Reconstituição é o processo de restauração de uma biomolécula isolada à sua forma ou funcionalidade original. Essa abordagem é frequentemente utilizada no estudo de proteínas de membrana, que permitem muitos processos celulares importantes e afetam o comportamento dos lipídios vizinhos. No entanto, a complexidade do ambiente celular torna as funções da proteína da membrana difíceis de estudar in situ. As proteínas podem ser extraídas e purificadas, mas suas funções reais não podem ser avaliadas sem uma membrana. Portanto, proteínas isoladas de membrana são reconstituídas pela integração em uma membrana lipídica artificial, como um lipossomo. Este vídeo introduzirá os princípios da reconstituição da proteína da membrana, um procedimento geral de reconstituição e algumas aplicações na bioquímica.

As membranas celulares consistem principalmente em fosfolipídios e proteínas de membrana. Os fosfolipídios formam uma bicamada na qual as cabeças de fosfato hidrofílico interagem com o interior aquoso e exterior da célula, enquanto as caudas de ácido graxo hidrofóbico interagem entre si na bicamada.

Algumas proteínas de membrana só interagem com a membrana por interações eletrostáticas ou não covalentes. Outros, chamados de "proteínas integrais", estão incorporados na bicamadas lipídica.

Assim como a bicamadas, as proteínas integrais têm extremidades hidrofílicas e um centro hidrofóbico, e são mantidas no lugar por interações hidrofóbicas. Proteínas integrais que abrangem toda a membrana são conhecidas como "proteínas transmembranas".

As interações entre essas proteínas e a membrana são tão fortes que mesmo a lise das células não as separará. Um surfactante especial chamado detergente é usado para extrair as proteínas. Semelhante aos fosfolipídios, os detergentes têm cabeças hidrofílicas e caudas lipofílicas, e podem entrar na membrana livremente.

Dentro da membrana, as caudas lipofílicas do detergente interagem com o núcleo de proteína hidrofóbica. Isso envolve a proteína com uma casca das cabeças de detergente hidrofílico, o que interrompe as interações proteína-lipídicas.

O complexo de detergente proteico é agora facilmente separado da membrana. O detergente torna o complexo solúvel em soluções aquosas, e pronto para a reconstituição em uma membrana artificial.

Proteínas são frequentemente reconstituídas nas membranas dos lipossomos, que são vesículas artificiais. Para preparar lipossomos, os lipídios secos são hidratados e agitados para induzir a formação de vesículas. Quando um detergente é adicionado, ele é incorporado nas membranas liposso.

Para reconstituir a proteína, as proteínas solubilizadas e lipossomos são combinados, e então o detergente é removido da solução por diálise ou adsorção química. As proteínas e lipossomos rapidamente se reúnem em proteoliposomes, de modo que apenas os grupos hidrofílicos são expostos. As proteínas então funcionam como em uma membrana celular, e podem ser investigadas isoladamente.

Agora que cobrimos o básico da reconstituição de proteínas, vamos passar por cima de um protocolo para reconstituir proteínas de membrana em lipossomos.

Para começar a isolar as proteínas da membrana, as células são lísedas. Células ininterruptas são removidas com centrifugação.

O supernante é centrifugado a uma velocidade mais alta para pelotar as membranas. A pelota é re-suspensa e um detergente é adicionado para extrair as proteínas.

Os detritos restantes das células são removidos por centrifugação adicional. A proteína é purificada do supernaspeico com cromatografia de coluna e, em seguida, concentrada ou purificada ainda mais conforme necessário.

Para começar a preparar os lipossomos, uma suspensão de fosfolipídios em solvente orgânico é seca sob nitrogênio ou argônio.

Os fosfolipídios são hidratados com tampão de hidratação, e a mistura é sônica para terminar de criar os lipossomos.

O detergente é adicionado para solubilizar os lipossomos, que é então combinado com as proteínas.

O detergente é então removido por adsorção em contas de poliestireno, diálise ou uma coluna de ligação de detergente. Os proteolipósmos resultantes estão prontos para serem purificados e usados em experimentos subsequentes.

Agora que você está familiarizado com o básico de um procedimento de reconstituição de proteínas de membrana, vamos olhar para algumas aplicações de reconstituição de proteínas na bioquímica.

Uma proteína de transporte de membrana foi reconstituída para obter uma compreensão mais clara de seu mecanismo de transporte. Sua função pós-reconstituição foi verificada com um efflux de íons iodetos. Em seguida, a atividade de transporte foi estudada na presença de vários inibidores e potencializadores de canais de íons de moléculas pequenas. Dessa forma, as interações diretas dessas pequenas moléculas com a proteína de transporte poderiam ser estudadas.

Proteínas de membrana de ligação de clorofila e carotenoides nas plantas colhem luz, promovem a separação da carga e mitigam danos leves. Ao reconstituir essas proteínas de colheita de luz, sua dinâmica dobrável e interação com pigmentos podem ser estudadas. As proteínas de colheita leve reconstituídas com esta técnica tinham propriedades ópticas muito semelhantes às proteínas nativas. A espectroscopia de emissão de fluorescência pode então ser usada para estudar a transferência de energia de pigmentos para as proteínas reconstituídas de colheita de luz.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre a reconstituição de proteínas de membrana. A reconstituição é uma maneira de transferir proteínas importantes para uma imitação celular para uma investigação mais aprofundada. Este vídeo abordou os princípios da reconstituição de proteínas, um protocolo de reconstituição e algumas aplicações em bioquímica. Obrigado por assistir!