Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
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Gli autori sono in debito con tutti i membri del laboratorio di Pinto--Ó per discussione critica pertinente. Questo lavoro è stato supportato da MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) nell'ambito del progetto "CARDIOSTEM-Engineered tessuti cardiaci e terapie basate sulle cellule staminali per applicazioni cardiovascolari" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.c.s. è un destinatario di una borsa di studio FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. è un collega di FCT (FCT-investigatore 2012).

Tutte le metodologie descritte sono state approvate dalla i3S Comitato di etica animale e Direção Geral de Veterinária (DGAV) e sono in conformità con il Parlamento europeo direttiva 2010/63/UE.
1. preparazione delle soluzioni di decellularizzazione
Nota: Decellularizzazione tutte le soluzioni dovrebbero essere filtrate attraverso un filtro a membrana 0.22 μm e conservati per un massimo di 3 mesi, salvo specificato diversamente.
<ol><li>Per 1x PBS: Mix 8 g di...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

La matrice extracellulare (ECM) è un reticolo altamente dinamico e complesso delle glicoproteine fibrose e adesivi, costituito da un serbatoio di numerosi peptidi bioattivi e fattori di crescita intrappolati. Come il modulatore principale di adesione delle cellule, dinamica del citoscheletro, motilità/migrazione, proliferazione, differenziazione e apoptosi, ECM regola attivamente comportamento e funzione cellulare. Sapendo che il comportamento cellulare è diverso nelle culture 2D e 3D, ci sono stati gli sforzi per svi...

La matrice extracellulare (ECM) è una rete dinamica di molecole che regolano importanti processi cellulari, vale a dire destino-decisione, proliferazione e differenziazione di1,2. L'indagine sulle interazioni cellula-ECM è stata eseguita principalmente in bidimensionale (2D) in vitro culture rivestito con componenti della MEC, che costituiscono una semplificazione di nativo ECM oggetti trovati in vivo. Decellularizzazione genera acellulare 3D-come ECM bioscaffolds che conservano in gran parte l'architettura extracellulare e la composizione dei tessuti e organi3,4. Oltre a servire come scaffold bioattivi per ingegneria tissutale, decellularizzati biomateriali di ECM 3D stanno emergendo come romanzo piattaforme per valutare la biologia delle cellule-ECM quello parallelo dell'ambiente in vivo.
Valutazione del ruolo del differenziale dei componenti ECM di diversi tessuti, organi ed età potranno beneficiare con l'uso di protocolli simili di generare bioscaffolds nativo. Nel cuore, abbiamo sviluppato un protocollo versatile per decellularizzazione di campioni fetali e adulto-derivati, come metodo alternativo per eseguire studi comparativi del microambiente dell'organo. Utilizzando questa metodologia, abbiamo catturato il microambiente cardiaco nativo e ha mostrato che l'ECM fetale promuove rendimenti più elevati di ripopolazione di cellule cardiache5. Decellularizzazione fornito ulteriormente l'identificazione delle differenze strutturali residente tra ECM fetali ed adulti al livello del seminterrato lamina e pericellulari arrangiamento di maglia matrice e fibra composizione5. Prima di iniziare questo lavoro, confronto testa a testa dei tessuti nelle diverse fasi ontogenic utilizzando lo stesso approccio di decellularizzazione è stata segnalata solo per roditori cuori e reni di scimmia rhesus. Inoltre, un numero limitato di studi segnala tessuto/organo fetale decellularizzazione per sé5,6,7. Questo è stato realizzato usando SDS come agente unico decellularizzati; Tuttavia, le concentrazioni di SDS distinte sono state utilizzate per decellularizzazione di tessuto cardiaco fetali ed adulti7,8. SDS è uno dei più efficaci detergenti ionici per lo sdoganamento di citoplasmatici e nucleari e ampiamente usato in decellularizzazione di diversi tessuti e campioni9,10. Soluzioni contenenti alte concentrazioni di SDS e lunghi periodi di esposizione sono stati correlati con denaturazione proteica, perdita di glicosaminoglicani (gag) e la rottura del collagene fibrille10,11e quindi un equilibrio tra rimozione di conservazione e delle cellule di ECM è necessario. Per applicare la stessa procedura al tessuto del cuore fetale e adulto, il protocollo descritto nel presente documento è diviso in tre fasi sequenziali: lisi della cellula da shock osmotico (tampone ipotonico); solubilizzazione delle interazioni lipido-proteina, DNA-proteina e proteina-proteina (0,2% SDS); e rimozione di materiale nucleare (trattamento della dnasi).
Nostro protocollo presenta diversi vantaggi: i) la possibilità di decellularizzazione equivalente di età-specifici tessuti cardiaci applicando la stessa strategia di decellularizzazione; II) nessun requisito per metodi specializzati o attrezzature; III) pronto adattamento ad altri tessuti e specie come è stato applicato con successo con alterazioni minori in biopsie dell'intestino umano12 e mouse polmone13; e, soprattutto, iv) può indirizzare le proprietà biomeccaniche ECM consentendo il montaggio di colture organotipiche di tipo 3D che più strettamente imitare le caratteristiche molecolari del microambiente tissutale nativa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Conoscenze attuali della matrice extracellulare (ECM)-comunicazione cellulare si traduce in studi di grande bidimensionale (2D) coltura in vitro dove componenti dell'ECM sono presentati come un rivestimento superficiale. Questi sistemi di cultura costituiscano una semplificazione della natura complessa del tessuto ECM che racchiude la composizione biochimica, struttura e proprietà meccaniche. Per meglio emulare la comunicazione ECM-cellula che modella il microambiente cardiaco, abbiamo sviluppato un protocollo che consente di decellularizzazione del cuore intero fetale e tessuto adulto ventricolo sinistro espianti simultaneamente per studi comparativi. Il protocollo combina l'uso di un buffer ipotonico, un detergente di proprietà di tensioattivo anionico e trattamento della dnasi senza alcun requisito per competenze specialistiche o attrezzature. L'applicazione della stessa strategia di decellularizzazione attraverso campioni di tessuto da soggetti di età diverse è un approccio alternativo per eseguire studi comparativi. Il presente protocollo permette l'identificazione delle differenze strutturali uniche attraverso fetali ed adulte cardiaco ECM mesh e biologico delle risposte cellulari. Inoltre, la presente metodologia viene illustrata un'applicazione più ampia essere applicata con successo in altri tessuti e specie con piccoli aggiustamenti, come ad esempio nelle biopsie dell'intestino umane e polmone del topo.

