Name: comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Yazarlar tüm üyelerine Pinto--Ó laboratuvar ilgili kritik tartışma için borçlu bulunmaktadır. Bu eser Programa MIT-Fundação para Ciência e teknoloji (FCT) "CARDIOSTEM-mühendislik kalp doku ve kök hücre tabanlı terapiler kardiyovasküler uygulamalar için" projesi kapsamında tarafından desteklenmiştir (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. FCT dostluk [SFRH/BD/88780/2012] bir alıcı ve M.J.O. bir FCT adam (FCT-araştırmacı 2012).

Açıklanan yöntemleri i3S hayvan Etik Komitesi ve Direção Geral de tarafından onaylanmış Veterinária (DGAV) ve are uygun olarak Avrupa Parlamentosu yönergesi 2010/63/AB.
1. decellularization çözümleri hazırlanması
Not: çözümleri 0,22 mikron membran filtre ile filtre ve dışında en fazla 3 ay için depolanan tüm decellularization aksi belirtilmediği.
<ol><li>1 x PBS için: 8 gram NaCl, 1,01 g Na2HPO4 KCl, 200 mg Mix ve KH<...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+a+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Organ+Tissue+Engineering:+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds.">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult.">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li><li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering.">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).</li><li>Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+developmental+age+cardiac+extracellular+matrix+promotes+the+expansion+of+neonatal+cardiomyocytes+in+vitro.">Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).</li><li>Fong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li><li>Tapias, L. F., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+scaffolds+as+a+platform+for+bioengineered+organs.">Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Pinto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+colorectal+cancer+matrices+polarize+macrophages+towards+an+anti-inflammatory+phenotype+promoting+cancer+cell+invasion+via+CCL18.">Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18.</a> Biomaterials. 124, 211-224 (2017).</li><li>Garlikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+close-to-native+in+vitro+system+to+study+lung+cells-ECM+crosstalk.">Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk.</a> Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).</li><li>Wong, M. L., Griffiths, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+in+xenogeneic+scaffold+generation:+Antigen+removal+vs.+decellularization.">Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).</li><li>Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+state+of+aggregation+on+the+specific+acid-catalyzed+hydrolysis+of+sodium+dodecyl+sulfate.">The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate.</a> J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).</li><li>Rahman, A., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+the+critical+micelle+concentration+of+sodium+dodecyl+sulphate.">Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate.</a> J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).</li><li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction.">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Whitby, D. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+of+lip+wounds+in+fetal,+neonatal+and+adult+mice.">The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice.</a> Development. 112 (2), 651-668 (1991).</li><li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells.">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li><li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin.">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li></ol>

Hücre dışı Matriks (ECM) çok sayıda biyoaktif peptidler ve sıkışmışlık büyüme faktörleri bir rezervuar oluşan lifli ve yapışkanlı glikoproteinlerin, son derece dinamik ve karmaşık bir meshwork var. Büyük modülatör hücre adezyon, sitoiskeleti dynamics, hareketliliği/geçiş, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve Apoptozis ECM aktif olarak hücresel fonksiyon ve davranış düzenlemektedir. Hücresel davranış 2D ve 3D kültürlerde farklı olduğunu bilmek, doğru bir şek...

