Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

המחברים אסירי תודה לכל חברי מעבדה פינטו-דו-Ó לדיון ביקורתי רלוונטית. עבודה זו נתמכה על ידי MIT פרוגרמה-Fundação פארא Ciência e Tecnologia (FCT) תחת הפרויקט "מהונדסים CARDIOSTEM רקמות הלב, טיפולים מבוססי תאי גזע עבור יישומים לב וכלי דם" (MITP-טרה-בתים/ECE/0013/2013). אגש ח הוא זוכת מלגת FCT [SFRH/BD 88780 2012] והוא M.J.O. בחור FCT (FCT-חוקר 2012).

כל למתודולוגיות תיאר אושרו על-ידי i3S ועדת האתיקה חיה ואני מחפשת Geral דה Veterinária (DGAV) והן על פי אירופה הפרלמנט דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי.
1. הכנת הפתרונות decellularization
הערה: כל decellularization פתרונות צריך להיות מסונן דרך פילטר ממברנה μm 0.22 ומאוחסנת לתקופה מקסימלית של 3 חוד?...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

מטריצות (ECM) הוא meshwork דינמיות ומורכבות מאוד של glycoproteins סיבי, דביק, המכיל מאגר של פפטידים ביו הרבות כלואה גורמי גדילה. כמו אפנן העיקריים של התא אדהזיה, שלד התא dynamics, תנועתיות/הגירה, התפשטות, התמיינות אפופטוזיס, ECM מסדיר באופן פעיל תפקוד התאים והתנהגות. בידיעה כי התנהגות הסלולר שונה בתרבויות מי?...

מטריצות (ECM) היא רשת דינמית של מולקולות המסדירים חשוב תהליכים תאיים, כלומר הגורל-החלטה, התפשטות ובידול1,2. החקירה של התא-ECM אינטראקציות בוצעו בעיקר דו מימדי (2D) בתרבויות חוץ גופית מצופה עם רכיבים ECM, אשר מהווים של פישוט של מאפייני ECM יליד נמצאו vivo. Decellularization יוצר acellular bioscaffolds ECM תלת ממד זה בעיקר לשמר את אדריכלות חוץ-תאית קומפוזיציה של יליד רקמות, איברים3,4. בנוסף להיותם פיגומים ביואקטיביות עבור הנדסת רקמות, decellularized 3D ECM biomaterials מתגלים כמו פלטפורמות הרומן להעריך ביולוגיה של התא-ECM העוברים במקביל הסביבה ויוו.
הערכה של תפקיד דיפרנציאלית של רכיבי ה-ECM של רקמות שונות, איברים, גיל ייהנו עם השימוש של פרוטוקולים דומה של יצירת bioscaffolds מקורי. בלב, פיתחנו פרוטוקול רב-תכליתי עבור decellularization של העובר, מבוגר-derived דגימות, כגישה חלופית לביצוע מחקרים השוואתיים של microenvironment איברים. באמצעות מתודולוגיה זו, אנו כבשו את microenvironment לב מקורית, הראה כי העובר ECM מקדמת את תשואות גבוהות איכלוס של תאי לב5. Decellularization הוסיפה זיהוי של תושב מבניים ההבדלים בין ECM עוברית ומבוגרים ברמה של סידור רשת מטריקס פרופריה המרתף, pericellular סיבים הרכב5. לפני שזה יעבוד, עפות. השוואה של רקמות בשלבים אונטוגנית שונים, באמצעות גישה decellularization אותו רק דווח על הכליות קוף רזוס ולבבות מכרסמים. בנוסף, מספר מצומצם של מחקרים מדווחים רקמות/איבר בעובר decellularization כשלעצמה5,6,7. זו הושגה באמצעות מרחביות כסוכן decellularization ייחודי; עם זאת, ריכוז מרחביות שונות שימשו את decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים7,8. למען חברה דמוקרטית היא לאחד חומרי ניקוי יוניים היעיל ביותר לאישור של חומר cytoplasmic וגרעיני, בשימוש נרחב decellularization שונים רקמות, דגימות9,10. פתרונות המכילה ריכוז גבוה מרחביות, ממושכות של חשיפה יש היה בקורלציה עם דנטורציה של חלבונים, ואובדן גליקוזאמינוגליקן (GAGs) שיבוש קולגן הסיבים10,11, ולכן האיזון בין שימור ECM והסרת תאים הכרחי. כדי להחיל את ההליך על רקמת הלב העוברי, למבוגרים, פרוטוקול המתוארים בזאת מחולקת לשלושה שלבים רציפים: תא פירוק על ידי שוק אוסמוטי (מאגר היפוטוניק); solubilization של אינטראקציות חלבון השומנים, חלבון-דנ א, חלבון (0.2% מרחביות); הסרת חומרים גרעיניים (טיפול DNase).
פרוטוקול שלנו מראה מספר יתרונות: אני) האפשרות של decellularization המקביל של רקמות הלב גיל ספציפי על-ידי היישום של האסטרטגיה decellularization אותו; ii) שאין דרישות שיטות מיוחדות או ציוד; iii) שמוכן ההסתגלות רקמות ו מינים אחרים כמו זה יושם בהצלחה עם שינוי קטן ביופסיות במעי האדם12 ו העכבר ריאות13; ו, וחשוב, הרביעי) יכול לפנות מאפיינים biomechanical ECM תוך מתן אפשרות ההרכבה של תרבויות דמויי תלת-ממד organotypic יותר מקרוב לחקות התכונות מולקולרית של microenvironment הרקמה הטבעית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

