Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Авторы признательны всем членам Пинто ду Ó лаборатории для соответствующих критического обсуждения. Эта работа была поддержана програма MIT-Фонд пункт Ciência e Tecnologia (КГФ) в рамках проекта «CARDIOSTEM-инженерии сердечной ткани и основанного на стволовых клеток лечение сердечно-сосудистых приложений» (MITP-TB/ЕЭК/0013/2013). A.C.S. является получателем стипендий КГФ [SFRH/BD/88780/2012] и M.J.O. является членом КГФ (FCT-следователь 2012).

Все описанные методологии были одобрены i3S Комитета по этике животных и Direção Geral де Veterinária (DGAV) и находятся в соответствии с Европейским парламентом Директива 2010/63/ЕС.
1. Приготовление растворов decellularization
Примечание: Все decellularization решения следует фильтруют че...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

Внеклеточная матрица (ECM) является весьма динамичного и сложного сеть волокнистых и клей гликопротеинов, состоящий из водохранилища многочисленные биоактивные пептиды и зависшие факторов роста. Как основных модулятором клеточной адгезии, Цитоскелет динамики, моторики и миграцией, ра?...

Внеклеточная матрица (ECM) является динамичной сети молекул, которые регулируют важные клеточные процессы, а именно судьба решение, пролиферации и дифференцировки1,2. Исследование взаимодействий клеток ECM была проведена главным образом в двухмерный (2D) в vitro культур, покрытые компоненты ECM, которые представляют собой упрощение родной ECM, найденных в естественных условиях. Decellularization генерирует бесклеточной ECM 3D-как bioscaffolds, который во многом сохранить внеклеточного архитектуры и состава собственных тканей и органов3,4. В дополнение к качестве биоактивные подмости для тканевой инженерии, decellularized 3D ECM биоматериалов появляются как Роман платформы для оценки биологии клетки ECM параллельных в естественных условиях окружающей среды.
Оценки дифференциальной роли компонентов ECM различных тканей, органов и возраста принесет пользу с использованием аналогичных протоколов генерации родной bioscaffolds. В самом сердце мы разработали универсальный протокол для decellularization плода и взрослого, полученных образцов, в качестве альтернативного подхода для проведения сравнительных исследований орган микроокружения. С использованием этой методологии, мы захватили собственного сердца микроокружения и показал, что плода ECM способствует повышению урожайности заселение сердечной клетки5. Decellularization представлена дополнительная идентификация резидентов структурных различий между плода и взрослых ECM на уровне механизма, подвал пластинки и околоклеточного сетки матрицы и волокна состав5. До этой работы голова к голове сравнения тканей на разных этапах онтогенезе, используя тот же подход decellularization сообщалось только резус почек и сердца грызунов. Кроме того ограниченное количество исследований сообщают плода ткани/орган decellularization per se5,6,7. Это было достигнуто с помощью SDS как уникальный decellularization агент; Однако собственный SDS концентрации были использованы для decellularization плода и взрослых сердечной ткани7,8. SDS является одним из наиболее эффективных ионных моющих средств для разминирования цитоплазмы и ядерных материалов и широко используется в decellularization различных тканей и образцы9,10. Растворы, содержащие высокие концентрации SDS и длительного воздействия были связаны с денатурации белков, потеря Глюкозаминогликан (GAGs) и нарушение фибрилл коллагена10,11и поэтому необходим баланс между удаления сохранение и клеток ECM. Чтобы применить ту же процедуру для ткани сердца плода и взрослых, протокол, описанные здесь делится на три последовательных этапа: сотовый лизис по осмотическим шоком (гипотоническая буфера); солюбилизация липидов белков, ДНК белковых и белок белковых взаимодействий (0,2% SDS); и удаления ядерного материала (DNase лечение).
Наш протокол показывает несколько преимуществ: я) возможность эквивалент decellularization возрасту сердечной ткани путем применения одной и той же стратегии decellularization; II) никаких требований для специализированных методов или средств; III) готовы адаптации для других видов тканей и как она успешно применялась с небольшими изменениями в человеческой кишечника биопсий12 и мыши легких13; и, главное, iv) может адресовать ECM биомеханических свойств позволяя Ассамблея 3D-как organotypic культур, что более тесно имитировать молекулярные особенности родной ткани микроокружения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Текущий набор знаний внеклеточного матрикса (ECM)-сотовой связи переводится большой двухмерный (2D) в пробирке культуры исследования, где представлены компоненты ECM как покрытие поверхности. Эти культуры системы представляют собой упрощение сложного характера ECM, которая охватывает биохимического состава, структуры и механических свойств ткани. Чтобы лучше подражать ECM-сотовой связи, формирование сердца микроокружения, мы разработали протокол, который позволяет для decellularization сердца всего плода и ткани взрослых левого желудочка эксплантах одновременно сравнительных исследований. Протокол сочетает в себе использование гипотонический буфера, моющее средство анионное ПАВ свойств и DNase лечения без какого-либо требования для специальных навыков или оборудования. Применение той же стратегии decellularization через образцы тканей от субъектов различного возраста является альтернативный подход для проведения сравнительных исследований. Настоящий Протокол позволяет выявление уникальных структурных различий между плода и взрослых сердца ECM сетки и биологического клеточных реакций. Кроме того здесь методологии демонстрирует более широкое применение, успешно применяется в других тканях и видов с незначительными изменениями, таких как в человеческой кишечника биопсии и мыши легких.