Hücre dışı Matriks (ECM) önemli hücresel süreçler, yani kader-karar, yayılmasını önleme ve farklılaşma1,2düzenleyen molekülleri dinamik bir ağdır. Hücre-ECM etkileşimlerin incelenmesi esas olarak iki boyutlu (2D) in vitro kültürlerde ECM bileşenleri ile kaplı, hangi vivo içindebulunan yerel ECM özellikleri basitleştirilmesi teşkil yapıldı. Decellularization büyük ölçüde hücre dışı mimarisi ve kompozisyon yerel doku ve organları3,4korumak acellular 3D benzeri ECM bioscaffolds oluşturur. Doku Mühendisliği için biyoaktif iskele olarak görev ek olarak, decellularized 3D ECM Biyomalzeme roman platformlar hücre-ECM Biyoloji değerlendirmek için o paralel içinde vivo ortamda ortaya çıkıyor.
ECM bileşenleri farklı dokular, organlar ve yaş fark rolünün değerlendirilmesi ile yerel bioscaffolds üretme benzer iletişim kurallarının kullanımını yararlanacaktır. Kalbinden, decellularization örnekleri, fetal ve yetişkin türetilmiş için çok yönlü bir iletişim kuralı organ microenvironment, karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, biz yerel kardiyak microenvironment yakalanan ve fetal ECM kalp hücreleri5yüksek repopulation verimi teşvik gösterdi. Decellularization daha fazla lif kompozisyon5arasında fetal ve yetişkin ECM Bodrum lamina ve pericellular matris kafes düzenlemenin düzeyinde ikamet yapısal farklılıklar tanımlaması sağlanmıştır. Önce bu çalışmaları, aynı decellularization yaklaşımı kullanarak farklı ontogenic aşamalarında dokuların kafa kafaya karşılaştırma yalnızca al yanaklı maymun böbrekler ve kemirgen kalpler için bildirilmiştir. Buna ek olarak, sınırlı sayıda çalışmalar fetal doku/organ decellularization başına5,6,7rapor. Bu SDS benzersiz decellularization Aracısı olarak kullanarak elde edilmiştir; Ancak, farklı SDS konsantrasyonları fetal ve yetişkin kalp dokusu7,8decellularization için kullanıldı. SDS en etkili iyonik deterjanlar için izni sitoplazmik ve nükleer malzeme biridir ve yaygın olarak kullanılan farklı doku ve numuneler9,10decellularization içinde. Yüksek SDS konsantrasyonları ve uzun süreli maruz kalma içeren çözümler proteini denatürasyon, glikozaminoglikan (gag) kaybı ve kollajen liflerinde10,11, bozulma ile ilişkili ve bu nedenle bir ECM korunması ve hücre kaldırma arasında denge gereklidir. Fetal ve yetişkin kalp dokusu ile aynı yordamı uygulamak için burada açıklanan protokol üç sıralı adımları ayrılmıştır: hücre lizis ozmotik şok (Hipotonik arabellek); solubilization lipid-protein, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerinin (% 0,2 SDS); ve nükleer malzeme kaldırma (Dnaz tedavisi).
Bizim iletişim kuralı birkaç avantajları gösterir: Ben) aynı decellularization strateji; uygulama tarafından yaş özgü kardiyak dokuların eşdeğer decellularization olasılığı II) özel yöntemler veya ekipman gereksinim yoktur; III) diğer doku ve tür olarak bu hazır adaptasyon ile insan bağırsak biyopsisi12 ve fare akciğer13' te küçük değişiklikler başarıyla uygulandı; ve önemlisi, IV) ECM biyomekanik özellikleri 3D benzeri organotypic kültürleri daha yakından yerel doku microenvironment moleküler özelliklerini taklit Meclisi etkinleştirilirken adresleyebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Benchtop Shaker</td>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>IKA:3510001</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weight scale</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge (4&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer (-80&#186;C)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cirurgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>5000-08</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-30</td>
			<td>Recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, straight</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, serrated, curved</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tool available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, individually wrapped</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-078</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GV, 0.22&#181;m, PVDF, Radio-Sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Material available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430791</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430829</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>70075-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryomatrix embedding resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258-1L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH Prolabo</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-31264</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100g</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8041-1KG</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBASE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-4390</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05833.1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>AplliChem</td>
			<td>A3778,0050</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % formalin neutral buffer</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>361387P</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y AQUEOUS</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>01592E</td>
			<td>Can be replaced by alcoholic eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous</td>
			<td>Aga</td>
			<td>4,006,02,02,00</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (DI water)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Rite 3</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>6915</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Histoplast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RAS.6774006</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen&#160;dsDNA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-434</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Labclinics</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media of the cell of interest</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3d-like platforms for in vitro studies

Geçerli hücre dışı Matriks (ECM) bilgisine-hücre iletişim çevirir büyük iki boyutlu (2D) tüp bebek kültür çalışmaları nerede ECM bileşenleri bir yüzey kaplama olarak sunulmaktadır. Bu kültür sistemleri biyokimyasal bileşimi, yapısı ve mekanik özellikleri kapsar ECM dokusunun karmaşık yapısı basitleştirilmesi oluşturmaktadır. Bütün fetal kalp decellularization için sağlayan bir protokol geliştirdiğimiz kardiyak microenvironment şekillendirme ECM-hücre iletişim daha iyi taklit etmek için ve yetişkin sol ventrikül doku aynı anda için karşılaştırmalı çalışmalar explants. Protokol Hipotonik bir arabellek, bir deterjan Anyonik yüzey aktif özellikleri ve Dnaz tedavi herhangi bir gereksinim olmadan kullanmak özel beceri ya da ekipman için birleştirir. Doku örnekleri arasında aynı decellularization stratejisi uygulamadan konularda çeşitli yaş karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşımdır. Mevcut iletişim kuralı benzersiz yapısal farklılıkları tanımlaması fetal ve yetişkin kalp ECM mesh ve biyolojik hücresel yanıt izin verir. Ayrıca, burada daha geniş bir uygulama başarıyla diğer dokulara ve küçük ayarlamalar, bu türe gibi insan bağırsak biyopsisi ve fare akciğer uygulanan metodoloji gösterir.

