Name: characterization of tumor cells using a medical wire for capturing circulating tumor cells: a 3d approach based on immunofluorescence and dna fish
Uploaded: 2017-12-21T15:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH at JoVE.com

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+different+methods+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+in+mice+with+lung+metastasis.">Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis.</a> Oncol. Rep. , 1-8 (2017).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).</li><li>Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+significance+of+circulating+tumor+cells+in+cancer.">Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).</li><li>Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTC+enumeration+and+characterization:+moving+toward+personalized+medicine.">CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine.</a> Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).</li><li>Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell+lung+cancer+patients:+a+meta-analysis.">Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis.</a> PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).</li><li>Maemondo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gefitinib+or+Chemotherapy+for+Non?Small-Cell+Lung+Cancer+with+Mutated+EGFR.">Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR.</a> N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+versus+Chemotherapy+in+Advanced+ALK+-Positive+Lung+Cancer.">Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).</li><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Costa, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Experience+With+Crizotinib+in+Patients+With+Advanced+ALK+-Rearranged+Non-Small-Cell+Lung+Cancer+and+Brain+Metastases.">Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases.</a> J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).</li><li>Fischer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+leukapheresis+enables+reliable+detection+of+circulating+tumor+cells+of+nonmetastatic+cancer+patients.">Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).</li><li>Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+enumeration+and+phenotyping+of+CTC.">Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC.</a> Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).</li><li>Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR+20th+Anniversary+Commentary:+Paving+the+Way+for+Circulating+Tumor+Cells.">CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).</li><li>Theil, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+new+CellCollector+to+isolate+circulating+tumor+cells+from+the+blood+of+patients+with+different+stages+of+prostate+cancer+and+clinical+outcomes+-+A+proof-of-concept+study.">The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study.</a> PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

في هذه الورقة، لأول مرة، أسلوب الجمع بين تلطيخ الفلورة و "الأسماك الحمض النووي"، للاستخدام مع السلك فونكتيوناليزيد اقترح. تم استدعاء الأسلوب "الأسماك" المناعية-الحمض النووي. ووضعت هذه التقنية تسمح تحديد المتزامن ريادية المفترضة على سلك 3D على أساس المعايير الشكلية، مثل الإيجابية إلى ابكام (الحدث 1)، وتيسير الكشف عن التعديلات الجزيئية، مثل (مركز الجينات كيه الحدث 2). تحديد واحد من هذين الحدثين يتيح الكشف عن تلك الترجمة المشارك. ومن ثم، يمكن تكييف هذا النهج تحديد وتوصيف ريادية استردادها من الدم لمرضى السرطان. الآثار المحتملة حمو-مكونات والكريات البيضاء في الإجراء المصبوغة لا تتدخل عادة في الإجراء. على وجه الخصوص، أشارت البيانات المبلغ عنها في الأدب إلى أن هايمو-مكونات والكريات البيضاء لا تؤثر الفلورة تلطيخ الخلايا المرفقة إلى الأسلاك، خطوة حاسمة لتحديد1،ريادية الفعلي15.
سطوع fluorescence الأسماك المناعية-الحمض النووي ملحوظ أقل قليلاً من إيمونوفوتوتيبينج التقليدية الاعتداء ونتيجة لدرجة الحرارة العالية اللازمة لفحص الأسماك. ومع ذلك، الفلورة تلطيخ لا يزال ملموسا. على سبيل المثال، إشارة باهتة قابلاً للاكتشاف لا يزال في خط الخلية معربا عن ابكام منخفضة، NCIH1975. درجة الحرارة العالية اللازمة لفحص الأسماك هو العامل الرئيسي الذي يحد في اختيار fluorochrome الحق ترتبط الجسم. في هذا البروتوكول، يجب ربط الأجسام المضادة فلوروتشرومي الحرارة من أجل تحمل درجة الحرارة تمسخ الحمض النووي. على سبيل المثال، فيكوريثرين، فلوروتشرومي ثيرموسينسيتيفي، غير مستحسن في هذا الإعداد بسبب تدهور فلوروتشرومي بسبب ارتفاع درجة الحرارة. Fluorescein isothiocyanate هو خيار جيد و fluorochrome المشتركة كثيرا ما يعملون في تحقيقات الأسماك. إشارة أوتوفلوريسسينسي "الأسماك" المناعية-الحمض النووي ضعيف للغاية على يدعم 2D القياسية. على دعم الأسلاك، طبقة البوليمر قد حمل إشارة طفيفة أوتوفلوريسسينسي، لا سيما في القناة الحمراء. على عكس الخلفية 2D، إشارة خلفية أسبيسيفيك ملحوظ على السلك لكن لا تؤثر تأثيراً كبيرا على توصيف الهوية أو خلية الأنوية.
