Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Författarna är skuldsatta till alla medlemmar i Pinto--Ó laboratorium för relevanta kritiska diskussion. Detta arbete stöds av Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) inom ramen för projektet ”CARDIOSTEM-Engineered hjärt vävnader och stem cell-baserade terapier för kardiovaskulära applikationer” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. är en mottagare av ett FCT-stipendium [SFRH/BD/88780/2012] och M.J.O. är en FCT Karl (FCT-utredare 2012).

Alla de metoder som beskrivs godkändes av den i3S djur etikkommittén och Direção Geral de Veterinária (DGAV) och är i enlighet med det europeiska parlamentet direktiv 2010/63/EU.
1. beredning av decellularization lösningar
Obs: Alla decellularization lösningar bör filtreras genom ett 0,22 μm membranfilter och lagras i högst 3 månader, utom annat specificeras.
<ol><li>För 1 x PBS: blanda 8 g NaCl, 1,01 g av Na2HPO4 200 mg kaliumkl...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

Den extracellulära Matrixen (ECM) är en mycket dynamisk och komplex meshwork av fibrösa och självhäftande glykoproteiner, bestående av en reservoar av många bioaktiva peptider och anhållna tillväxtfaktorer. Som den stora modulatorn celladhesion, cytoskelettet dynamics, motilitet/migration, proliferation, differentiering och apoptos reglerar ECM aktivt cellulär funktion och beteende. Att veta att cellulära beteendet skiljer sig i 2D och 3D kulturer, har förekommit insatser för att utveckla nya organotypic mod...

Den extracellulära Matrixen (ECM) är ett dynamiskt nätverk av molekyler som reglerar viktiga cellulära processer, nämligen öde-beslut, proliferation och differentiering1,2. Utredningen av cell-ECM interaktioner har utförts främst i tvådimensionell (2D) i vitro kulturer belagd med ECM komponenter, som utgör en förenkling av infödda ECM boenden i vivo. Decellularization genererar acellulärt 3D-liknande ECM bioscaffolds som i stor utsträckning bevarar extracellulära arkitektur och sammansättningen av infödda vävnader och organ3,4. Förutom att tjäna som bioaktiva ställningar för vävnadsteknik, framträder cell-lösa 3D ECM biomaterial som romanen plattformar att bedöma cell-ECM biologi att parallell Invivo miljön.
Bedömning av ECM komponenter i olika vävnader, organ och ålder differentiell roll kommer att gynna med användning av liknande protokoll generera infödda bioscaffolds. I hjärtat, har vi utvecklat en mångsidig protokoll för decellularization av fetal och vuxen-derived prover, som ett alternativ att utföra jämförande studier av den orgel mikromiljö. Användningen av denna metod, vi fångas den infödda hjärt närmiljön och visade att fostrets ECM främjar högre återinsättning avkastning av hjärtats celler5. Decellularization föreskrivs ytterligare identifiering av bosatta strukturella skillnader mellan foster och vuxen ECM i nivå med källaren lamina och pericellulär matrix mesh arrangemang och fiber sammansättning5. Före detta arbete, har head-to-head jämförelse av vävnader i olika ontogenic skeden med samma decellularization synsätt endast rapporterats för Rhesusapa njurar och gnagare hjärtan. Ett begränsat antal studier uppger dessutom fostrets vävnad/organ decellularization i sig.5,6,7. Detta har uppnåtts med SDS som en unik decellularization agent; dock användes distinkta SDS koncentrationer för decellularization av fetal och vuxen hjärtvävnad7,8. SDS är en av de mest effektiva joniskt rengöringsmedel för clearance av cytoplasmisk och nukleära material och används allmänt i decellularization av olika vävnader och exemplar9,10. Lösningar som innehåller hög koncentration av SDS och längre perioder av exponering har korrelerats med protein denaturering, glykosaminoglykan (gag) förlust och störningar av kollagen fibriller10,11, och därför en balans mellan bevarande och cell borttagning av ECM är nödvändig. Tillämpa samma förfarande på fostrets och vuxen hjärta vävnad genom det protokoll som beskrivs häri är uppdelad i tre sekventiella steg: cell lysis av osmotiska chock (hypotoniska buffert); lösbarhet av lipid-protein, DNA-protein och protein-protein interaktioner (0,2% SDS); och kärnkraft materialförlust (DNAS behandling).
Våra protokoll visar flera fördelar: jag) möjligheten att motsvarande decellularization av Åldersspecifik hjärt vävnader genom tillämpning av samma decellularization strategi; (II) inga krav på specialiserade metoder eller utrustning; (III) redo anpassning till andra vävnader och arter som det har tillämpats framgångsrikt med mindre ändringar i mänskliga tarmen biopsier12 och mus lung13; och, ännu viktigare, iv) kan adressera ECM biomekaniska egenskaper samtidigt som man möjliggör montering av 3D-liknande organotypic kulturer att mer noga härma molekylär funktioner i den infödda vävnad mikromiljö.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Nuvarande kunskaper om extracellulär matrix (ECM)-cellkommunikation översätts till stora tvådimensionell (2D) in vitro-kulturstudier där ECM komponenter presenteras som en ytbeläggning. Dessa kultur-system utgör en förenkling av den komplicerade karaktären av vävnad ECM som omfattar biokemiska sammansättning, struktur och mekaniska egenskaper. För att bättre efterlikna den ECM-cell kommunikation forma den kardiella mikromiljö, utvecklade vi ett protokoll som möjliggör decellularization hela fostrets hjärta och vuxen vänster kammare vävnad explants samtidigt för jämförande studier. Protokollet kombinerar användandet av en hypoton buffert, ett tvättmedel av anjoniska ytaktiva egenskaper och DNAS behandling utan några krav för specialiserad kompetens eller utrustning. Tillämpningen av samma decellularization strategi över vävnadsprover från försökspersoner i olika ålder är en alternativ metod att utföra jämförande studier. Detta protokoll möjliggör identifiering av unika strukturella skillnader över fostrets och vuxen hjärt ECM mesh och biologiska cellulära svar. Dessutom den häri metodik visar ett bredare program tillämpas framgångsrikt i andra vävnader och arter med smärre justeringar, såsom i mänskliga tarmen biopsier och mus lungor.