Decellularization verimliliği üç ana teknikleri sayesinde tespit edilebilir: makroskopik gözlem, Histoloji ve DNA miktar. Örnekleri yazı-SDS tedavi makroskopik görünümünü hücre kaldırma etkinliğini dolaylı olarak etkiler. SDS kuluçka sonra örnekleri beyazımsı (şekil 1 c) saydam görüntülenmesi gerekir. Fetal (E18) Yetişkin explants bir yarı saydam beyaz görünüşüyle varken decellularized doku tarafından son derece şeffaf bir yap?...

Watch this Scientific Journal Video about Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies at JoVE.com

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Kardiyak hücre dışı Matriks (ECM) anahtar süreçlerinde doku ve organların fizyolojik hayatı boyunca remodeling kalıcı süre alacak moleküllerinin karmaşık bir ağdır. Fetal ve yetişkin kalplerin standart decellularization 3D bir bağlamda yerel mimari ve biyomekanik özellikleri yakalayarak karşılaştırmalı deneysel çalışmalar hem dokuların izin verir.

Vitro çalışmalar için 3D benzeri platformlar olarak Fetal ve yetişkin kalp doku karşılaştırılabilir Decellularization Explants

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Bu yöntem, kalbin farklı fizyolojik ve gelişimsel aşamalarında hücre dışı matriksin etkisi hakkında kardiyovasküler alandaki önemli soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, her iki doku tipine de benzer bir hücre dışılaştırma yöntemi uygulayarak fetal ve erişkin hücre dışı matrisler arasında karşılaştırmalı bir analize olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, kanser hastalarının cerrahi rezeksiyonları gibi diğer organlara da uygulandı ve hücre dışı matrisin farklı bağlamlarda incelenmesini kolaylaştırdı.Cenin ve yetişkin fare kalplerini buz gibi PBS ile kısa bir süre durulayarak başlayın. Sonra bir diseksiyon mikroskop altında dokuları yerleştirin ve yetişkin fare kalplerinden atria, sağ ventrikül ve septa kaldırmak için düz küçük makas kullanın. Sol ventrikülü yeni bir Petri kabına aktarın ve sol ventrikülsüz duvarı iki milimetre kalınlığında uzunlamasına şeritlere bölün.Homojen boyutta yetişkin fare sol ventrikül explants kullanımı tutarlı bir decellularization verimlilik için gereklidir. Daha küçük doku parçaları içine şeritler kıyma için iki tarafından iki milimetre ızgara kullanmadan önce papiller kas kaldırmak için kavisli ucu ile neşter ve tırtıklı cımbız kullanın. Tüm doku doğrlandığında, kısaca ekspertiyi kapsayacak kadar PBS ile parçaları durulayın.Ve fetal kalpleri ve yetişkin kalp dokusu parçalarını, tüp başına 250 mikrolitre optimum kesme sıcaklığı veya OCT bileşiği içeren tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın. Daha sonra, negatif 80 santigrat derece depolama için kuru buz soğutulmuş isopentane kardiyak doku örnekleri dondurun. Kriyo-korunmuş dokular hücreyi decellularize etmek için tamamen ekspertize etmek için yeterli PBS içeren bir Petri kabına dondurulmuş örnekleri yerleştirin.OCT eridikten sonra, numuneleri pbs'in yeni bir Petri kabına batırın ve numuneleri yıkama başına 60 RPM'de 10 ila 15 dakika çalkalayıcıüzerinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, steril 24 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyuya bir mililitre çalışan hipotonik tampon ekleyin ve her kuyuya bir parça aktarmak için ince çalgılar kullanın. Plakayı 18 saat boyunca 25 derecede, 165 RPM'de ve ardından yıkama başına bir mililitre PBS'de bir saatlik yıkama yla inkübe edin.Son yıkamadan sonra, 25 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için her kuyuya bir mililitre taze hazırlanmış sodyum