Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
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著者は、ピントは Ó 研究室関連の重要な議論のためのすべてのメンバーにお世話になった。この作業はプログラム MIT カルースト パラ Ciência 電子技術 (FCT) プロジェクト「CARDIOSTEM 設計された心臓ティッシュと心血管用幹細胞ベースの治療」の下で支えられた (MITP-TB/ECE/0013/2013)。A.C.S. FCT フェローシップ [SFRH/BD/88780/2012] の受信者であるし、M.J.O. は FCT 仲間 (FCT 捜査官 2012 年)。

記載されているすべての方法論は、i3 の s 動物倫理委員会および Direção ジェラール山脈 de によって承認された Veterinária (DGAV) とに従い、欧州議会指令 2010年/63/EU。
1 decellularization 溶液の調製
注: すべての decellularization ソリューションを 0.22 μ m のメンブラン フィルターで濾過し、を除く 3 ヶ月の最大値の格納する必要があります指定。
<ol><li>1 × P...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

細胞外マトリックス (ECM) は多数の生理活性ペプチドと成長因子の内包された貯留層から成る繊維と接着剤の糖蛋白質の非常に動的かつ複雑な網目です。細胞接着、細胞骨格のダイナミクス、運動/移行、増殖、分化、アポトーシスの重要な変調器として ECM は積極的に細胞機能および行動を調整します。2 D と 3 D の文化で細胞挙動が異なることを知ること、自然な組織環境を正確に複製するこ...

細胞外マトリックス (ECM) は、すなわち運命決定、増殖と分化の1,2の重要な細胞プロセスを調整する分子の動的ネットワークです。細胞外マトリクスの相互作用の調査を行った二次元 (2 D) ECM 成分でコーティングされた生体外の文化で、主に生体内で検出されたネイティブの ECM プロパティの単純化を構成します。Decellularization は、主細胞アーキテクチャとネイティブの組織と臓器3,4の構成を保持する無細胞の 3 D のような ECM bioscaffolds を生成します。組織工学用生理活性足場として機能に加えて、3 D ECM 生体材料の脱は並列体内環境セル ECM 生物学を評価する新しいプラットフォームとして新たな。
明確な組織・器官・年齢の ECM 成分の差分の役割の評価でお越しの際にもネイティブの bioscaffolds を生成するのと同様のプロトコルを用いる。中心部に臓器微小環境の比較研究を実行する別の方法として胎児と大人由来サンプルの decellularization のための汎用プロトコルを開発した我々。この方法論を使用して、我々 はネイティブ心臓微小環境をキャプチャし、胎児の ECM が歩留まり心筋細胞5の再作成を促進することを示した。Decellularization はさらに地下板と細胞性のマトリックス メッシュ配置のレベルで胎児と成人の ECM と繊維組成5居住構造差の識別を提供しました。この作品の前に同じ decellularization アプローチを使用してさまざまな個体発生段階での組織の頭に頭の比較は、アカゲザルの腎臓および齧歯動物の心の報告されています。また、研究の限られた数は、胎児の組織・臓器 decellularization自体5,6,7を報告します。これは、ユニークな decellularization エージェントとして SDS を使用して達成されています。ただし、個別の SDS の濃度は胎児と成人の心臓組織7,8decellularization の使用されました。SDS は細胞質と核物質のクリアランスのための最も効果的な界面活性剤の一つと広く異なる組織と標本9,10の decellularization で。タンパク質変性、グリコサミノグリカン (Gag) の損失とコラーゲン線維の10、11の中断に関連したソリューション高 SDS 濃度と曝露の長期間を含むため、ECM の保全と細胞の除去のバランスが必要です。胎児と成人の心臓組織に、同じ手順を適用する記載プロトコルは 3 つの連続したステップに分けられる: 高浸透圧刺激 (低張バッファー) を用いた細胞の換散脂質タンパク質、DNA 蛋白質および蛋白質蛋白質の相互作用 (0.2 %sds); の可溶化・原子力材料除去 (DNase 処理)。
我々 のプロトコルは、いくつかの利点を示しています: 私) 同じ decellularization 戦略のアプリケーションによる年齢固有心筋組織の等価 decellularization の可能性特殊な方法または装置; ii) の要件iii) 人間の腸生検12マウス肺13; のマイナーな変化と正常が適用されて、他の組織および種への適応を準備します。重要なは、iv) 3 D のような切片文化詳細は密接にネイティブの組織微小環境の分子の機能を模倣のアセンブリを可能にしながら ECM の力学的特性に対応できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

