Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
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Os autores estão em dívida para todos os membros do laboratório de Pinto--Ó para discussão crítica relevante. Este trabalho foi financiado pelo Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) no âmbito do projecto "CARDIOSTEM-engenharia de tecidos cardíacos e terapias baseadas em células-tronco para aplicações cardiovasculares" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. é um destinatário de uma bolsa da FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. é um companheiro da FCT (FCT-investigador 2012).

Todas as metodologias descritas foram aprovadas pelo i3S Comitê de ética Animal e Direção Geral de Veterinária (DGAV) e estão em conformidade com a europeias Parlamento Directiva 2010/63/CE.
1. preparação das soluções decellularization
Nota: Decellularization todas as soluções devem ser filtradas através de um filtro de membrana de 0,22 μm e armazenadas por um período máximo de 3 meses, exceto especificado o contrário.
<ol><li>Para 1X PBS: mistura...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

A matriz extracelular (ECM) é uma malha altamente dinâmica e complexa de glicoproteínas fibrosas e adesivas, consistindo de um reservatório de inúmeros peptídeos bioativos e fatores de crescimento aprisionados. Como o principal modulador de adesão celular, dinâmica do citoesqueleto, mobilidade/migração, proliferação, diferenciação e apoptose, ECM ativamente regula o comportamento e a função celular. Sabendo que o diferente comportamento celular em culturas 2D e 3D, tem havido esforços para desenvolver mo...

A matriz extracelular (ECM) é uma rede dinâmica de moléculas que regulam processos celulares importantes, nomeadamente o destino-decisão, proliferação e diferenciação de1,2. A investigação de interacções célula-ECM foi realizada principalmente em duas dimensões (2D) em vitro culturas revestido com componentes de ECM, que constituem uma simplificação das propriedades nativas de ECM encontrado na vivo. Decellularization gera bioscaffolds de ECM 3D-como acelular que preservam em grande parte a arquitetura extracelular e composição de tecidos nativos e órgãos3,4. Além de servir como andaimes bioativos para a engenharia de tecidos, biomateriais de ECM decellularized 3D estão emergindo como plataformas de romance para avaliar biologia celular-ECM desse paralelo o ambiente em que vivo.
Avaliação da função diferencial dos componentes de diferentes tecidos, órgãos e idade ECM serão beneficiados com o uso de protocolos semelhantes de gerar bioscaffolds nativo. No coração, temos desenvolvido um protocolo versátil para decellularization de amostras fetais e adulto-derivado, como uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos com o microambiente do órgão. Usando esta metodologia, capturamos o microambiente cardíaca nativa e mostrou que o ECM fetal promove maior rendimento de repovoamento de células cardíacas5. Decellularization ainda mais desde a identificação de residentes diferenças estruturais entre ECM fetal e adulto ao nível da cave lamina e pericelular matriz malha o arranjo e composição de fibra5. Antes deste trabalho, Head-to-comparação de tecidos em diferentes estágios de ontogenic, usando a mesma abordagem de decellularization só tem sido relatado para roedores corações e rins de macaco rhesus. Além disso, um número limitado de estudos relatam o tecido fetal/órgão decellularization por si5,6,7. Isto foi conseguido usando SDS como agente exclusivo de decellularization; no entanto, distintas concentrações de SDS foram usadas para o decellularization do tecido cardíaco fetal e adulto7,8. SDS é um dos detergentes iônicos mais eficazes para o apuramento de material citoplasmático e nuclear e amplamente utilizado na decellularization de diferentes tecidos e espécimes9,10. Soluções contendo altas concentrações de SDS e longos períodos de exposição tem sido correlacionadas com a desnaturação da proteína, a perda de glicosaminoglicano (GAGs) e a ruptura do colágeno fibrilas10,11e, portanto, um equilíbrio entre preservação e célula remoção de ECM é necessário. Para aplicar o mesmo procedimento para o tecido cardíaco fetal e adulto, o protocolo descrito neste documento é dividido em três etapas sequenciais: lise de células por choque osmotic (hipotônica tampão); solubilização dos lipídios-proteínas, ADN-proteína e proteína-proteína interações (0,2% SDS); e remoção de material nuclear (tratamento de DNase).
Nosso protocolo mostra várias vantagens: eu) a possibilidade de decellularization equivalente dos tecidos cardíacos de idade específica aplicando a mesma estratégia de decellularization; II) sem requisitos para métodos especializados ou equipamento; III) pronta adaptação para outros tecidos e espécies como foi aplicado com sucesso com pequenas alterações em biópsias de intestino humano12 e mouse pulmão13; e, importante, iv) pode resolver propriedades biomecânicas de ECM, permitindo a montagem de organotypic 3D-como as culturas que mais estreitamente imitam as características moleculares do microambiente do tecido nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Conhecimento atual da matriz extracelular (ECM)-célula comunicação se traduz em estudos de grande bidimensional (2D) cultura in vitro, onde os componentes de ECM são apresentados como um revestimento de superfície. Estes sistemas de cultura constituam uma simplificação da natureza complexa do tecido ECM que engloba a composição bioquímica, estrutura e propriedades mecânicas. Para melhor emular a ECM-célula comunicação moldar o microambiente cardíaca, desenvolvemos um protocolo que permite a decellularization do coração fetal toda e tecido adulto ventrículo esquerdo explants simultaneamente para estudos comparativos. O protocolo combina a utilização de um buffer hipotônica, um detergente de surfactante aniônico Propriedades e tratamento de DNase sem qualquer exigência de habilidades especializadas ou equipamento. A aplicação da estratégia de decellularization da mesma através de amostras de tecido de indivíduos de idade diferentes é uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos. O presente protocolo permite a identificação das únicas diferenças estruturais entre fetais e adultas cardíaca ECM malha e biológicas respostas celulares. Além disso, a aqui a metodologia demonstra uma aplicação mais vasta, sendo aplicada com sucesso em outros tecidos e espécies com pequenos ajustes, tais como em biópsias de intestino humanas e pulmão do rato.

