Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
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Die Autoren sind verpflichtet, alle Mitglieder der Pinto Ó Labor für relevante kritische Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt von Programa MIT-Fundação Para Ciência e Tecnologia (FCT) im Rahmen des Projekts "CARDIOSTEM-Engineered kardialen Gewebe und stammzellbasierte Therapien für Herz-Kreislauf-Anwendungen" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S ist ein FCT Fellow [SFRH/BD/88780/2012] und M.J.O. ist FCT Fellow (FCT-Investigator 2012).

Alle beschriebenen Methoden wurden genehmigt durch die i3S Tier-Ethik-Kommission und Direção-Geral de Veterinária (DGAV) und sind im Einklang mit dem Europäischen Parlament Richtlinie 2010/63/EU.
1. Vorbereitung der Decellularization Lösungen
Hinweis: Alle Decellularization Lösungen sollten durch einen 0,22-μm-Membranfilter gefiltert und gespeichert für maximal 3 Monate, außer anders angegeben.
<ol><li>Für 1 X PBS: Mix 8 g NaCl, 1,01 g Na2HPO<...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein äußerst dynamischen und komplexen Geflecht von faserigen und Klebstoff Glykoproteinen, bestehend aus einem Reservoir von zahlreichen bioaktiven Peptiden und eingeschlossene Wachstumsfaktoren. Als die wichtigsten Modulator der Zelladhäsion, Zytoskelett Dynamik, Motilität/Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose regelt ECM aktiv Zellfunktion und Verhalten. Zu wissen, dass zelluläre Verhalten in 2D und 3D Kulturen unterscheidet, wurden Anstrengungen unternommen, ne...