Decellularization effektivitet bör bedömas genom tre huvudsakliga tekniker: makroskopiska observationer, histologi och DNA kvantifiering. Det makroskopiska utseendet prover post-SDS behandling påverkar indirekt effekten av cell borttagning. Efter SDS inkubation, ska prover visas som halvgenomskinliga till vitaktig (figur 1 c). Fetalt (E18) cell-lösa vävnader kännetecknas av ett högt genomskinligt struktur medan vuxna bladsticklingar har en halvgenomski...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Den kardiella extracellulär Matrixen (ECM) är ett komplext nätverk av molekyler som dirigera nyckelprocesser i vävnader och organ medan bestående fysiologiska remodeling under hela livet. Standardiserade decellularization av fostrets och vuxna hjärtan tillåter jämförande experimentella studier av båda vävnader i ett 3D sammanhang genom att fånga inhemska arkitekturen och biomekaniska egenskaper.

Jämförbara Decellularization av Fetal och vuxen hjärtvävnad bladsticklingar som 3D-liknande plattformar för i studier

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Denna metod kan hjälpa till att ta itu med viktiga frågor inom det kardiovaskulära området om den inverkan den extracellulära matrisen har under olika fysiologiska och utvecklingsstadier av hjärtat. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter en jämförande analys mellan fetala och vuxna extracellulära matriser genom att tillämpa en liknande decellularisering metod för att båda typerna av vävnad. Så denna metod har varit framgångsrik tillämpas på andra organ såsom kirurgiska samband från cancerpatienter underlätta studiet av den extracellulära matrisen i olika sammanhang.Börja med att kort skölja fostrets och vuxna mushjärtan med iskalla PBS. Placera sedan vävnaderna under ett dissekerande mikroskop och använd raka små saxar för att ta bort atria, höger kammare och septan från de vuxna mushjärtan. Överför den vänstra ventrikeln till en ny Petriskål och dela den vänstra ventrikelfri vägg i två millimeter tjocka längsgående remsor.Användningen av vuxna mus vänster ventrikel explants av en homogen storlek är avgörande för en konsekvent decellularization effektivitet. Använd skalpell och tandade pincett med böjd spets för att ta bort papillära muskeln innan du använder en två med två millimeter rutnät för att ytterligare finhacka remsorna i mindre vävnad fragment. När all vävnad har finhackats, skölj kortfattat bitarna med tillräckligt med PBS för att täcka explants.Och överföra fostrets hjärtan och bitar av vuxna hjärtvävnad i enskilda 1,5 milliliter mikrocentrifugrör som innehåller 250 mikroliter av optimal skärtemperatur eller OCT förening per rör. Sedan frysa hjärt vävnadsprover i torriskyld isopentan för lagring vid negativa 80 grader Celsius. För att decellularisera de kryobevarande vävnaderna placera de frysta proverna i en petriskål som innehåller tillräckligt med PBS för att helt täcka explanterna.När OCT har smält, dränka proverna i en ny petriskål av PBS och tvätta proverna tre gånger på en shaker i 10 till 15 minuter vid 60 RPM per tvätt. Efter den sista tvätten, tillsätt en milliliter av arbetande hypotonisk buffert till varje brunn av en steril 24-brunn vävnad kultur tallrik och använda fina tänjningar för att överföra ett fragment till varje brunn. Inkubera plattan vid 25 grader Celsius i 18 timmar, vid 165 RPM följt av tre entimmetvättar i en milliliter PBS per brunn, per tvätt.Efter den sista tvätten, tillsätt en milliliter nyberedda natrium dodecyl sulfat eller SDS-lösning till varje brunn för en 24-timmars inkubation vid 25 grader Celsius. Nästa dag, skölj proverna med tre 20 minuters tvättar i en milliliter av hypotonisk tvätt buffert per tvätt följt av tillsats av en milliliter DNase behandlingslösning till varje brunn för en tre timmars inkubation, vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen bör de decellulariserade proverna förlora sin gelatinliknande konsistens.Tvätta sedan vävnadsfragmenten tre gånger med en milliliter PBS i 20 minuter