Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
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저자는 관련 중요 한 토론에 대 한 핀 토-마-Ó 연구소의 모든 구성원에 게 빚을. 이 작품 프로젝트 "CARDIOSTEM 설계 심장 조직 및 심장 혈관 응용 프로그램에 대 한 줄기 세포 기반 요법" 아래 프로그램이 MIT Fundação 파라 과학 전자 기술 (FCT)에 의해 지원 되었다 (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. [SFRH/BD/88780/2012] FCT 화목의 받는 사람 이며 M.J.O.은 FCT 동료 (FCT 탐정 2012).

I3S 동물 윤리 위원회 및 Direção Geral 드에 의해 설명 하는 모든 방법론 승인 했다 Veterinária (DGAV)와 따라 유럽 의회 지침 2010/63/유럽 연합.
1입니다. decellularization 솔루션의 준비
참고: 모든 decellularization 솔루션 0.22 μ m 멤브레인 필터를 통해 필터링 해야 하 고 제외 하 고 3 개월의 최대 저장 지정 그렇지 않으면.
<ol><li>1 x pbs: NaCl, 나2HPO4 KCl, 2...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

세포 외 기질 (ECM) 수많은 생리 활성 펩 티 드 및 성장 요인 내포의 저수지로 구성 된 섬유와 접착제 glycoproteins의 매우 역동적이 고 복잡 한 채널 이다. 세포 접착, 골격 역학, 운동 성/마이그레이션, 확산, 감 별 법, apoptosis의 주요 변조기로 ECM 적극적으로 세포 기능 및 행동을 통제 한다. 세포질 행동 2D와 3D 문화에서 차이가 알면, 있었다 정확 하 게 자연 조직 환경을 복제할 수 소설 organotypic 모델을 ...

세포 외 기질 (ECM) 중요 한 세포질 과정, 즉 운명 결정, 확산 및 감 별 법1,2를 조절 하는 분자의 동적 네트워크입니다. 세포-ECM 상호 작용의 조사는 비보에네이티브 ECM 속성의 단순화 구성 2 차원 (2D) ECM 구성 요소와 코팅 생체 외 문화에서에서 주로 수행 되었습니다. Decellularization 세포 외 건축과 네이티브 조직 및 장기3,4의 크게 보존 acellular 3D 같은 ECM bioscaffolds를 생성 합니다. 조직 공학에 대 한 생리 활성 공중 발판으로 봉사 이외에 decellularized 3D ECM 생체는 그 병렬 vivo에서 환경 생물학 세포-ECM을 평가 하기 위해 새로운 플랫폼으로 등장 하고있다.
뚜렷한 조직, 기관 및 나이의 ECM 구성 요소의 차동 역할의 평가 네이티브 bioscaffolds 생성의 유사한 프로토콜의 사용으로 도움이 됩니다. 마음에 우리 기관 microenvironment의 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 방식으로 태아와 성인 파생 된 샘플의 decellularization에 대 한 다양 한 프로토콜을 개발 했습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 우리는 네이티브 심장 microenvironment를 점령 하 고 태아 ECM 심장 세포5의 더 높은 repopulation 수익률을 촉진 했다. Decellularization는 더 거주 구조와의 차이점 지하실 lamina 및 pericellular 매트릭스 메쉬 배열 수준에서 태아 및 성인 ECM 섬유 구성5식별 제공. 이 작품 전에 동일한 decellularization 접근을 사용 하 여 다른 ontogenic 단계에서 조직의 머리 비교만 붉은 털 원숭이 신장 및 설치류 마음 보고 되었습니다. 또한, 제한 된 수의 연구 보고서 태아 조직/기관 decellularization se 당5,,67. 이 독특한 decellularization 에이전트로; SDS를 사용 하 여 달성 되었습니다. 그러나, 뚜렷한 SDS 농도 태아와 성인 심장 조직7,8decellularization 위해 사용 되었다. SDS 세포질 및 핵 자료의 정리에 대 한 가장 효과적인 이온 세제 중 하나 이며 다른 조직 및 표본9,10decellularization에서 널리 이용 된다. 높은 SDS 농도 노출의 연장된 기간을 포함 하는 솔루션은 단백질 변성, glycosaminoglycan (개 그) 감소와 콜라겐 소10,11의 상관 되었다 있다 따라서는 ECM 보존 및 셀 제거 사이의 균형은 필요 합니다. 태아 및 성인 심장 조직에 동일한 절차를 적용 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 3 순차적 단계에서 나누어져: 삼투성 충격 (소형 버퍼); 세포를 세포 지질 단백질, DNA-단백질 및 단백질 단백질 상호 작용 (0.2 %SDS);의 가용 화 그리고 핵 재료 제거 (DNase 치료)입니다.
우리의 프로토콜 몇 가지 장점을 보여줍니다: 내가) 나이 특정 심장 조직의 동일한 decellularization 전략; 응용 프로그램에 의해 동등한 decellularization의 가능성 특수 방법이 나 장비에 대 한 ii) 요구 사항 iii)로 인간의 내장 biopsies12 와 마우스 폐13;에서 사소한 변경으로 성공적으로 적용 된 다른 조직 및 종 적응 준비 그리고, 중요 한 것은, iv) 더 밀접 하 게 기본 조직 microenvironment의 분자 기능을 모방 하는 3D와 같은 organotypic 문화의 어셈블리를 사용 하는 동안 ECM biomechanical 속성을 해결할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