dodecyl sülfat veya SDS çözeltisi ekleyin. Ertesi gün, üç saatlik kuluçka için her kuyuya bir mililitre DNase tedavi çözeltisi eklenmesini takip eden bir mililitre hipotonik yıkama tamponu içinde üç adet 20 dakikalık yıkama ile numuneleri 37 santigrat derece ile durulayın. Kuluçka sonunda, hücreden arındırılmış örnekler jelatin benzeri tutarlılıklarını kaybetmelidir.Daha sonra doku parçalarını bir mililitre PBS ile yıkama başına 20 dakika yıkayın ve ardından oda sıcaklığında ve 60 RPM'de bir mililitre taze PBS'de bir geceyıkama. Hücreli dokudan hücresel kalıntıların çıkarılmasını değerlendirmek için, ertesi sabah taze hazırlanmış bir mililitre örnekleri düzeltmek 10%formül nötr tampon oda sıcaklığında 2,5 ila üç saat boyunca iyi başına sulu eozin% 0.03 ile takviye. Kuluçka sonunda, iyi başına PBS bir mililitre örnekleri yıkayın.Ve üreticinin özelliklerine göre histoloji işleme jel decellularized parçaları kapsüllemek için tek kullanımlık vinil örnek kalıp kullanın. Daha sonra, kapsüllenmiş parçaları biyopsi işleme katıştırma kasetine aktarın. Ve etanol, izoparafinik alifatik hidrokarbon çözeltisi ve iki 56 santigrat derece parafin ortaya çıkan artan konsantrasyonlarda art arda 30 dakikalık kuluçka yoluyla parafin gömme örnekleri işlemek.İkinci parafin ortaya çıktıktan sonra, numuneleri bir parafin bloğuna monte edin ve üç mikrometre kalınlığında kesitler elde etmek için bir mikrotom kullanın. Daha sonra hematoksilin ve eozin ve Masson'un trikrom lekelerini standart protokollere göre boyandırarak hücre dışılaştırma verimliliğini doğrulayın. Sallayarak bir gecede PBS yıkayın sonra, taze hazırlanmış DPBS 500 mikrolitre ekleyin, her iskele için amphotericin B 1% antibiyotik çözeltimililitre başına 2.5 mikrogram ile desteklenmektedir.Ve örnekleri 1-7 gün boyunca dört santigrat derecede saklayın. Hücreleri oturmadan önce, antibiyotiklerle birlikte 500 mikrolitre hücre bazal orta ile DPBS çözeltisini değiştirin. Ve iskeleleri 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, iskele başına 96 kuyuluk bir kuyunun ortasına dört mikrolitrelik DPBS damlası eklemek için bir mikroskop kullanın. Ve her damla üstüne bir hücresiz iskele aktarmak için ince düz cımbız kullanın. Aspirasyon la herhangi bir ekstra DPBS çıkarın ve iskele katlanmış veya kırışık olmadığını onaylayın.İskeleler kenarlarında kuruduktan sonra, her iskelenin üstüne ilgi çeken hücrelerin tek bir hücre süspansiyonuna yavaşça oturun. Embriyonik gün 18 hücreli dokular yüksek yarı saydam bir yapı ile karakterize iken yetişkin ekstatlar beyaz görünüm enine bir yarı saydam sergilerler. Hematoksilin ve eozin ve Masson's trichome lekeleri varlığı gözenekli mesh tarafından etkili bir hücre kaldırma onaylamak.Nükleer madde, hücreleşmeden sonra yaklaşık %99.8 oranında azalır, implantasyon üzerine istenmeyen inflamatuar yanıtı tetiklemekten kaçınmak için gerekli olan manipüle edilmemiş dokulara göre. Oturan iskeleler içinde hücre canlılığı kalsedin boyama ile in-vitro kültür sırasında izlenebilir. Hücre popülasyonunun ve iskeleler arasında dağılımının terminal analizi, merkezi bir biyoiskele bölümünün bu temsili görüntülerinde görüldüğü gibi parafin işleme sonrasında da yapılabilir.Bu teknik, fetal ve yetişkin fare kalplerinden hücre dışı matrisin biyoaktif özelliklerinin araştırılmasında araştırmacıların yanı, aynı zamanda diğer dokuların da önünü açtı.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

İnsan 3D Doku Mühendisliği<em&gt; In vitro</em&gt; Tümör Test Sistemi

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...