A eficiência de decellularization deve ser avaliada através de três principais técnicas: observação macroscópica, histologia e quantificação de DNA. A aparência macroscópica de tratamento de amostras post-SDS indiretamente afeta a eficácia da remoção da célula. Após a incubação do SDS, amostras devem aparecer como translúcidas para esbranquiçado (Figura 1). Fetal (E18) decellularized tecidos são caracterizados por uma estrutura altamente ...

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Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Este método pode ajudar a abordar questões importantes no campo cardiovascular sobre o impacto que a matriz extracelular tem durante diferentes estágios fisiológicos e de desenvolvimento do coração. A principal vantagem dessa técnica é que permite uma análise comparativa entre matrizes extracelulares fetais e adultas, aplicando um método de descelularização semelhante aos dois tipos de tecido. Assim, esse método tem sido bem sucedido aplicado a outros órgãos, como ressecções cirúrgicas de pacientes com câncer facilitando o estudo da matriz extracelular em diferentes contextos.Comece enxaguando brevemente os corações de camundongos fetais e adultos com PBS gelado. Em seguida, coloque os tecidos sob um microscópio dissecando e use uma tesoura pequena reta para remover a atria, o ventrículo direito e o septo dos corações do rato adulto. Transfira o ventrículo esquerdo para uma nova placa de Petri e divida a parede livre do ventrículo esquerdo em tiras longitudinais de dois milímetros de espessura.O uso de explants ventrículos esquerdos de camundongos adultos de tamanho homogêneo é essencial para uma eficiência consistente de descelularização. Use o bisturi e pinças serrilhadas com ponta curva para remover o músculo papilar antes de usar uma grade de dois por dois milímetros para cortar ainda mais as tiras em fragmentos de tecido menores. Quando todo o tecido tiver sido picado, enxágue brevemente as peças com PBS suficiente para cobrir as explantas.E transfira os corações fetais e pedaços de tecido cardíaco adulto em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de temperatura de corte ideal ou composto oct por tubo. Em seguida, congele as amostras de tecido cardíaco em isócecia resfriada de gelo seco para armazenamento a 80 graus Celsius negativos. Para descelularizar os tecidos preservados crio-preservo coloque as amostras congeladas em uma placa de Petri contendo PBS suficiente para cobrir completamente as explantas.Após o derretimento do OCT, submerse as amostras em uma nova placa de Petri da PBS e lave as amostras três vezes em um agitador por 10 a 15 minutos a 60 RPM por lavagem. Após a última lavagem, adicione um mililitro de tampão hipotônico de trabalho a cada poço de uma placa de cultura tecidual estéril de 24 poços e use fórceps finos para transferir um fragmento para cada poço. Incubar a placa a 25 graus Celsius durante 18 horas, a 165 RPM seguido de três lavagens de uma hora em um mililitro de PBS por poço, por lavagem.Após a última lavagem, adicione um mililitro de sulfato de dodecyl de sódio recém-preparado ou solução de SDS para cada poço para uma incubação de 24 horas a 25 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue as amostras com três lavagens de 20 minutos em um mililitro de tampão de lavagem hipotônica por lavagem seguido da adição de um mililitro de solução de tratamento DNase para cada poço para uma incubação de três horas, a 37 graus Celsius. No final da incubação, as amostras