Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
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Los autores están en deuda con todos los miembros del laboratorio de Pinto-Ó relevante discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por el Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) en el proyecto "ingeniería CARDIOSTEM los tejidos cardiacos y terapias basadas en células madre para aplicaciones cardiovasculares" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. es un beneficiario de una beca FCT [SFRH/BD/88780/2012] y M.J.O. es miembro de la FCT (FCT-investigador 2012).

Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el i3S Comité de ética Animal y Direção Geral de Veterinária (DGAV) y están de acuerdo con Parlamento Europeo Directiva 2010/63/UE.
1. preparación de las soluciones de descelularización
Nota: Todos descelularización soluciones deben ser filtradas a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y almacenadas por un máximo de 3 meses, excepto se especifique lo contrario.
<ol><li>De 1 x PBS: mezclar 8 g ...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

La matriz extracelular (ECM) es una red altamente dinámica y compleja de glicoproteínas fibrosas y adhesivas, que consiste en un depósito de numerosos péptidos bioactivos y atrapado los factores de crecimiento. Como importante modulador de la adhesión celular, dinámica del citoesqueleto, movilidad y migración, proliferación, diferenciación y apoptosis, ECM regula activamente el comportamiento y función celular. Sabiendo que el comportamiento celular difiere en 2D y 3D de las culturas, se han hecho esfuerzos par...

La matriz extracelular (ECM) es una red dinámica de moléculas que regulan importantes procesos celulares, es decir, decisión de la suerte, proliferación y diferenciación de1,2. La investigación de las interacciones célula-ECM se ha realizado principalmente en dos dimensiones (2D) en vitro culturas recubierto con componentes de ECM, que constituyen una simplificación de las propiedades nativas de ECM en vivo. Descelularización genera acelular bioscaffolds de ECM como 3D que conservan en gran medida la arquitectura extracelular y composición de los tejidos nativos y órganos3,4. Además de servir como andamios bioactivos para ingeniería de tejidos, biomateriales de ECM 3D decellularized surgen como nuevas plataformas para evaluar biología celular-ECM eso paralelo el ambiente en vivo.
Evaluación de la función diferencial de los componentes de la ECM de distintos tejidos, órganos y edad se beneficiará con el uso de protocolos similares de generar bioscaffolds nativo. En el corazón, hemos desarrollado un protocolo versátil de la descelularización de muestras derivadas de adulto y fetales, como una alternativa para realizar estudios comparativos del microambiente de órgano. Utilizando esta metodología, Capturamos el microambiente cardiaco nativo y demostró que la ECM fetal promueve mayores rendimientos de la repoblación de células cardíacas5. Descelularización dispone identificación de residente diferencias estructurales entre ECM fetal y adultos a nivel de la lámina basal y pericelular arreglo de malla de matriz y fibra composición5. Antes de este trabajo, la comparación directa de los tejidos en las diferentes etapas ontogenic utilizando el mismo enfoque de descelularización se ha divulgado solamente para roedores corazones y riñones de mono rhesus. Además, un número limitado de estudios Informe tejido/órgano fetal descelularización propiamente5,6,7. Esto se ha logrado utilizando SDS como agente único descelularización; sin embargo, diferentes concentraciones de SDS se utilizaron para la descelularización de tejido cardíaco fetal y adulto7,8. SDS es uno de los detergentes iónicos más eficaces para la remoción de material citoplásmico y nuclear y ampliamente utilizado en la descelularización de diferentes tejidos y muestras de9,10. Soluciones que contienen altas concentraciones de SDS y largos períodos de exposición se han correlacionado con la desnaturalización de la proteína, pérdida de glicosaminoglicanos (GAGs) y alteración de las fibrillas de colágeno de10,11y por lo tanto un equilibrio entre preservación y celular la eliminación de ECM es necesario. Para aplicar el mismo procedimiento al tejido del corazón fetal y adulto, el protocolo descrito en este documento se divide en tres pasos secuenciales: lisis de células por choque osmótico (tampón hipotónico); solubilización de lípidos y proteínas, DNA-proteína y proteína-proteína interacciones (0.2% SDS); y remoción de material nuclear (tratamiento de DNasa).
Nuestro protocolo muestra varias ventajas: i) la posibilidad de descelularización equivalente de tejidos cardiacos específicos de la edad mediante la aplicación de la misma estrategia de descelularización; II) no hay requisitos para métodos especializados o equipos; III) listo adaptación a otros tejidos y especies como se ha aplicado con éxito con menores alteraciones en las biopsias del intestino humano12 y ratón pulmonar13; y, sobre todo, iv) puede abordar propiedades biomecánicas ECM permitiendo el montaje de las culturas organotypic de 3D como que más imitan muy de cerca las características moleculares del microambiente del tejido nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Conocimiento actual de la matriz extracelular (ECM)-comunicación celular se traduce en estudios grandes bidimensional (2D) cultivo in vitro donde se presentan componentes de ECM como una capa superficial. Estos sistemas de cultivo constituyen una simplificación de la compleja naturaleza de la ECM que abarca la composición bioquímica, estructura y propiedades mecánicas del tejido. Para imitar mejor la comunicación ECM-la célula que forma el microambiente cardiaco, hemos desarrollado un protocolo que permite la descelularización del corazón entero fetal y tejido adulto ventrículo izquierdo explantes simultáneamente para estudios comparativos. El protocolo combina el uso de un tampón hipotónico, un detergente de características de surfactante aniónico y el tratamiento de DNasa sin ningún requisito de conocimientos especializados o equipos. La aplicación de la misma estrategia de descelularización en muestras de tejido de sujetos de edad diferentes es una alternativa para realizar estudios comparativos. El presente Protocolo permite la identificación de diferencias estructurales únicas en adulto y fetales cardiaca ECM malla y biológico respuestas celulares. Además, la presente metodología muestra una aplicación más amplia siendo aplicada con éxito en otros tejidos y especies con ajustes menores, como en las biopsias del intestino humanas y en pulmón de ratón.