L'efficienza di decellularizzazione dovrebbe essere valutato attraverso tre principali tecniche: osservazione macroscopica, istologia e quantificazione del DNA. L'apparenza macroscopica del trattamento post-SDS campioni colpisce indirettamente l'efficacia di rimozione delle cellule. Dopo l'incubazione di SDS, campioni dovrebbero apparire come traslucidi al biancastro (Figura 1). Fetale (E18) decellularizzazione tessuti sono caratterizzati da una struttura alt...

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Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Cardiaca matrice extracellulare (ECM) è una complessa rete di molecole che orchestrano processi chiave in tessuti e organi pur sopportando fisiologico rimodellamento per tutta la vita. Decellularizzazione standardizzata dei cuori fetali ed adulti permette studi comparativi sperimentali di entrambi i tessuti in un contesto 3D mediante l'acquisizione di architettura nativa e proprietà biomeccaniche.

Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Questo metodo può aiutare ad affrontare importanti domande in campo cardiovascolare sull'impatto che la matrice extracellulare ha durante diverse fasi fisiologiche e di sviluppo del cuore. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi comparativa tra matrici extracellulari fetali e adulte applicando un metodo di decellularizzazione simile a entrambi i tipi di tessuto. Quindi questo metodo è stato applicato con successo ad altri organi come le resezioni chirurgiche dei pazienti oncologici che facilitano lo studio della matrice extracellulare in diversi contesti.Inizia risciacquando brevemente il cuore fetale e adulto del topo con PBS ghiacciato. Quindi posizionare i tessuti sotto un microscopio sezionante e utilizzare piccole forbici dritte per rimuovere gli atri, il ventricolo destro e il setto dai cuori adulti del topo. Trasferire il ventricolo sinistro in una nuova piastra di Petri e dividere la parete libera del ventricolo sinistro in strisce longitudinali spesse due millimetri.L'uso di espianto ventricolo sinistro del topo adulto di dimensioni omogenee è essenziale per una costante efficienza di decellularizzazione. Utilizzare il bisturi e le pinzette seghettate con punta curva per rimuovere il muscolo papillare prima di utilizzare una griglia di due per due millimetri per tritare ulteriormente le strisce in frammenti di tessuto più piccoli. Quando tutto il tessuto è stato tritato, sciacquare brevemente i pezzi con abbastanza PBS per coprire le espianto.E trasferire i cuori fetali e i pezzi di tessuto cardiaco adulto in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenenti 250 microlitri di temperatura di taglio ottimale o composto OCT per tubo. Quindi, congelare i campioni di tessuto cardiaco in isopentane raffreddato a ghiaccio secco per la conservazione a -80 gradi Celsius. Per decellularizzare i tessuti crio-conservati posizionare i campioni congelati in una piastra di Petri contenente abbastanza PBS da coprire completamente le espianto.Dopo che l'OCT si è sciolto, immergere i campioni in una nuova piastra di Petri di PBS e lavare i campioni tre volte su uno shaker per 10-15 minuti a 60 giri/min per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di tampone ipotonico funzionante a ciascun pozzo di una piastra sterile di coltura tissutale a 24 pozzetto e utilizzare forcelle fini per trasferire un frammento ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 18 ore, a 165 giri/min seguita da tre lavaggi di un'ora in un millilitro di PBS per pozzo, per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di solfato di dodecile di sodio appena preparato o soluzione di SDS ad ogni pozzo per un'incubazione 24 ore su 24 a 25 gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare i campioni con tre lavaggi di 20 minuti in un millilitro di tampone di lavaggio ipotonico per lavaggio