descelularizadas devem perder sua consistência semelhante à gelatina.Em seguida, lave os fragmentos de tecido três vezes com um mililitro de PBS por 20 minutos por lavagem seguido de uma lavagem durante a noite em um mililitro de PBS fresco por poço em temperatura ambiente e 60 RPM. Para avaliar a remoção de restos celulares do tecido descelularizado, na manhã seguinte fixe as amostras em um mililitro de tampão neutro de fórmula recém-preparada complementada com 0,03% de eosina aquosa por poço por 2,5 a 3 horas à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as amostras em um mililitro de PBS por poço.E use um molde de espécime de vinil descartável para encapsular os fragmentos descelularizados em gel de processamento de histologia de acordo com as especificações do fabricante. Em seguida, transfira os fragmentos encapsulados para um processo de biópsia incorporando. E processe as amostras para parafinas incorporando através de sucessivas incubações de 30 minutos em concentrações ascendentes de etanol, solução de hidrocarbonetos alifáticos isoparafina e dois parafinas de 56 graus Celsius.Após a segunda parafina emergente, monte amostras em um bloco de parafina e use um microtómeo para obter seções de três micrômetros de espessura. Em seguida, verifique a eficiência de descelularização colorindo as seções com hematoxilina e eosina e as manchas tricráticas de Masson de acordo com os protocolos padrão. Após a lavagem da PBS durante a noite com agitação, adicione 500 microliters de DPBS recém-preparados, complementados com 2,5 microgramas por mililitro de solução de anfotericina B 1% antibiótico para cada andaime.E armazene as amostras por um a sete dias a quatro graus Celsius. Antes de acomodar as células, substitua a solução DPBS por 500 microliters de meio basal celular suplementados com antibióticos. E incubar os andaimes por uma hora a 37 graus Celsius.No final da incubação, use um microscópio para adicionar uma queda de quatro microliter de DPBS ao centro de um poço de uma placa de 96 poços por andaime. E use pinças retas finas para transferir um andaime descelularizado para o topo de cada gota. Remova qualquer DPBS extra por aspiração e confirme que o andaime não está dobrado ou enrugado.Quando os andaimes secaram nas bordas, assento lentamente uma única suspensão celular das células de interesse na parte superior de cada andaime. O dia embrionário 18 tecidos descelularizados são caracterizados por uma estrutura altamente translúcida, enquanto explantas adultas exibem uma aparência translúcida à aparência branca. Hematoxylin e eosina e as manchas de trichome de Masson confirmam uma eficiente remoção celular pela tela porosa presença.O material nuclear é reduzido em aproximadamente 99,8% após a descelularização, em comparação com tecidos não manipulados, o que é essencial para evitar desencadear uma resposta inflamatória indesejada após a implantação. A viabilidade celular dentro de andaimes sentados pode ser monitorada durante a cultura in vitro por coloração de calcein. A análise terminal da repopulação e distribuição celular em andaimes, também pode ser realizada após o processamento da parafina, conforme observado nestas imagens representativas de uma seção central de bioscafados.Assim, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na exploração das propriedades bioativas da matriz extracelular a partir de corações de camundongos fetais e adultos, mas também de outros tecidos.

Research

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