세포 외 기질 (ECM)의 현재 정보-셀 통신 변환 큰 2 차원 (2D) 생체 외에서 문화 연구 ECM 구성 요소 표면 코팅으로 표시 됩니다. 이러한 문화 시스템 구성 조직 구조, 생 화 확 적인 구성과 기계적 특성을 포함 하는 ECM의 복잡 한 자연의 단순화. 더 나은 심장 microenvironment를 형성 하는 ECM 셀 통신 에뮬레이션, 우리 전체 태아 심장의 decellularization에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 하 고 성인 좌 심 실 조직 explants 비교 연구에 대 한 동시에. 프로토콜 전문된 기술 이나 장비에 대 한 소형 버퍼, 음이온 계면 활성 제 속성, 그리고 어떤 요구 사항 없이 DNase 처리의 세제를 사용 하 여를 결합합니다. 다양 한 나이의 과목에서 조직 샘플에서 동일한 decellularization 전략의 응용 프로그램은 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 이다. 현재 의정서 태아 및 성인 심장 ECM 메쉬 및 생물 세포 응답에 걸쳐 독특한 구조 차이 식별을 허용 한다. 또한,는 여기 방법론 성공적으로 적용 되 다른 조직 및 사소한 조정 종에와 같은 인간의 내장 biopsies을 마우스 폐에 광범위 한 응용 프로그램을 보여 줍니다.

세 가지 주요 기술을 통해 decellularization 효율성을 평가 합니다: 거시적인 관찰, 조직학 및 DNA 정량화. 샘플 게시물 SDS 처리의 거시적인 모양 세포 제거의 효능 직접적으로 영향을. SDS 인큐베이션, 샘플에 약간 (그림 1C) 흰 반투명으로 표시 됩니다. 태아 (E18) 성인 explants는 반투명 흰색 외관을 하는 동안 decellularized 조직 높은 반투명 구조 특징 이다. 하?...

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Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.