per tvätt följt av en tvätt över natten i en milliliter färsk PBS per brunn vid rumstemperatur och 60 RPM. För att bedöma avlägsnandet av cellulära rester från decellularized vävnaden, nästa morgon fastställa proverna i en milliliter av nyberedda 10%formel neutral buffert kompletteras med 0,03%av vattenhaltigt eosin per brunn för 2,5 till tre timmar vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta proverna i en milliliter PBS per brunn.Och använda en disponibel vinyl exemplar mögel att kapsla in de decellularized fragment i histologi bearbetning gel enligt tillverkarens specifikationer. Därefter överför de inkapslade fragmenten till en biopsibearbetningsinbäddningskassett. Och bearbeta proverna för paraffin inbäddning genom successiva 30-minuters inkubationer i stigande koncentrationer av etanol, isoparaffinisk alifatisk kolvätelösning och två 56 grader Celsius paraffin emergens.Efter den andra paraffin emergent, montera prover i ett paraffinblock och använda en mikrotom för att erhålla tre-mikrometer tjocka sektioner. Verifiera sedan decellulariseringseffektiviteten genom att färga in sektionerna med haematoxylin och eosin och Massons trichromfläckar enligt standardprotokoll. Efter natten PBS tvätta med skakningar, tillsätt 500 mikroliter av nyberedda DPBS, kompletteras med 2,5 mikrogram per milliliter amphotericin B 1%antibiotika lösning till varje byggnadsställning.Och förvara proverna i en till sju dagar vid fyra grader Celsius. Innan sittplatser cellerna, ersätta DPBS lösning med 500 mikroliter av cell basalt medium kompletteras med antibiotika. Och inkubera byggnadsställningarna i en timme vid 37 grader Celsius.I slutet av inkubationen, använd ett mikroskop för att lägga till en fyra mikroliter droppe DPBS till mitten av en brunn av en 96-brunns platta per byggnadsställning. Och använd tunna raka pincett för att överföra en decellulariserad byggnadsställning till toppen av varje droppe. Ta bort eventuella extra DPBS genom aspiration och bekräfta att ställningen inte är vikt eller skrynklig.När byggnadsställningarna har torkat i kanterna, långsamt sitta en enda cell suspension av cellerna av intresse på toppen av varje byggnadsställning. Embryonala dag 18 decellularized vävnader kännetecknas av en mycket genomskinlig struktur medan vuxna explants uppvisar en genomskinlig till vitt utseende. Hematoxylin och eosin och Massons trichome fläckar bekräftar en effektiv cellborttagning genom närvaron porösa mesh.Kärnämnet reduceras med cirka 99,8%efter decellularisering, jämfört med icke-manipulerade vävnader vilket är avgörande för att undvika att utlösa ett oönskat inflammatoriskt svar vid implantation. Cellens livskraft inom sittande ställningar kan övervakas under in vitro-kulturen genom kalceinfärgning. Terminal analys av cellen återbefolkning och fördelning över ställningar, kan också utföras efter paraffin bearbetning som observerats i dessa representativa bilder av en central bioscaffold avsnitt.Så denna teknik banade väg för forskare i utforskning av de bioaktiva egenskaperna hos den extracellulära matrisen från fetala och vuxna mus hjärtan men också av andra vävnader.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization och Recellularization av Whole Lever

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapsling av Cardiomyocytes i en Fibrin Hydrogel för hjärtvävnad Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillärkraften Litografi för Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering av en Human 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumör Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal Cardiac Ställningar: Nya Matriser för regenerativ studier

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Tillverkning av extracellulär matrix-härledda Skum och Mikrobärare som Vävnadsspecifik Cellodling och Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Två metoder för Decellularization av växt vävnader för Tissue Engineering program

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...