مجهر التقييم من الأسلاك فاتيجوينج أكثر بكثير مما في 2D دعم بسبب حدود المجهر البصري في القراءة على السطح من بنية ثلاثية الأبعاد على شكل أسطواني. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه الصعوبة بالتناوب صاحب الأسلاك، والحصول على الصور التي يتم ترجمة أساسا على طول خط الوسط الأسلاك. حامل سلك يسمح بدوران 360 درجة للأسلاك. مرة واحدة تركز على الأنوية، تغيير القنوات الأسفار ليس بالضرورة الحفاظ على التركيز في المنطقة المستهدفة. ولهذا السبب، من الضروري للحفاظ على التركيز على المنطقة الداخلية-الخلية المستهدفة.
ويمكن تكييف هذه التقنية لكشف وتوصيف الخلايا في أنواع مختلفة من يدعم 3D. كما قد يكون من الممكن استخدام الأجسام المضادة المختلفة ويَسْبِر الأسماك. عند اختيار استخدام الأجسام المضادة المختلفة، ثبات فلوروتشرومي ومستوى التعبير مستضد المستهدفة في غشاء الخلية من العوامل الهامة للنظر. يمكن أيضا أن تكون الملون المستضدات داخل الهيولية. عند استخدام الأسماك المختلفة تحقيقات، من المهم التحقق من مواصفات ورقة البيانات للإجراء تمسخ وإعداد الخلايا للأسماك الاعتداء عليه.

ريادية تمثل خطوة رئيسية من سرطان الخلية نشر1. وجودها في الدم المحيطي لدى المرضى مقترن (المنتشر) الانتكاس والمرض تطور2،3. عزل الإرهاب وتوصيف من الدم لمرضى السرطان نوع من خزعة سائلة غير الغازية. وفي السنوات الأخيرة، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن رصد التقدم واستجابة الأورام للمعالجات المختلفة باستخدام هذا النوع من التحليل يوفر المعلومات السريرية الهامة4،5. خزعة السائل أكثر فائدة عندما الجراحة ليس ممكناً أو عندما لا يتوفر أنسجة الورم الرئيسي، أيلآفات غير بيوبسيابل. ومن ثم فإن هذا النهج واعدة في إعدادات معينة من السرطان مثل NSCLC المنتشر، حيث ثبت وجود ريادية ل دور سلبي الذي تنبؤاتها6. NSCLC هو ورم أن يستفيد خصوصا من النهج العلاجية المستهدفة7،8،9 مصممة لتعمل على جزيئات معينة (الأهداف الجزيئية) المعروفة للمشاركة في النمو والتقدم، و انتشار هذا المرض. ومن ثم، هناك حاجة إلى الكشف عن أهداف محددة أثناء تطور المرض. التحقيق لجنة مكافحة الإرهاب نهج تشخيص للاهتمام للغاية لكشف ورصد أهداف المخدرات دون الحاجة للأنسجة الأولية أو المنتشر. على سبيل المثال، الكشف عن كيه الجينات المولدة في الخلايا NSCLC يرتبط بحساسية كريزوتينيب، علاج مستهدفة محددة10. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، يتم تنفيذ الكشف عن المولدة كيه فقط على تبين إبرة غرامة أو الخزعات الصغيرة؛ نتيجة لذلك دون وجود ورم الأنسجة كيه التحليل لا يمكن. ريادية هي بديل محتمل للورم التحقيقات المستندة إلى الأنسجة، وتمثل نهج تشخيص رفيق واعدة جداً.
على الرغم من أهميتها المحتملة، ريادية لا تزال موضوع جدل كبير بين البحوث، أساسا بسبب هذه الندرة (1-10 خلايا/مل من الدم المحيطي11). الحالي خزعة سائلة أساليب استخدام كمية محدودة من الدم (أي، 1-30 مل)12،13، ولكن هذا يخلق حالة حساسية دون المستوى الأمثل للكشف عن ريادية. وبالتالي، يبرر البحث لإيجاد النهج وتطوير الأجهزة لإجراء خزعات السائلة التي تستهدف مكافحة الإرهاب على حجم أكبر من الدم المحيطي.
