Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Forfatterne er gjeld til alle medlemmer av Pinto--Ó laboratorium for relevante kritisk diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) under prosjektet "CARDIOSTEM-konstruert hjerte vev og stilk cellen-basert behandling for hjerte applikasjoner" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. er en mottaker av en FCT fellesskap [SFRH/BD/88780/2012] M.J.O. er en FCT kar (FCT-etterforsker 2012).

Alle metodikkene som beskrevet ble godkjent av i3S dyr etikk og Direção Geral de Veterinária (DGAV) og er i samsvar med det europeiske parlamentet direktivet 2010/63/EU.
1. forberedelse av decellularization løsninger
Merk: Alle decellularization løsninger skal være filtrert gjennom et 0.22 μm membran filter og lagret for maksimum 3 måneder, bortsett fra angitt.
<ol><li>For 1 x PBS: Bland 8 g NaCl, 1.01 g Na2HPO4 200 mg KCl, og 200 mg ...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

Den ekstracellulære matrisen (EFM) er en meget dynamisk og komplekse meshwork av fibrøs og lim glykoproteiner, bestående av et reservoar av rekke bioaktive peptider og fanget vekstfaktorer. Som store modulator celle vedheft, cytoskjelett dynamics, motilitet/overføring, spredning, differensiering og apoptose regulerer ECM aktivt cellulære funksjoner og atferd. Å vite at mobilnettet atferd avviker i 2D og 3D kulturer, har det vært innsatsen for å utvikle romanen organotypic modeller som replikeres nøyaktig naturli...

Den ekstracellulære matrisen (EFM) er et dynamisk nettverk av molekyler som regulerer viktig cellulære prosesser, nemlig skjebne avgjørelse, spredning og differensiering1,2. Etterforskningen av celle-ECM interaksjoner blitt utført hovedsakelig i todimensjonale (2D) i vitro kulturer belagt med ECM komponenter, som utgjør en forenkling av innfødte ECM egenskaper i vivo. Decellularization genererer acellular 3D-lignende ECM bioscaffolds som i stor grad bevarer ekstracellulære arkitektur og sammensetningen av innfødte vev og organer3,4. I tillegg bioaktive stillaser tissue engineering, er decellularized 3D ECM biologisk materiale fremstår som roman plattformer for å vurdere celle-ECM biologi som tilsvarer i vivo miljøet.
Vurdering av rollen annerledes ECM komponentene i forskjellige vev, organer og alder fordelen med bruk av lignende protokoller generere innfødte bioscaffolds. På hjertet, har vi utviklet en allsidig protokoll for decellularization av fetal og voksen-avledet prøver, som en alternativ tilnærming til å utføre komparative studier av orgel-microenvironment. Med denne metoden, vi fanget den opprinnelige hjerte microenvironment og viste at fosterets ECM fremmer høyere repopulation gir cardiac celler5. Decellularization gitt ytterligere identifikasjon av bosatt strukturelle forskjeller mellom fosterets og voksen ECM nivået av kjelleren lamina og pericellular matrix nettet arrangement og fiber komposisjon5. Før dette arbeidet, er head-to-head sammenligning av vev på ulike ontogenic stadier ved hjelp av samme decellularization tilnærming bare rapportert for rhesus monkey nyrer og gnager hjerter. I tillegg rapporterer et begrenset antall studier fosterets vev/orgel decellularization sådan5,6,7. Dette er oppnådd ved hjelp av SDS som unike decellularization agent; Imidlertid ble forskjellige SDS konsentrasjoner brukt til decellularization av fetal og voksen hjerte vev7,8. SDS er en av de mest effektive ioniske vaskemidler for klarering av cytoplasmatiske og kjernefysisk materiale, og brukt mye i decellularization av ulike vev og prøver9,10. Løsninger som inneholder høye konsentrasjoner av SDS og lengre eksponering har vært korrelert med protein rødsprit, glycosaminoglycan (GAGs) tap og forstyrrelse av kollagen fibrils10,11, og derfor en balanse mellom ECM bevaring og celle fjerning er nødvendig. Du kan bruke samme fremgangsmåte til fosterets og voksen hjertet vev ved protokollen beskrevet her er delt i tre sekvensielle trinn: celle lysis av osmotisk sjokk (hypotonisk buffer); solubilization av lipid-protein, DNA-protein og protein-protein interaksjoner (0,2% SDS); og kjernefysisk materiale fjerning (DNase behandling).
Våre Protokoll viser flere fordeler: jeg) at tilsvarende decellularization Aldersavhengige hjerte vev ved bruk av samme decellularization strategi; II) ingen krav til spesialiserte eller utstyr; III) klar tilpasning til andre vev og arter som det har vært anvendt med mindre endringer i menneskelige tarmen biopsier12 og mus lunge13; og viktigst, iv) kan ta ECM biomekaniske egenskaper samtidig som den muliggjør montering av 3D-lignende organotypic kulturer at mer tett etterligne molekylær funksjonene i den opprinnelige vev microenvironment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Nåværende kunnskap om ekstracellulær matrix (EFM)-celle-kommunikasjon betyr store todimensjonal (2D) i vitro kultur studiene der ECM komponenter presenteres som en overflate belegg. Systemene kultur utgjør en forenkling av den komplekse naturen av vev ECM som omfatter biokjemisk komposisjon, struktur og mekaniske egenskaper. Bedre emulere ECM-celle kommunikasjonen utformingen av cardiac microenvironment, vi utviklet en protokoll som tillater decellularization av hele fosterets hjerte og voksen venstre ventrikkel vev explants samtidig for komparative studier. Protokollen kombinerer bruk av en hypotonisk buffer, et vaskemiddel anionic surfactant egenskaper og DNase behandling uten noen som helst krav for spesialiserte ferdigheter eller utstyr. Bruk av samme decellularization strategi over vevsprøver fra fag av ulike alder er en alternativ tilnærming til å utføre komparative studier. Nåværende protokollen tillater identifikasjon av unike strukturelle forskjeller over fosterets og voksen cardiac ECM mesh og biologiske mobilnettet svar. Videre den her metodikk demonstrerer en bredere anvendelse som blir brukt i andre vev og arter med mindre justeringer, som menneskelige tarmen biopsier og mus lunge.