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dynamisches Netzwerk von Molekülen, die wichtige zelluläre Prozesse, nämlich Schicksal-Entscheidung, Proliferation und Differenzierung1,2zu regulieren. Die Untersuchung der Zelle-ECM Interaktionen trat hauptsächlich in zweidimensionale (2D) in-vitro-Kulturen beschichtet mit ECM-Komponenten, die darstellen, einer Vereinfachung der native ECM Unterkünfte gefunden in Vivo. Decellularization erzeugt azellulärer 3D-wie ECM-Bioscaffolds, die die extrazelluläre Architektur und Zusammensetzung des nativen Gewebe und Organe3,4weitgehend zu bewahren. Neben seiner Tätigkeit als bioaktive Scaffolds für das Tissue Engineering, entstehen decellularized 3D ECM Biomaterialien als neuartige Plattformen Zelle-ECM Biologie zu bewerten, dass Parallel der in-vivo-Umgebung.
Bewertung der differenziellen Rolle der ECM-Komponenten unterschiedliche Gewebe, Organe und Alter profitieren mit dem Einsatz von ähnliche Protokolle native Bioscaffolds zu erzeugen. Im Herzen entwickelten wir ein vielseitiges Protokoll für Decellularization der fetalen und Erwachsenen stammenden Proben als ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien über die Orgel Mikroumgebung durchführen. Mit dieser Methodik, wir erfasst die native kardiale Mikroumgebung und zeigte, dass fetale ECM Wiederbesiedlung Mehrertrag von Herzzellen5fördert. Decellularization legte weitere Identifizierung ansässigen struktureller Unterschiede zwischen embryonalen und adulten ECM auf der Ebene der Keller Lamina und Pericellular Matrix-Netz-Anordnung und Faser Zusammensetzung5. Vor dieser Arbeit wurde Direktvergleich der Gewebe in den verschiedenen ontogenic Phasen mit dem gleichen Decellularization Ansatz nur für Rhesus-Affen Nieren und Nagetier Herzen berichtet. Eine begrenzte Anzahl von Studien berichten darüber hinaus fetalen Gewebe/Organ Decellularization per se5,6,7. Dies wurde erreicht mit SDS als einen einzigartigen Decellularization-Agent; Allerdings dienten verschiedene SDS-Konzentrationen für die Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe7,8. SDS ist eines der effektivsten Ionischen Reinigungsmittel für die Abfertigung der zytoplasmatischen und nuklearem Material, und am meisten benutzt in den Decellularization der verschiedenen Gewebe und Proben9,10. Lösungen mit hohen Konzentrationen von SDS und längere Exposition wurde mit Protein-Denaturierung, Glykosaminoglykan (GAGs) Verlust und Störung der Kollagen Fibrillen10,11, korreliert und somit eine Gleichgewicht zwischen Erhaltung und Zelle entfernen ECM ist notwendig. Um das gleiche Verfahren auf fetalen und adulten Herzgewebe anzuwenden, das Protokoll beschriebenen gliedert sich in drei aufeinander folgenden Schritten: Zell-Lyse durch osmotischen Schock (hypotone Puffer); Solubilisierung von Lipid-Protein und DNA-Protein-Protein-Protein Interaktionen (0,2 % SDS); und nuklearen Materialabtrag (DNase-Behandlung).
Unser Protokoll zeigt mehrere Vorteile: ich) die Möglichkeit, gleichwertige Decellularization der altersspezifischen kardialen Gewebe durch die Anwendung der gleichen Decellularization-Strategie; (II) keine Anforderungen für spezielle Methoden oder Geräte; (III) Anpassung an andere Gewebe und Arten bereit, wie sie erfolgreich mit geringfügigen Änderungen im menschlichen Darm Biopsien12 und Maus Lunge13angewendet wurde; und vor allem iv) ECM biomechanische Eigenschaften und ermöglicht die Montage von 3D-ähnliche organotypischen Kulturen, dass mehr genau die molekularen Eigenschaften der nativen Gewebe Mikroumgebung imitieren ansprechen können.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Aktuelle Kenntnisse der extrazellulären Matrix (ECM)-Zell-Kommunikation führt zu großen zweidimensionalen (2D) in-vitro-Kultur Studien wo ECM-Komponenten als eine Oberflächenbeschichtung präsentiert werden. Diese Kultur-Systeme bilden eine Vereinfachung der komplexen Natur des Gewebes ECM, die biochemische Zusammensetzung, Struktur und mechanischen Eigenschaften umfasst. Um die Gestaltung der kardialen Mikroumgebung ECM-Zell-Kommunikation besser zu emulieren, entwickelten wir ein Protokoll, das für die Decellularization des gesamten fetalen Herzens ermöglicht und Erwachsenen linke Herzkammer Gewebe explants gleichzeitig für vergleichende Studien. Das Protokoll kombiniert die Verwendung von hypotone Puffer, ein Waschmittel von anionischen Tensiden Eigenschaften und DNase-Behandlung, ohne spezielle Fähigkeiten oder Ausrüstung. Die Anwendung der gleichen Decellularization Strategie in Gewebeproben von Themen der unterschiedlichen Alters ist ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifikation von einzigartigen strukturelle Unterschiede in fetalen und adulten kardiale ECM Mesh und biologische zelluläre Reaktionen. Darüber hinaus die hierin Methodik zeigt eine breitere Anwendung erfolgreich in anderen Geweben und Arten mit kleineren Anpassungen, wie z. B. im menschlichen Darm Biopsien und Maus Lungenkrebs angewendet.

Die Decellularization Effizienz bewertet werden sollen, durch drei Haupttechniken: makroskopische Beobachtung, Histologie und DNA-Quantifizierung. Das makroskopische Erscheinungsbild der Proben Post-SDS-Behandlung wirkt sich indirekt die Wirksamkeit der Zelle entfernen. Nach der SDS Inkubation sollte Proben so durchscheinend bis weißlich (Abbildung 1) angezeigt werden. Fetal (E18) decellularized Gewebe durch eine stark durchscheinende Struktur auszeichnen, w...