جهاز بديل، سلك طبي فونكتيوناليزيد (انظر الجدول للمواد)، وقد وضعت للتغلب على أوجه القصور في أخذ عينات الدم والحصول على إجراء تحليل أكثر تمثيلاً ريادية. هذا السلك فونكتيوناليزيد هو جهاز طبي وافقت CE يلتقط ريادية مباشرة من مجرى الدم ل مرضى السرطان1. وهو يتألف من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ طوله 16 سم (الشكل 1a) مع تلميح فونكتيوناليزيد طوله 2 سم مغطاة بطبقة سمكها 0.2 ميكرون من الذهب. الطبقة بدورها تغطي طبقة المائية 1 إلى 5 ميكرومتر سميكة بوليكاربوكسيلاتي تساهمي مقترنة بالأجسام المضادة الموجهة ضد ابكام، أحد المستضدات المعرب عنها على نطاق واسع على سطح ريادية14. نصيحة فونكتيوناليزيد من الأسلاك هو عرض في الوريد من ذراع المريض، ولا تزال في موقف لمدة 30 دقيقة على الأقل. ويسمح هذا النهج عزل ريادية المجراة، مباشرة في الدم المحيطي، والشاشة حوالي 1.5-3.0 لتر من الدم (حوالي 300-fold أكثر من وحدة التخزين المستخدمة للنهج البديلة)1.
بانتيل وآخرون. أثبتت فعالية هذا النهج في عزل ريادية في عروق الذراع ل مرضى سرطان الرئة15مباشرة. فأدوا الفلورة سلك تلطيخ تحديد ريادية باستخدام الأجسام المضادة التقليدية الموجهة ضد عموم-سيتوكيراتين، ابكام و CD45 للكشف عن ليوكوسيتي. وكان فحص الأسلاك تحت مجهر الأسفار ضوئية15. أثبت المؤلفون أن الجهاز قادراً على عزل ريادية، إلا أنها لم تحقق أي من الأهداف المتصلة بالعلاج، مثل كيه المولدة.
طريقة عرض يهدف إلى تحديد ريادية المفترضة في خطوط الخلايا NSCLC استناداً إلى معلمات الشكلية، مثلاً، ابكام الإيجابية، ووجود المؤشرات الحيوية الجزيئية، على سبيل المثال مركز كيه (الشكل 1b). يجمع هذا الإجراء استغرقت 3 أيام بين أسلاك فونكتيوناليزيد والفلوره تلطيخ مع الحمض النووي fluorescenceفي الموقع-التهجين (الحمض النووي الأسماك)، يدعى المناعية-الحمض النووي-الأسماك. نظراً لأن ريادية كيانات نادرة، الاستفادة من هذا البروتوكول أنه يمكن وصف ريادية في نفس السلك من حيث الميزات إيمونوفينوتيبيك والحمض النووي ترتيبات جديدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol</td>
			<td style="width:144px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:123px;"># 414605</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td># 1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)&#160;</td>
			<td>Medicago</td>
			<td># 09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># 534064-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100 Detergent</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td># 1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RUBBERCEMENT</td>
			<td>Royal Talens</td>
			<td># 95306500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Vysis 20X SSC (66g)</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.&#160;</td>
			<td># 30-804850</td>
			<td style="width:289px;">powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H20</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XT ALK BA</td>
			<td>MetaSystems Probes</td>
			<td># D-6001-100-OG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI, FluoroPure grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td># D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td># S36973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EpCAM-FITC (clone: HEA-125)</td>
			<td>Mitenyi</td>
			<td># 130-080-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro tubes M-Tube18</td>
			<td>Gilupi Nanomedizin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Detektor CANCER01 EpCAM</td>