La eficacia de la descelularización debe evaluarse a través de tres técnicas principales: observación macroscópica, la histología y la cuantificación de ADN. El aspecto macroscópico de las muestras post-SDS de trato afecta indirectamente la eficacia de la eliminación de la célula. Después de la incubación de la SDS, las muestras deben aparecer como transparente a blanquecino (figura 1). Fetal (E18) decellularized tejidos se caracterizan por una es...

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Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

La matriz extracelular cardiaca (ECM) es una compleja red de moléculas que orquestar procesos clave en los tejidos y órganos mientras aguantando remodelación fisiológica durante toda la vida. Descelularización estandarizado del corazón fetal y adulto permite estudios experimentales comparativos de ambos tejidos en un contexto 3D mediante la captura de arquitectura original y propiedades biomecánicas.

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Este método puede ayudar a abordar preguntas importantes en el campo cardiovascular sobre el impacto que tiene la matriz extracelular durante las diferentes etapas fisiológicas y de desarrollo del corazón. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis comparativo entre matrices extracelulares fetales y adultas mediante la aplicación de un método de descelularización similar a ambos tipos de tejido. Así que este método se ha aplicado con éxito a otros órganos como resección quirúrgica de pacientes con cáncer facilitando el estudio de la matriz extracelular en diferentes contextos.Comience enjuagando brevemente los corazones de ratón fetal y adulto con PBS helado. A continuación, coloque los tejidos debajo de un microscopio de disección y use tijeras pequeñas rectas para eliminar las aurículas, el ventrículo derecho y el septo de los corazones adultos del ratón. Transfiera el ventrículo izquierdo a un nuevo plato de Petri y divida la pared libre del ventrículo izquierdo en tiras longitudinales de dos milímetros de espesor.El uso de explantes de ventrículo izquierdo de ratón adulto de un tamaño homogéneo es esencial para una eficiencia de descelularización consistente. Usa el bisturí y las pinzas serradas con punta curvada para eliminar el músculo papilar antes de usar una rejilla de dos por dos milímetros para picar aún más las tiras en fragmentos de tejido más pequeños. Cuando todo el tejido haya sido picado, enjuague brevemente las piezas con suficiente PBS para cubrir los explantes.Y transfiera los corazones fetales y los trozos de tejido cardíaco adulto a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 250 microlitros de temperatura de corte óptima o compuesto OCT por tubo. Luego, congele las muestras de tejido cardíaco en isopentano enfriado con hielo seco para almacenarlas a 80 grados Celsius negativos. Para decelularizar los tejidos crio-conservados colocar las muestras congeladas en un plato de Petri que contiene suficiente PBS para cubrir completamente los explantes.Después de que el PTU se haya derretido, sumerja las muestras en un nuevo plato Petri de PBS y lave las muestras tres veces en una coctelera durante 10 a 15 minutos a 60 RPM por lavado. Después del último lavado, agregue un mililitro de tampón hipotónico de trabajo a cada pocólite de una placa de cultivo de tejido estéril de 24 pocillos y use fórceps finos para transferir un fragmento a cada pozo. Incubar la placa a 25 grados centígrados durante 18 horas, a 165 RPM seguidas de tres lavados de una hora en un mililitro de PBS por pozo, por lavado.Después del último lavado, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio recién preparado o solución SDS a cada pozo para una incubación de 24 horas a 25 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague las muestras con tres lavados de 20 minutos en un mililitro de tampón de lavado hipotónico por lavado seguido de la adición de un mililitro de solución de tratamiento DNase a cada pozo para una incubación de tres horas, a 37 grados Centígrados. Al final de la incubación, las muestras decellularizadas deben perder su consistencia similar a la gelatina.A