細胞外マトリックス (ECM) の現在のナレッジ-携帯通信は表面コーティングとして ECM コンポーネントを提示する、大規模な二次元 (2 D) 体外培養研究に変換します。これらの文化のシステムは、組織の生化学的組成、構造、および機械的性質を包含する ECM の複雑な性質の単純化を構成します。良い心臓の微小環境を形成 ECM 携帯通信をエミュレートする、我々 は全体胎児心臓の decellularization を可能にするプロトコルを開発した、大人の左心室の組織は同時に比較研究外植片します。プロトコルは、専門的なスキルや機器、洗剤は陰イオン界面活性剤と DNase 処理を必要とせず、低張バッファーの使用を組み合わせたものです。様々 な年齢の被験者から組織サンプルの間で同じ decellularization 戦略の応用は、比較研究を実行する別の方法です。この議定書は、胎児と成人心臓 ECM メッシュと生物細胞応答の間でユニークな構造的な違いの識別を許します。さらに、本方法論が人間の腸生検のマウス肺のなど他の組織のマイナーな調整と種正常に適用されて広範なアプリケーションを示します。

Decellularization の効率は 3 つの主要技術が評価されるべき: 肉眼、組織学、DNA の定量化。サンプル ポスト SDS の処置の肉眼は、細胞の除去の効果があることを直接に影響します。SDS インキュベーション後サンプルが白っぽい (図 1) に半透明で表示されます。胎児 (E18) 大人植を半透明白色の外観を持っている組織の脱は半透明度が高い構造によっ?...

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Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

心臓の細胞外マトリックス (ECM) は、人生を通して生理学的な改造に耐えながら組織や臓器における主要なプロセスを調整する分子の複雑なネットワークです。胎児と大人の心の標準化された decellularization 3 D コンテキスト ネイティブ アーキテクチャと力学的特性をキャプチャすることにより両方の組織の比較実験が可能です。