Decellularization эффективность должна оцениваться посредством трех основных методов: макроскопический наблюдения, гистология и количественного определения ДНК. Макроскопические появление лечение пост SDS образцов косвенно влияет на эффективность удаления клеток. После ин?...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Сердца внеклеточная матрица (ECM) является сложной сети молекул, которые оркестровать ключевых процессов в органах и тканях при Несокрушимая физиологических ремоделирования на протяжении всей жизни. Стандартизированные decellularization плода и взрослых сердец позволяет сравнительные экспериментальные исследования обеих тканей в условиях 3D, захватив родной архитектуры и биомеханических свойств.

Сопоставимых Decellularization плода и взрослых сердечной ткани эксплантов как 3D-как платформы для в исследованиях in Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Этот метод может помочь решить важные вопросы в сердечно-сосудистой области о воздействии внеклеточной матрицы имеет во время различных физиологических и стадий развития сердца. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет сравнительный анализ между плода и взрослых внеклеточных матриц, применяя аналогичный метод децеллюляризации для обоих типов тканей. Таким образом, этот метод был успешно применен к другим органам, таким как хирургические ресекции от онкологических больных, облегчающих изучение внеклеточной матрицы в различных контекстах.Начните с краткого полоскания плода и взрослых мышей сердца с ледяной PBS. Затем поместите ткани под рассечение микроскопа и использовать прямые маленькие ножницы, чтобы удалить атрию, правый желудочек, и септа из сердца взрослых мышей. Перенесите левый желудочек в новую чашку Петри и разделите левую стенку свободного желудочка на двухмиллиметровые продольные полосы.Использование взрослых мыши левого желудочка explants однородного размера имеет важное значение для последовательной эффективности децеллюляризации. Используйте скальпель и зубчатый пинцет с изогнутым кончиком, чтобы удалить папиллярную мышцу перед использованием сетки размером два на два миллиметра для дальнейшего фарша полосы на более мелкие фрагменты тканей. Когда все ткани были фарш, кратко промыть куски с достаточным PBS для покрытия explants.И передать плода сердца и куски ткани сердца взрослого человека в отдельных 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, содержащие 250 микролитров оптимальной температуры резки или OCT соединения на трубку. Затем заморозить образцы сердечной ткани в сухом охлажденом льду изопентане для хранения при отрицательных 80 градусах по Цельсию. Для децеллюляризации крио-сохраненных тканей поместите замороженные образцы в чашку Петри, содержащую достаточно PBS, чтобы полностью покрыть экспланты.После того, как OCT расплавится, погрузите образцы в новую чашку Петри PBS и мыть образцы три раза на шейкере в течение 10 до 15 минут при 60 об/мин за стирку. После последней стирки добавьте один миллилитр рабочего гипотонического буфера к каждому колодец стерильной пластины культуры тканей 24-хорошо и используйте тонкие типсы, чтобы передать один фрагмент каждой хорошо. Инкубировать пластину при 25 градусах по Цельсию в течение 18 часов, при 165 об /мин, а затем три часа моет в один миллилитр PBS на колодец, за стирку.После последней стирки добавьте по миллилитр свежеприготовленного додекилового сульфата натрия или раствора SDS в каждую колодец в течение 24-часовой инкубации при 25 градусах Цельсия. На следующий день, промыть образцы с тремя 20 минут моет в один миллилитр гипотонической мыть буфера на стирку следуют добавление одного миллилитра DNase лечения раствора для каждой хорошо в течение трех часов инкубации, при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации децеллюляризованные образцы должны терять желатиновую консистенцию.