continuación, lave los fragmentos de tejido tres veces con un mililitro de PBS durante 20 minutos por lavado seguido de un lavado nocturno en un mililitro de PBS fresco por pozo a temperatura ambiente y 60 RPM. Para evaluar la eliminación de restos celulares del tejido descelularizado, a la mañana siguiente fijar las muestras en un mililitro de tampón neutro fórmula 10% recién preparado complementado con 0.03%de eosina acuosa por pozo para 2.5 a tres horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las muestras en un mililitro de PBS por pocero.Y utilice un molde de muestra de vinilo desechable para encapsular los fragmentos decellularizados en el gel de procesamiento histológico de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, transfiera los fragmentos encapsulados a un casete de incrustación de procesamiento de biopsia. Y procesar las muestras para la incrustación de parafina a través de sucesivas incubaciones de 30 minutos en concentraciones ascendentes de etanol, solución de hidrocarburo alifático isoparaffínico y dos 56 grados Celsius parafina emergens.Después del segundo emergente de parafina, monte las muestras en un bloque de parafina y use un microtoma para obtener secciones de tres micrómetros de espesor. A continuación, verifique la eficiencia de la descelularización manchando las secciones con hematoxilina y eosina y las manchas tricromáticas de Masson de acuerdo con los protocolos estándar. Después del lavado nocturno de PBS con agitación, añadir 500 microlitros de DPBS recién preparado, complementado con 2,5 microgramos por mililitro de anfotericina B 1% solución antibiótica a cada andamio.Y guarde las muestras de uno a siete días a cuatro grados centígrados. Antes de colocar las células, sustituya la solución DPBS por 500 microlitros de medio basal celular complementados con antibióticos. Y incubar los andamios durante una hora a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, utilice un microscopio para agregar una gota de cuatro microlitros de DPBS al centro de un pozo de una placa de 96 pocillos por andamio. Y usa pinzas rectas delgadas para transferir un andamio decellularizado a la parte superior de cada gota. Retire cualquier DPBS adicional por aspiración y confirme que el andamio no está plegado o arrugado.Cuando los andamios se hayan secado en los bordes, sienta lentamente una suspensión de una sola célula de las células de interés en la parte superior de cada andamio. Los tejidos descelularizados del día 18 embrionarios se caracterizan por una estructura altamente translúcida, mientras que los explantes adultos exhiben un aspecto translúcido a blanco. Las manchas de hematoxilina y eosina y tricomas de Masson confirman una eliminación celular eficiente por la presencia de malla porosa.El material nuclear se reduce aproximadamente un 99,8% después de la descelularización, en comparación con los tejidos no manipulados, lo que es esencial para evitar desencadenar una respuesta inflamatoria no deseada tras la implantación. La viabilidad celular dentro de los andamios sentados se puede controlar durante el cultivo in vitro mediante tinción de calceína. El análisis terminal de la repoblación celular y la distribución a través de andamios, también se puede realizar después del procesamiento de parafina como se observa en estas imágenes representativas de una sección de biosaminosos centrales.Así que esta técnica allanó el camino para los investigadores en la exploración de las propiedades bioactivas de la matriz extracelular a partir de corazones de ratón fetales y adultos, pero también de otros tejidos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

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Investigación

Bioingeniería

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La encapsulación de los cardiomiocitos en un hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos cardíacos

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Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

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Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

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