Decellularization effektiviteten bør vurderes gjennom tre viktigste teknikker: makroskopisk observasjon, histology og DNA kvantifisering. Makroskopisk utseende prøver post-SDS behandling påvirker indirekte effekten av fjerne. Etter SDS inkubasjon vises prøver som gjennomsiktig til hvitaktig (figur 1 c). Fetal (E18) decellularized vev er preget av en svært gjennomsiktig struktur mens voksen explants har en gjennomskinnelig hvit utseendet. En hvitere utsee...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Cardiac ekstracellulær matrix (EFM) er et kompleks nettverk av molekyler som arrangerer nøkkelprosesser i vev og organer mens varig fysiologiske remodeling gjennom hele livet. Standardiserte decellularization fosterets og voksen hjerter tillater komparative eksperimentelle studier av både vev i en 3D kontekst ved å fange opprinnelige arkitektur og biomekaniske egenskaper.

Sammenlignbare Decellularization av Fetal og voksen hjerte vev Explants som 3D-lignende plattformer for i Vitro studier

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Denne metoden kan bidra til å løse viktige spørsmål i kardiovaskulærfeltet om virkningen den ekstracellulære matrisen har under ulike fysiologiske og utviklingsstadier i hjertet. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater en komparativ analyse mellom fosterets og voksne ekstracellulære matriser ved å bruke en lignende decellulariseringsmetode til begge typer vev. Så denne metoden har vært vellykket brukt på andre organer som kirurgiske reseksjoner fra kreftpasienter som letter studien av den ekstracellulære matrisen i forskjellige sammenhenger.Begynn med å skylle fosterets og voksne musehjerter med iskald PBS. Plasser deretter vevet under et dissekerende mikroskop og bruk rett liten saks for å fjerne atria, høyre ventrikkel og septa fra de voksne musehjertene. Overfør venstre ventrikkel til en ny petriskål og del venstre ventrikkelfri vegg i to millimeter tykke langsgående strimler.Bruken av voksen mus venstre ventrikkel explants av en homogen størrelse er avgjørende for en konsekvent decellularisering effektivitet. Bruk skalpell og taggete pinsett med buet spiss for å fjerne papillær muskel før du bruker en to og to millimeter rutenett for å ytterligere hakke strimler i mindre vev fragmenter. Når alt vevet er hakket, skyll straks bitene med nok PBS til å dekke explants.Og overføre fosterhjerter og biter av voksent hjertevev til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør som inneholder 250 mikroliter optimal skjæretemperatur eller OCT sammensatt per rør. Deretter fryser hjertevevsprøvene i tørriskjølt isopentan for lagring ved negativ 80 grader Celsius. For å decellularisere kryobeservert vev plassere de frosne prøvene i en petriskål som inneholder nok PBS til å dekke explants helt.Etter at OCT har smeltet, senk prøvene i en ny petriskål av PBS og vask prøvene tre ganger på en shaker i 10 til 15 minutter ved 60 RPM per vask. Etter den siste vasken, legg til en milliliter arbeidshypotonisk buffer til hver brønn av en steril 24-brønns vevskulturplate og bruk fine tang for å overføre ett fragment til hver brønn. Inkuber platen ved 25 grader Celsius i 18 timer, ved 165 RPM etterfulgt av tre en-timers vasker i en milliliter PBS per brønn, per vask.Etter siste vask, tilsett en milliliter nylaget natriumvaldecylsulfat eller SDS-løsning til hver brønn i en 24-timers inkubasjon ved 25 grader Celsius. Neste dag, skyll prøvene med tre 20 minutters vasker i en milliliter hypotonisk vaskebuffer per vask etterfulgt av tilsetning av en milliliter DNase behandlingsløsning til hver brønn i en tre timers inkubasjon, ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen bør decellulariserte