seguito dall'aggiunta di un millilitro di soluzione di trattamento della DNasi a ciascun pozzo per un'incubazione di tre ore, a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, i campioni decellularizzati dovrebbero perdere la loro consistenza simile alla gelatina.Quindi lavare i frammenti di tessuto tre volte con un millilitro di PBS per 20 minuti per lavaggio seguito da un lavaggio notturno in un millilitro di PBS fresco per pozzo a temperatura ambiente e 60 giri/min. Per valutare la rimozione dei resti cellulari dal tessuto decellularizzato, la mattina successiva fissare i campioni in un millilitro di tampone neutro del 10% preparato al momento integrato con lo 0,03% di eosina acquosa per pozzo per 2,5-3 ore a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni in un millilitro di PBS per pozzo.E utilizzare uno stampo monouso in vinile per incapsulare i frammenti decellularizzati nel gel di lavorazione istologico secondo le specifiche del produttore. Successivamente, trasferire i frammenti incapsulati in una cassetta di incorporamento per l'elaborazione della biopsia. Ed elaborare i campioni per l'incorporamento di paraffina attraverso successive incubazioni di 30 minuti in concentrazioni ascendenti di etanolo, soluzione di idrocarburi alifatici isoparaffinici e due paraffina Celsius di 56 gradi.Dopo l'emergente della seconda paraffina, montare i campioni in un blocco di paraffina e utilizzare un microtomo per ottenere sezioni spesse tre micrometri. Quindi verificare l'efficienza di decellularizzazione macchiando le sezioni con ematossilina ed eosina e le macchie tricromache di Masson secondo protocolli standard. Dopo il lavaggio PBS durante la notte con scuotimento, aggiungere 500 microlitri di DPBS appena preparati, integratori con 2,5 microgrammi per millilitro di soluzione antibiotica ampotericina B 1% ad ogni impalcatura.E conservare i campioni da uno a sette giorni a quattro gradi Celsius. Prima di ospitare le cellule, sostituire la soluzione DPBS con 500 microlitri di mezzo basale cellulare integrati con antibiotici. E incubare le impalcature per un'ora a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, utilizzare un microscopio per aggiungere una goccia di quattro microliter di DPBS al centro di un pozzo di una piastra da 96 pozzetto per impalcatura. E usa una sottile pinzetta dritta per trasferire un'impalcatura decellularizzata nella parte superiore di ogni goccia. Rimuovere eventuali DPBS aggiuntivi per aspirazione e verificare che l'impalcatura non sia piegata o rugosa.Quando le impalcature si sono asciugate ai bordi, seduti lentamente una sospensione a cella singola delle celle di interesse sulla parte superiore di ogni impalcatura. I tessuti decellularizzati del giorno embrionale 18 sono caratterizzati da una struttura altamente traslucida mentre le espianto adulte mostrano un aspetto traslucido e bianco. Le macchie di ematossilina ed eosina e tricomio di Masson confermano un'efficiente rimozione cellulare dalla presenza di rete porosa.Il materiale nucleare viene ridotto di circa il 99,8% dopo la decellularizzazione, rispetto ai tessuti non manipolati, che è essenziale per evitare di innescare una risposta infiammatoria indesiderata al momento dell'impianto. La vitalità cellulare all'interno di ponteggi seduti può essere monitorata durante la coltura in vitro mediante colorazione calceina. L'analisi terminale del ripopolamento e della distribuzione cellulare tra le impalcature, può anche essere eseguita dopo l'elaborazione della paraffina come osservato in queste immagini rappresentative di una sezione centrale del bioscaffold.Quindi questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nell'esplorazione delle proprietà bioattive della matrice extracellulare dal cuore fetale e adulto del topo ma anche di altri tessuti.

Research

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