Затем мыть фрагменты ткани три раза с одним миллилитром PBS в течение 20 минут за стирку с последующим ночью мыть в один миллилитр свежего PBS на хорошо при комнатной температуре и 60 об /мин. Для оценки удаления клеточных остатков из децеллюляризованной ткани, на следующее утро исправить образцы в один миллилитр свежеприготовленных 10%формула нейтрального буфера дополняется 0,03% aqueous эозин на колодец в течение 2,5 до трех часов при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть образцы в один миллилитр PBS на колодец.И использовать одноразовые виниловые формы образца инкапсулировать децеллюлярных фрагментов в гистологии обработки геля в соответствии со спецификациями производителя. Затем перенесите инкапсулированные фрагменты на биопсию, встраивая кассету. И обработать образцы парафина встраивания через последовательные 30-минутные инкубации в восходящих концентрациях этанола, изопарафинического алифатического углеводородного раствора и двух парафинов 56 градусов по Цельсию.После того, как появился второй парафин, крепление образцов в парафиновом блоке и использование микротома для получения секций толщиной три микрометра. Затем проинтрошите эффективность децеллюляризации, окрашивая секции гематоксилином и эозином и трихромными пятнами Массона в соответствии со стандартными протоколами. После ночной промывки PBS при встряхивании добавьте 500 микролитров свежеприготовленного DPBS, дополненного 2,5 микрограммами на миллилитр амфотерицина B 1%антибиотикного раствора на каждый эшафот.И хранить образцы в течение одного-семи дней при четырех градусах по Цельсию. Перед тем, как рассадить клетки, замените раствор DPBS 500 микролитров клеточной базальной среды, дополненной антибиотиками. И инкубировать леса в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.В конце инкубации используйте микроскоп, чтобы добавить четыре капли микролитров DPBS к центру одного колодец 96-хорошо пластины на эшафот. И использовать тонкие прямые пинцеты для передачи одного decellularized эшафот в верхней части каждой капли. Удалите любые дополнительные DPBS стремлением и подтвердить, что эшафот не складывается или морщинистой.Когда леса высохли по краям, медленно место одной ячейки подвески клеток интереса на верхней части каждого эшафота. Эмбриональные день 18 децеллюляризованных тканей характеризуются весьма полупрозрачной структуры в то время как взрослые экспланты проявляют полупрозрачный белый вид. Гематоксилин и эозин и трихом пятна Массона подтверждают эффективное удаление клеток наличием пористой сетки.Ядерный материал уменьшается примерно на 99,8% после децеллюляризации, по сравнению с неуманипулятивными тканями, что необходимо для предотвращения нежелательной воспалительной реакции при имплантации. Жизнеспособность клеток в сидячих лесах можно контролировать во время культуры in vitro путем окрашивания кальцина. Терминальный анализ перенаселения клеток и распределения по лесам, также может быть выполнен после обработки парафина, как это наблюдается в этих репрезентативных изображений центрального биосхемы разделе.Этот метод проложил путь для исследователей в исследовании биологически активных свойств внеклеточной матрицы сердца плода и взрослых мышей, а также других тканей.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization и Recellularization Целых Печень

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Инкапсуляция кардиомиоцитов в Фибрин Гидрогель для сердечной тканевой инженерии

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Тканевая инженерия человеческого 3D<em&gt; В пробирке</em&gt; Опухоль Тестовая система

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Новорожденных сердца Каркасы: Новые Матрицы для регенеративных исследований

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Изготовление внеклеточного матрикса, производных Пены и микроносителями как Тканеспецифическая культуре клеток и платформ доставки

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Два метода для Decellularization растительных тканей для приложений, инженерия тканей

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...