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Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Die kardiale extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von Molekülen, die Schlüsselprozesse in Geweben und Organen zu orchestrieren, während dauerhafte physiologische Umbau lebenslang. Standardisierte Decellularization der fetalen und adulten Herzen ermöglicht vergleichende experimentelle Studien der beiden Gewebe in einem 3D Kontext durch die Erfassung von native Architektur und biomechanischen Eigenschaften.

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im kardiovaskulären Bereich über die Auswirkungen der extrazellulären Matrix während verschiedener physiologischer und Entwicklungsstadien des Herzens zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine vergleichende Analyse zwischen fetalen und erwachsenen extrazellulären Matrizen ermöglicht, indem eine ähnliche Dezellularisierungsmethode auf beide Arten von Gewebe angewendet wird. So wurde diese Methode erfolgreich auf andere Organe angewendet, wie chirurgische Resektionen von Krebspatienten, die die Untersuchung der extrazellulären Matrix in verschiedenen Kontexten erleichterten.Beginnen Sie damit, die fetalen und erwachsenen Mausherzen kurz mit eiskaltem PBS zu spülen. Dann legen Sie das Gewebe unter ein Sezieren Mikroskop und verwenden gerade kleine Schere, um die Vorhöfe, rechten Ventrikel, und die Septa aus den erwachsenen Mausherzen zu entfernen. Den linken Ventrikel in eine neue Petrischale geben und die linke ventrikelfreie Wand in zwei Millimeter dicke Längsstreifen teilen.Die Verwendung von erwachsenen Maus linken Ventrikel Explants von einer homogenen Größe ist entscheidend für eine konsistente Dezellularisierung Effizienz. Verwenden Sie das Skalpell und die gezackte Pinzette mit gekrümmter Spitze, um den Papillenmuskel zu entfernen, bevor Sie ein zwei mal zwei Millimeter großes Raster verwenden, um die Streifen weiter in kleinere Gewebefragmente zu zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, spülen Sie die Stücke kurz mit genügend PBS ab, um die Expflanzen zu bedecken.Und übertragen Sie die fetalen Herzen und Stücke des erwachsenen Herzgewebes in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren, die 250 Mikroliter optimale Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung pro Tube enthalten. Dann frieren Sie die Herzgewebeproben in Trockeneis gekühlt isopentane für die Lagerung bei negativen 80 Grad Celsius. Um die kryokonservierten Gewebe zu dezellularisieren, legen Sie die gefrorenen Proben in eine Petrischale, die genügend PBS enthält, um die Expflanzen vollständig zu bedecken.Nachdem das OCT geschmolzen ist, tauchen Sie die Proben in eine neue Petrischale von PBS und waschen Sie die Proben dreimal auf einem Shaker für 10 bis 15 Minuten bei 60 U/min pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche, fügen Sie einen Milliliter arbeitenden hypotonischen Puffer zu jedem Brunnen einer sterilen 24-Well-Gewebekulturplatte und verwenden Sie feine Zange, um ein Fragment auf jeden Brunnen zu übertragen. Inkubieren Sie die Platte bei 25 Grad Celsius für 18 Stunden, bei 165 Umdrehungen pro Minute, gefolgt von drei einstündigen Wäschen in einem Milliliter PBS pro Brunnen und Waschen.Nach der letzten Wäsche einen Milliliter frisch zubereitetes Natriumdodecylsulfat oder Eine SDS-Lösung für eine 24-Stunden-Inkubation bei 25 Grad Celsius zu jedem Brunnen geben. Spülen Sie die Proben am nächsten Tag mit drei 20-minütigen Waschungen in einem Milliliter hypotonischen Waschpuffer pro Wäsche, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter DNase-Behandlungslösung zu jedem Brunnen für eine dreistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation sollten die dezellularisierten Proben ihre gelatineartige Konsistenz