生体外研究における 3 D のようなプラットフォームとして胎児と成人の心筋組織を外植体の対等な Decellularization

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

この方法は、心臓の異なる生理学的および発達段階における細胞外マトリックスの影響に関する心血管分野の重要な質問に対処するのに役立つ。この技術の主な利点は、両方のタイプの組織に同様の脱細胞化法を適用することによって、胎児と成体細胞外マトリックスの比較分析を可能にすることである。したがって、この方法は、異なる文脈で細胞外マトリックスの研究を促進する癌患者からの外科的切除などの他の器官に適用され成功している。まず、氷冷PBSで胎児と成人のマウスの心臓をすすぐ。その後、組織を解剖顕微鏡の下に置き、まっすぐ小さなはさみを使用して、大人のマウスの心臓から心房、右心室、およびセプタを取り除きます。左心室を新しいペトリ皿に移し、左心室の自由な壁を2ミリメートルの厚い縦方向のストリップに分けます。一貫した脱細胞化効率のためには、同種サイズの成体マウス左心室外植を使用することが不可欠である。2 x 2ミリメートルのグリッドを使用してストリップをさらに小さな組織断片にミンチする前に、湾曲した先端を持つメスと鋸歯状のピンセットを使用して乳頭筋を取り除きます。すべての組織がみじん切りにされたら、外植を覆うのに十分なPBSで作品を簡単にすすいだ。そして、胎児の心臓と成人心臓組織の破片を、チューブ当たり最適な切断温度またはOCT化合物の250マイクロリットルを含む個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。次いで、乾燥氷で心臓組織サンプルを凍結し、マイナス80°Cで貯蔵するためにイコペンタンを冷却した。凍結保存組織を脱細胞化するには、凍結したサンプルを、外植体を完全に覆うのに十分なPBSを含むペトリ皿に入れます。OCTが溶けた後、PBSの新しいペトリ皿にサンプルを水没させ、1回の洗浄ごとに60 RPMで10〜15分間シェーカーでサンプルを3回洗浄します。最後の洗浄の後、滅菌24ウェル組織培養プレートの各ウェルに働く低張性緩衝液を1ミリリットル加え、細かい鉗子を使用して各ウェルに1つの断片を移す。プレートを摂氏25度で18時間インキュベートし、165 RPMで165 RPMで1回のPBSを1回洗浄します。最後の洗浄後、調製したばかりのドデシル硫酸ナトリウムまたはSDS溶液をそれぞれウェルに1ミリリットル加え、摂氏25度で24時間インキュベーションします。翌日、1回の洗浄ごとに1ミリリットルの低張着洗浄バッファーで3回の20分間の洗浄でサンプルをすすぐ後、37°Cで3時間のインキュベーションのために各ウェルに1ミリリットルのDNase処理溶液を添加します。インキュベーションの終わりに、脱細胞化されたサンプルはゼラチン様の一貫性を失うはずです。その後、組織断片を1回のPBSで1ミリリットルで3回洗浄し、1回の洗浄につき20分間、室温と60RPMで1ミリリットルの新鮮なPBSで一晩洗浄します。細胞残骸を脱細胞化組織からの除去を評価するために、翌朝、室温で2.5〜3時間の間、1ウェルあたり0.03%のエオシン水溶液を補った、作りたての10%式中性バッファーの1ミリリットルでサンプルを修正する。インキュベーションの終わりに、サンプルを1つのPBSを1回の井戸で洗浄します。そして、使い捨てビニール標本金型を使用して、製造業者の仕様に従って細胞化された断片を細胞化処理ゲルの細胞化に封入します。次に、カプセル化断片を埋め込みカセットを生検処理に移す。そしてエタノール、イソパラフィン性脂肪族炭化水素溶液および2つの56°Cのパラフィン出現で連続した30分のインキュベーションを通してパラフィン埋め込みのためのサンプルを処理する。2番目のパラフィンが出現した後、サンプルをパラフィンブロックに取り付け、ミクロトームを使用して3マイクロメートルの厚いセクションを得る。次に、ヘマトキシリンとエオシンとマッソンのトリクロム染色を標準的なプロトコルに従って染色することにより、脱細胞化効率を検証します。一晩PBSを振盪して洗浄した後、調製したDPBSを500マイクロリットル加え、各足場にアンホテリシンB1%抗生物質溶液の1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを添加する。そして、摂氏4度で1〜7日間サンプルを保管してください。細胞を装着する前に、抗生物質を添加した500マイクロリットルの細胞基底培地にDPBS溶液を交換してください。そして、37°Cで1時間足場をインキュベートします。インキュベーションの最後に、顕微鏡を使用して、足場あたり96ウェルプレートの1つのウェルの中央に4マイクロリットルのDPBSドロップを追加します。そして、薄いストレートピンセットを使用して、1つの脱細胞スキャフォールドを各ドロップの上部に移動させます。吸引によって余分なDPBSを取り除き、足場が折り畳まれたりしわが寄っていないか確認します。足場が端で乾燥したら、各足場の上に関心のある細胞の単一の細胞懸濁液をゆっくりと座らせる。胚性18日目の脱細胞化組織は、非常に半透明な構造を特徴とし、一方、成体外植は半透明から白色の外観を示す。ヘマトキシリンとエオシンおよびマッソンのトリクホーム染色は、多孔質メッシュ存在により効率的な細胞除去を確認する。核物質は、脱細胞化後、移植時に望ましくない炎症反応を引き起こさないようにするために不可欠な非操作組織と比較して約99.8%減少する。座った足場の中の細胞の生存率は、カルセイン染色によってインビトロ培養中に監視することができる。足場をまたぐ細胞の再集団化および分布の末端解析は、中央のバイオスキャフォールド部のこれらの代表的な画像で観察されるパラフィン処理の後に行うこともできます。そこで、この技術は、胎児および成人マウスの心臓だけでなく、他の組織からの細胞外マトリックスの生理活性特性の探査における研究者のための道を開いた。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

全肝臓の細胞化とRecellularization

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Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

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人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

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To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列

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Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

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Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...