prøvene miste sin gelatinlignende konsistens.Vask deretter vevsfragmentene tre ganger med en milliliter PBS i 20 minutter per vask etterfulgt av en nattvask i en milliliter frisk PBS per brønn ved romtemperatur og 60 RPM. For å vurdere fjerning av cellulære rester fra det decellulæriserte vevet, må du neste morgen fikse prøvene i en milliliter nylaget 10% formelnøytral buffer supplert med 0,03% av vandig eosin per brønn i 2,5 til tre timer ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask prøvene i en milliliter PBS per brønn.Og bruk en engangs vinylprøveform for å innkapsle decellulæriserte fragmentene i histologibehandlingsgelen i henhold til produsentens spesifikasjoner. Deretter overfører du innkapslede fragmenter til en biopsibehandling som bygger inn kassetten. Og behandle prøvene for parafin innebygging gjennom påfølgende 30-minutters inkubasjoner i stigende konsentrasjoner av etanol, isoparafin alifatisk hydrokarbonløsning og to 56 grader Celsius parafin dukker opp.Etter den andre parafinen dukket opp, montere prøver i en parafinblokk og bruke en mikrotom for å oppnå tre-mikrometer tykke seksjoner. Kontroller deretter decellulariseringseffektiviteten ved å fargese seksjonene med hematoksylin og eosin og Massons trichrome flekker i henhold til standardprotokoller. Etter natten PBS vask med risting, tilsett 500 mikroliter av nylaget DPBS, supplert med 2,5 mikrogram per milliliter amfotericin B 1% antibiotikaløsning til hvert stillas.Og lagre prøvene i en til syv dager på fire grader Celsius. Før du ser på cellene, må du erstatte DPBS-løsningen med 500 mikroliter cellebasalmedium supplert med antibiotika. Og inkuber stillasene i en time ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, bruk et mikroskop for å legge til en fire mikroliter dråpe DPBS til midten av en brønn av en 96-brønns plate per stillas. Og bruk tynne rette pinsett for å overføre ett decellularisert stillas til toppen av hver dråpe. Fjern eventuelle ekstra DPBS ved aspirasjon og bekreft at stillaset ikke er brettet eller rynket.Når stillasene har tørket på kantene, sakte sete en enkelt celle suspensjon av cellene av interesse på toppen av hvert stillas. Embryonisk dag 18 decellularisert vev er preget av en svært gjennomskinnelig struktur mens voksne explants viser en gjennomskinnelig til hvitt utseende. Hematoksylin og eosin og Massons trichome flekker bekrefter en effektiv cellefjerning av tilstedeværelsen porøs mesh.Kjernefysisk materiale reduseres med ca. 99,8% etter decellularisering, sammenlignet med ikke-manipulert vev som er avgjørende for å unngå å utløse en uønsket inflammatorisk respons ved implantasjon. Celle levedyktigheten i sittende stillas kan overvåkes under in-vitro kultur ved calcein farging. Terminalanalyse av celleompopulasjon og distribusjon på tvers av stillas, kan også utføres etter parafinbehandling som observert i disse representative bildene av en sentral bioscaffold-seksjon.Så denne teknikken banet vei for forskere i utforskningen av de bioaktive egenskapene til den ekstracellulære matrisen fra foster- og voksne musehjerter, men også av andre vev.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillær Force Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering av en menneskelig 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal Cardiac Stillas: Nye matriser for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikasjon av ekstracellulære matrise-avledet Skum og Mikrocarriers som Tissue-spesifikke cellekultur og Delivery plattformer

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

To metoder for Decellularization av anlegget vev for Tissue Engineering programmer

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...