verlieren.Dann waschen Sie die Gewebefragmente dreimal mit einem Milliliter PBS für 20 Minuten pro Wäsche, gefolgt von einer Nachtwäsche in einem Milliliter frischer PBS pro Brunnen bei Raumtemperatur und 60 Umdrehungen pro Minute. Um die Entfernung von zellulären Resten aus dem dezellularisierten Gewebe zu bewerten, fixieren Sie am nächsten Morgen die Proben in einem Milliliter frisch zubereiteten 10%formelneutralen Puffer, ergänzt mit 0,03% wässrigem Eosin pro Brunnen für 2,5 bis drei Stunden bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Proben in einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen.Und verwenden Sie eine Einweg-Vinyl-Probenform, um die dezellularisierten Fragmente in histologie-Verarbeitungsgel nach den Spezifikationen des Herstellers zu verkapseln. Übertragen Sie als Nächstes die gekapselten Fragmente auf eine Biopsieverarbeitungs-Einbettkassette. Und verarbeiten Sie die Proben für Paraffineinbettung durch aufeinander folgende 30-Minuten-Inkubationen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, isoparaffinische aliphatische Kohlenwasserstofflösung und zwei 56 Grad Celsius Paraffin entsteht.Nach dem zweiten Paraffin vorkommen, Proben in einem Paraffinblock montieren und mit einem Mikrotom drei Mikrometer dicke Abschnitte erhalten. Überprüfen Sie dann die Dezellularisierungseffizienz, indem Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin und Massons Trichromflecken nach Standardprotokollen färben. Nach der nächtlichen PBS-Wäsche mit Schütteln 500 Mikroliter frisch zubereitetes DPBS, ergänzt um 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Amphotericin B 1%Antibiotikumlösung, auf jedes Gerüst.Und die Proben ein bis sieben Tage bei vier Grad Celsius lagern. Ersetzen Sie vor dem Sitzen die DPBS-Lösung durch 500 Mikroliter Zellbasalmedium, ergänzt durch Antibiotika. Und die Gerüste eine Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten.Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein Mikroskop, um einen vier Mikroliter Tropfen DPBS in die Mitte eines Brunnens einer 96-Well-Platte pro Gerüst hinzuzufügen. Und verwenden Sie dünne gerade Pinzette, um ein dezellularisiertes Gerüst an die Spitze jedes Tropfens zu übertragen. Entfernen Sie zusätzliche DPBS durch Aspiration und bestätigen Sie, dass das Gerüst nicht gefaltet oder faltig ist.Wenn die Gerüste an den Rändern getrocknet sind, setzen Sie langsam eine einzelne Zellsuspension der Zellen von Interesse auf der Oberseite jedes Gerüstes. Embryonale Tag 18 dezellularisierte Gewebe sind durch eine hochtransluzente Struktur gekennzeichnet, während erwachsene Explanten ein transluzentes zu weißes Aussehen aufweisen. Hämatoxylin und Eosin und Massons Trichome-Färbungen bestätigen eine effiziente Zellentfernung durch das Vorhandensein poröser Netze.Das Kernmaterial wird nach der Dezellularisierung um ca. 99,8% reduziert, verglichen mit nicht manipulierten Geweben, was wesentlich ist, um zu vermeiden, dass eine unerwünschte Entzündungsreaktion bei der Implantation ausgelöst wird. Die Zelllebensfähigkeit in sitzenden Gerüsten kann während der In-vitro-Kultur durch Kalkfärbung überwacht werden. Die Terminalanalyse der Zellrepopulation und -verteilung über Gerüste kann auch nach paraffinverarbeitender Weise durchgeführt werden, wie in diesen repräsentativen Bildern eines zentralen Biogerüstabschnitts beobachtet.Diese Technik ebnete den Forschern den Weg bei der Erforschung der bioaktiven Eigenschaften der extrazellulären Matrix aus fetalen und erwachsenen Mausherzen, aber auch von anderen Geweben.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

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Forschung

Biotechnik

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

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