הידע הנוכחי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-תקשורת התא מתרגמת ללימודים רב מימדי תרבות במבחנה (2D) שבו רכיבי ה-ECM מוצגות כחלק משטח ציפוי. מערכות התרבות אלו מהווים של פישוט של האופי המורכב של הרקמה ECM שמקיף את ההרכב הביוכימי, מבנה, תכונות מכניות. לחקות טוב יותר של תקשורת ECM בעיצוב של microenvironment לב, פיתחנו פרוטוקול המאפשר decellularization של הלב העוברי לגמרי, החדר השמאלי למבוגרים רקמת explants במקביל ללימודי השוואתי. הפרוטוקול משלב את השימוש מאגר היפוטוניק, חומר ניקוי של מאפיינים anionic חומרים פעילי שטח, וטיפול DNase ללא כל דרישת כישורים מיוחדים או ציוד. היישום של האסטרטגיה decellularization אותו על פני דגימות רקמה מן הנבדקים של גיל שונות היא גישה אלטרנטיבית לביצוע מחקרים השוואתיים. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי הבדלים מבניים ייחודי על פני העובר למבוגרים לב ECM עם רשת שינוי, ביולוגיים הסלולר תגובות ו. יתר על כן, בזאת מתודולוגיה מדגים יישום רחבה יותר בהצלחה ליישם רקמות ומינים אחרים עם התאמות קלות, כגון ביופסיות במעי האדם, הריאות העכבר.

וצריך להעריך את יעילות decellularization דרך שלוש טכניקות הראשי: תצפית מאקרוסקופית, היסטולוגיה, כימות הדנ א. המראה מאקרוסקופית של דגימות פוסט-מרחביות הטיפול משפיע בעקיפין את היעילות של הסרת תאים. לאחר דגירה מרחביות, דגימות אמור להופיע גם שקוף כדי לבנבן (איור 1C). עו...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

מטריצה חוץ-תאית הלב (ECM) היא רשת מורכבת של מולקולות שננהל את מפתח בתהליכי רקמות ואיברים שתישא את שיפוץ פיזיולוגיים לאורך החיים. Decellularization מתוקננת לב העובר, למבוגרים היתרי השוואתי ניסיוני של שתי רקמות בהקשר תלת-ממד על-ידי לכידתו ארכיטקטורה מקורית ומאפיינים ביו-מכני.

