). Foetal (E18) decellularise tissus sont carac...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

La cardiaque matrice extracellulaire (ECM) est un réseau complexe de molécules qui orchestrent des processus clés dans les tissus et organes tout en supportant un remodelage physiologique tout au long de la vie. Décellularisation normalisée de coeur foetal et adultes permet des études expérimentales comparatives des deux tissus dans un contexte 3D en capturant l’architecture native et propriétés biomécaniques.

Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions importantes dans le domaine cardiovasculaire sur l’impact de la matrice extracellulaire a au cours des différentes étapes physiologiques et développementales du cœur. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse comparative entre les matrices extracellulaires fœtales et adultes en appliquant une méthode de décellularisation similaire aux deux types de tissus. Ainsi, cette méthode ont été appliquées avec succès à d’autres organes tels que les résections chirurgicales des patients atteints de cancer facilitant l’étude de la matrice extracellulaire dans différents contextes.Commencez par rincer brièvement les cœurs de souris fœtales et adultes avec du PBS glacé. Ensuite, placez les tissus sous un microscope disséquant et utilisez de petits ciseaux droits pour enlever les oreillettes, le ventricule droit et la septa des cœurs adultes de la souris. Transférer le ventricule gauche dans une nouvelle boîte de Petri et diviser le mur libre du ventricule gauche en deux bandes longitudinales d’épaisseur millimétrique.L’utilisation des explantations gauches adultes de ventricule de souris d’une taille homogène est essentielle pour une efficacité cohérente de décellularisation. Utilisez le scalpel et les pinces dentelées avec pointe incurvée pour enlever le muscle papillaire avant d’utiliser une grille de deux par deux millimètres pour hacher davantage les bandes en petits fragments de tissu. Lorsque tout le tissu a été haché, rincer brièvement les morceaux avec suffisamment de PBS pour couvrir les explants.Et transférer les cœurs fœtaux et les morceaux de tissu cardiaque adulte dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de température de coupe optimale ou composé OCT par tube. Ensuite, congelez les échantillons de tissus cardiaques dans de l’isopentane refroidi par la glace sèche pour le stockage à 80 degrés Celsius négatifs. Pour décellulariser les tissus cryo-conservés placer les échantillons congelés dans une boîte de Pétri contenant suffisamment de PBS pour couvrir complètement les explants.Après la fonte de l’OCT, submerger les échantillons dans une nouvelle boîte de Pétri de PBS et laver les échantillons trois fois sur un shaker pendant 10 à 15 minutes à 60 RPM par lavage. Après le dernier lavage, ajouter un millilitre de tampon hypotonique de travail à chaque puits d’une plaque stérile de culture tissulaire de 24 puits et utiliser des forceps fins pour transférer un fragment à chaque puits. Incuber la plaque à 25 degrés Celsius pendant 18 heures, à 165 rPM suivie de trois lavages d’une heure dans un millilitre de PBS par puits, par lavage.Après le dernier lavage, ajouter un millilitre de sulfate de dodecyl de sodium fraîchement préparé ou une solution SDS à chaque puits pour une incubation de 24 heures à 25 degrés Celsius. Le lendemain, rincez les échantillons avec trois lavages de 20 minutes dans un millilitre de tampon de lavage hypotonique par lavage suivi de l’ajout d’un millilitre de solution de traitement DNase à chaque puits pour une incubation de trois heures, à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, les échantillons décellulaires devraient perdre leur consistance gélatineuse.Lavez ensuite les fragments de tissu trois fois avec un millilitre de PBS pendant 20 minutes par lavage suivi d’un lavage de nuit dans un millilitre de PBS frais par puits à température ambiante et de 60 RPM. Pour évaluer l’enlèvement des restes cellulaires du tissu décellulaire, le lendemain matin fixer les échantillons en un millilitre de tampon neutre fraîchement préparé de formule 10%complété par 0,03% d’éosine aqueuse par puits pendant 2,5 à trois heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les échantillons en un millilitre de PBS par puits.Et utilisez un moule de spécimen de vinyle jetable pour encapsuler les fragments décellularisés dans le gel de traitement d’histologie selon les spécifications du fabricant. Ensuite, transférez les fragments encapsulés dans une cassette d’intégration de traitement de biopsie. Et traiter les échantillons de paraffine intégrant à travers des incubations successives de 30 minutes dans des concentrations ascendantes d’éthanol, isoparaffinique solution d’hydrocarbures aliphatiques et deux 56 degrés Celsius paraffine émerge.Après la deuxième paraffine émergente, monter des échantillons dans un bloc de paraffine et utiliser un microtome pour obtenir trois micromètres d’épaisseur sections. Vérifiez ensuite l’efficacité de la décellularisation en souinant les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine et les taches trichromes de Masson selon les protocoles standard. Après le lavage de PBS de nuit avec la secousse, ajoutez 500 microlitres de DPBS fraîchement préparé, complété avec 2.5 microgrammes par millilitre de solution antibiotique d’amphotericine B 1% à chaque échafaudage.Et stockez les échantillons pendant un à sept jours à quatre degrés Celsius. Avant d’asseoir les cellules, remplacer la solution DPBS par 500 microlitres de milieu basal cellulaire complétés par des antibiotiques. Et incuber les échafaudages pendant une heure à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, utiliser un microscope pour ajouter une goutte de quatre microlitres de DPBS au centre d’un puits d’une plaque de 96 puits par échafaudage. Et utilisez de fines pinces droites pour transférer un échafaudage décellulaire vers le haut de chaque goutte. Retirez tout DPBS supplémentaire par aspiration et confirmez que l’échafaud n’est pas plié ou froissé.Lorsque les échafaudages ont séché sur les bords, placez lentement une seule suspension cellulaire des cellules d’intérêt sur le dessus de chaque échafaudage. Le jour embryonnaire 18 tissus décellulaires sont caractérisés par une structure fortement translucide tandis que les explants adultes présentent un aspect translucide à blanc. L’hématoxyline et l’éosine et les taches de trichome de Masson confirment une élimination efficace de cellules par le maillage poreux de présence.La matière nucléaire est réduite d’environ 99,8% après la décellularisation, par rapport aux tissus non manipulés qui est essentiel pour éviter de déclencher une réponse inflammatoire non désirée lors de l’implantation. La viabilité cellulaire dans les échafaudages assis peut être surveillée pendant la culture in vitro par coloration de calcéine. L’analyse terminale du repeuplement et de la distribution cellulaires entre les échafaudages peut également être effectuée après le traitement de la paraffine, comme l’observent ces images représentatives d’une section centrale de biocaffold.Cette technique a donc ouvert la voie aux chercheurs dans l’exploration des propriétés bioactives de la matrice extracellulaire à partir de cœurs de souris fœtales et adultes, mais aussi d’autres tissus.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Décellularisation et Recellularization des foies entiers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

L&#39;encapsulation des cardiomyocytes dans un hydrogel de fibrine pour l&#39;ingénierie du tissu cardiaque

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrication de Mousses et microsupports dérivés Matrice extracellulaires culture cellulaire spécifique de tissu et plates-formes de livraison

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Deux méthodes de DÉCELLULARISATION de tissus végétaux pour utilisations en génie tissulaire

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...