시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

이 방법은 세포외 매트릭스가 심장의 다른 생리적 및 발달 단계 동안 가지고있는 영향에 대한 심혈관 분야에서 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 유형의 조직에 유사한 탈세포화 방법을 적용하여 태아와 성인 세포 외 세포 행렬 사이의 비교 분석을 허용한다는 것입니다. 그래서 이 방법은 다른 맥락에서 세포외 매트릭스의 연구를 촉진하는 암 환자에서 외과 절제술과 같은 그밖 기관에 성공적으로 적용되었습니다.먼저 얼음이 차가운 PBS로 태아와 성인 마우스 하트를 잠시 헹구십시오. 그런 다음 조직을 해부 현미경 아래에 놓고 직선 작은 가위를 사용하여 심실, 성인 마우스 하트에서 아리아, 오른쪽 심실 및 셉타를 제거합니다. 왼쪽 심실을 새로운 페트리 접시로 옮기고 왼쪽 심실 없는 벽을 2mm 두께의 세로 스트립으로 나눕니다.상종 마우스 왼쪽 심실의 사용은 일관된 탈세포화 효율에 필수적입니다. 메스와 톱니 모양의 핀셋을 사용하여 구체 근육을 제거한 후 2mm 그리드를 사용하여 스트립을 더 작은 조직 조각으로 더 잘라낸다. 모든 조직이 다진 경우, 간략하게 이절을 커버하기에 충분한 PBS로 조각을 헹구는 다.그리고 태아 심장과 성인 심장 조직의 조각을 튜브 당 최적의 절삭 온도 또는 OCT 화합물 250 마이크로 리터를 포함하는 개별 1.5 밀리리터 미세 센심 분리 튜브로 옮킨다. 그런 다음, 냉각 된 드라이 아이스에서 심장 조직 샘플을 동결하면 음의 섭씨 80도에서 보관할 수 있습니다. 냉동 보존 조직을 탈세포화하기 위해 냉동 샘플을 페트리 접시에 놓고 충분한 PBS가 함유되어 이 기간을 완전히 덮습니다.OCT가 녹은 후, PBS의 새로운 페트리 접시에 샘플을 담그고 세척 당 60 RPM에서 10 ~ 15 분 동안 셰이커에 샘플을 세 번 세척하십시오. 마지막 세척 후, 멸균 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 작동 저혈압 버퍼의 1 밀리리터를 추가하고 각 우물에 하나의 조각을 전송하는 미세 한 집게를 사용합니다. 18시간 동안 섭씨 25도에서 플레이트를 배양하고, 165 RPM에서 플레이트를 165RPM에서 배양한 다음, 세차당 PBS 1밀리리터로 1밀리리터로 3시간 세척합니다.마지막 세척 후, 25섭씨24시간 배양시 신선하게 준비된 도데실 황산나트륨 또는 SDS 용액 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 다음 날, 세척당 저혈압 세척 버퍼 1밀리리터에 3개의 20분 세척으로 샘플을 헹구고 37°C의 배양시 각 웰에 DNase 처리 용액 1밀리리터를 첨가합니다. 잠복이 끝나면 셀룰러 화된 샘플은 젤라틴과 같은 일관성을 잃어야 합니다.그런 다음 세차당 PBS 1밀리리터로 조직 조각을 세 번 씻은 다음 실온과 60 RPM에서 1 밀리리터의 신선한 PBS로 하룻밤 세척합니다. 탈세포 조직에서 세포 잔해의 제거를 평가하기 위해, 다음 날 아침 은 실온에서 2.5 ~ 3 시간 동안 잘 당 0.03 %의 수성 에신으로 보충 된 신선하게 준비 된 10 %의 수제 중성 버퍼의 1 밀리리터로 샘플을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 PBS 의 1 밀리리터로 잘 세척하십시오.그리고 일회용 비닐 시편 몰드를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 조직학 처리 젤에서 탈세포화된 조각을 캡슐화합니다. 다음으로 캡슐화된 조각을 생검 처리 카세트로 옮기. 그리고 에탄올, 이소파라피닉 알리파틱 탄화수소 용액 및 섭씨 56도의 상승 농도에서 연속적으로 30분 배양을 통해 파라핀을 포함시키는 파라핀 샘플을 처리한다.두 번째 파라핀이 나타난 후, 파라핀 블록에 샘플을 장착하고 마이크로토메를 사용하여 3마이크로미터 두께의 단면을 얻습니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 haematoxylin 및 eosin 및 Masson의 삼색 얼룩으로 섹션을 염색하여 탈세포화 효율을 확인합니다. 하룻밤 PBS가 흔들리는 후, 새로 준비된 DPBS 500 마이크로리터를 첨가하고, 각 비계에 암포테리신 B 1%의 항생제 용액의 밀리리터 당 2.5 마이크로그램을 첨가합니다.그리고 샘플을 섭씨 4도에서 1~7일 동안 보관하십시오. 세포를 앉기 전에, DPBS 용액을 항생제로 보충된 세포 기저 배지500 마이크로리터로 대체하십시오. 그리고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 비계를 배양하십시오.인큐베이션의 끝에서 현미경을 사용하여 스캐폴드 당 96웰 플레이트의 한 우물의 중앙에 DPBS의 4개의 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 얇은 직선 핀셋을 사용하여 탈세포 비계 1개를 각 낙하의 상단으로 옮기습니다. 포부로 추가 DPBS를 제거하고 스캐폴드가 접히거나 구겨지지 않은지 확인합니다.스캐폴드가 가장자리에서 건조되면 각 스캐폴드 의 상단에 관심 있는 셀의 단일 셀 현탁액을 천천히 앉히게 합니다. 배아일 18탈세포조직은 고반투명 구조가 특징이며, 성인 이질은 백색 외관에 반투명을 나타낸다. 헤마톡시린과 에오신과 마슨의 트리홈 얼룩은 존재 다공성 메쉬에 의해 효율적인 세포 제거를 확인합니다.핵 물질은 탈세포화 후 약 99.8%까지 감소하며, 이식 시 원치 않는 염증 반응을 유발하는 것을 피하는 데 필수적인 비조작 조직과 비교됩니다. 앉아있는 비계 내의 세포 생존능력은 칼신 염색에 의해 체외 내 배양 중에 모니터링될 수 있다. 스캐폴드에 걸친 세포 재인구 및 분포의 말단 분석은 중앙 바이오스캐폴드 섹션의 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이 파라핀 처리 후에도 수행될 수 있다.그래서이 기술은 태아와 성인 마우스 심혼 뿐 아니라 그밖 조직의 세포외 매트릭스의 생리활성 속성의 탐구에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...