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חשובות בתחום הלב וכלי הדם על ההשפעה מטריצה חוץ תאית יש בשלבים פיזיולוגיים והתפתחותיים שונים של הלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח השוואתי בין מטריסות עובריות למבוגרים חוץ תאיים על ידי החלת שיטת דקלולריזציה דומה על שני סוגי הרקמה. אז שיטה זו הוחלה בהצלחה על איברים אחרים כגון כריתות כירורגיות של חולי סרטן להקל על המחקר של מטריצה חוץ תאית בהקשרים שונים.התחל על ידי שטיפה קצרה של לבבות העכבר העוברי והמבוגר עם PBS קר כקרח. לאחר מכן מניחים את הרקמות תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש מספריים קטנים ישר כדי להסיר את האטריה, החדר הימני, ואת septa מלבבות העכבר הבוגר. מעבירים את החדר השמאלי לצלחת פטרי חדשה ומחלקים את הקיר השמאלי ללא החדר לשתי רצועות אורך עבות מילימטר.השימוש בעכבר בוגר משמאל explants בגודל הומוגני הוא חיוני עבור יעילות דקלולריזציה עקבית. השתמש אזמל פינצטה משונן עם קצה מעוקל כדי להסיר את שריר papillary לפני השימוש ברשת שני על שני מילימטר כדי לטחון עוד יותר את הרצועות לתוך שברי רקמה קטנים יותר. כאשר כל הרקמה כבר טחון, בקצרה לשטוף את החלקים עם מספיק PBS כדי לכסות את explants.ולהעביר את הלבבות העובריים וחתיכות של רקמת לב בוגרת לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר המכיל 250 microliters של טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תרכובת OCT לכל צינור. לאחר מכן, להקפיא את דגימות רקמת הלב בקרח יבש מקורר isopentane לאחסון ב 80 מעלות צלזיוס שלילי. כדי לדקלולריזציה של הרקמות שהשתמרו בהקפאה מניחים את הדגימות הקפואות בצלחת פטרי המכילה מספיק PBS כדי לכסות לחלוטין את המתפוצצים.לאחר OCT נמס, להטביע את הדגימות בצלחת פטרי חדשה של PBS ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים על שייקר במשך 10 עד 15 דקות ב 60 סל"ד לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני עובד לכל באר של צלחת תרבות רקמות סטרילית 24 באר ולהשתמש מדפים עדין להעביר שבר אחד לכל באר. הדגירה את הצלחת ב 25 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות, ב 165 סל"ד ואחריו שלוש שטיפות של שעה אחת במיליליטר אחד של PBS לגם, לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של נתרן דודיסל סולפט או SDS טרי מוכן לכל באר עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 25 מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את הדגימות עם שלוש 20 דקות שוטף במיליליטר אחד של חיץ לשטוף היפוטוני לכל לשטוף ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של פתרון טיפול DNase לכל באר עבור דגירה של שלוש שעות, ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, הדגימות המפורקות צריכות לאבד את העקביות דמוית הג'לטין שלהן.לאחר מכן לשטוף את שברי הרקמה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS במשך 20 דקות לשטוף ואחריו לשטוף לילה במיליליטר אחד של PBS טרי לגם בטמפרטורת החדר ו 60 סל"ד. כדי להעריך את הסרת שרידים הסלולר מן הרקמה decellularized, למחרת בבוקר לתקן את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ טרי מוכן 10% נוסחה ניטרלי בתוספת 0.03% של אאוסין מים ל הבאר במשך 2.5 עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות במיליליטר אחד של PBS לגם.ולהשתמש בתבנית ויניל חד פעמית כדי encapsulate שברים decellularized בג'ל עיבוד היסטלולוגיה על פי מפרט היצרן. לאחר מכן, העבר את השברים המוקפצים לקלטת הטבעה לעיבוד ביופסיה. ולעבד את הדגימות עבור פרפין הטמעות דרך דגירה רצופה של 30 דקות בריכוזים עולים של אתנול, פתרון פחמימנים אליפטיים isoparaffinic ושני 56 מעלות צלזיוס פרפין עולה.לאחר פרפין השני מגיח, להרכיב דגימות בבלוק פרפין ולהשתמש microtome כדי להשיג קטעים בעובי שלושה מיקרומטר. לאחר מכן לאמת את יעילות decellularization על ידי הכתמת החלקים עם haematoxylin ו eosin וכתמי trichrome של מאסון על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר לשטוף את ה-PBS בן הלילה ברעידות, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של DPBS טרי, בתוספת 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיטריסין B 1% פתרון אנטיביוטי לכל פיגום.ולאחסן את הדגימות במשך יום עד שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לפני הישיבה את התאים, להחליף את פתרון DPBS עם 500 microliters של מדיום בסיס התא בתוספת אנטיביוטיקה. ולדגר את הפיגומים במשך שעה אחת ב37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, השתמש במיקרוסקופ כדי להוסיף טיפת ארבעה מיקרוליטר של DPBS למרכז באר אחת של צלחת 96 באר לכל פיגום. ולהשתמש פינצטה ישר דק להעביר פיגום אחד decellularized לראש כל טיפה. הסר כל DPBS נוסף על ידי שאיפה ולאשר כי הפיגום אינו מקופל או מקומט.כאשר הפיגומים התייבשו בקצוות, מושב לאט מתלה תא אחד של התאים של עניין בחלק העליון של כל פיגום. יום עוברי 18 רקמות decellularized מאופיינים על ידי מבנה שקוף מאוד בעוד explants מבוגרים להפגין מראה שקוף ללבן. המטוקסילין וכתמי טריכום של אאוסין ומאוסון מאשרים הסרת תא יעילה על ידי רשת נקבובי נוכחות.החומר הגרעיני מצטמצם בכ-99.8% לאחר ההפחתה, בהשוואה לרקמות שאינן מניפולציות החיוניות למניעת תגובה דלקתית לא רצויה בעת ההשתלה. הכדאיות התא בתוך פיגומים יושבים ניתן לפקח במהלך תרבות במבחנה על ידי כתמי קלסין. ניתוח מסוף של אכלס מחדש של התא והפצה על פני פיגומים, יכול להתבצע גם לאחר עיבוד פרפין כפי שנצפה בתמונות מייצגות אלה של סעיף bioscaffold מרכזי.אז טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בחקר המאפיינים הביו-אקטיביים של המטריצה החוץ-תאית מלבבות עכבר עובריים ומבוגרים אך גם מרקמות אחרות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...