			<td>Gilupi Nanomedizin</td>
			<td></td>
			<td>Functionalized wire</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAR FROST Microscope Slides</td>
			<td>Knittel GL&#196;SER</td>
			<td>VS1117# 076FKB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SecureSlip Silicone Supported Coverglass</td>
			<td>GRACE BIO-LABS</td>
			<td># 104112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>BR 4.11.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-QiMc</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of tumor cells using a medical wire for capturing circulating tumor cells: a 3d approach based on immunofluorescence and dna fish

تعميم خلايا الورم (ريادية) ترتبط مع بقاء الفقراء في السرطان المنتشر. التحديد، فينوتيبينج، والتنميط يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لعدم تجانس الورم ومما يسهل اختيار المرضى للعلاج شخصية. ومع ذلك، وهذا يعوق بسبب ندرة ريادية. نقدم نهجاً مبتكراً لأخذ العينات حجماً كبيرا من دم المريض والحصول على معلومات عن إزفاء الوجود والنمط الظاهري والجيني ريادية. الأسلوب يجمع بين تلطيخ الفلورة والحامض النووي فلوريفي الموقع-التهجين (الحمض النووي الأسماك) ويستند إلى سلك طبي فونكتيوناليزيد. هذا السلك هو جهاز مبتكرة التي تسمح بالعزل في فيفو ريادية من كمية كبيرة من الدم المحيطي. حجم الدم فحص الإدارة 30 دقيقة من الأسلاك هو حوالي 1.5-3 ل. لإثبات جدوى هذا النهج، تم تحديد التعبير (ابكام) جزيء التصاق الخلايا الظهارية وازفاء الجينات كيه في الرئة الخلية الصغيرة غير خطوط خلايا السرطان (NSCLC) استولت عليها أسلاك فونكتيوناليزيد و الملون بنهج أسماك المناعية-الحمض النووي. وكان التحدي الرئيسي الذي نواجهه للقيام الفحص على هيكل ثلاثي الأبعاد، سلك فونكتيوناليزيد، وتحديد النمط الظاهري المناعية وإشارات الأسماك على هذا الدعم باستخدام مجهر الأسفار تقليدية. النتائج التي تم الحصول عليها تشير إلى أن اصطياد ريادية وتحليل النمط الظاهري، وإعادة ترتيب الكروموسومات يمكن أن يحتمل أن تمثل نهج تشخيص رفيق جديد وتقديم مبتكر شخصية استراتيجية لتحسين علاج السرطان.

استخدام الإجراء الموضح أعلاه، فمن الممكن لتنفيذ مقايسة المناعية-الحمض النووي "الأسماك" ريادية (أو خلايا أخرى تعادل) أثري السلك فونكتيوناليزيد. قبل إعداد هذا البروتوكول، تم التوافق بين الطريقتين العزم (المناعية-الأسفار مع السمك) على يدعم 2D القياسية. وتم اختيار هذين الخطين الخلية NSCLC المختلفة معربا عن ابكام (مطلوب للانضمام إلى سلك مقترنة مع الأجسام المضادة ضد ابكام). لديهم حالة كيه مختلفة، ومفيدة لاختبار مختلف ظروف البدء. الأولى، NCI-H1975، يكون نوع البرية (WT) كيه الجينات، بينما الثاني، NCI-H3122، يتميز بكية المولدة.
تم استخدام نظام لكشف كسر حدة جينات كيه لفحص الأسماك. يتألف النظام من المسابر اثنين، واحد (برتقالي) التهجين في المنطقة الدانية داخل كيه في 23 ف 2 وواحدة (الأخضر) التهجين القاصي لكية. في 2D يدعم، توفر "الأسماك" المناعية-الحمض النووي إشارات محددة تحديداً جيدا لكل من الأجسام المضادة والتحقيق (الشكل 2). على وجه الخصوص، كل خلية خطوط أظهر التعريب غشاء ابكام محددة تحديداً جيدا. وعلاوة على ذلك، ظهرت إشارات التحقيق مشرق وحادة: NCI-H1975 الخلايا أظهرت تداخل المسابير البرتقالي والأخضر، تؤكد حالة wildtype الجينات كيه (الشكل 2 أ، ب). على العكس من ذلك، أظهرت الخلايا NCI-H3122 إشارات متداخلة والنقاط الخضراء واحد، مما يعكس حذف لكية الجينات (الشكل 2 ج، د). عندما تم إجراء المقايسة المناعية-الحمض النووي "الأسماك" في 3D دعم سلك فونكتيوناليزيد، إشارات جسم والتحقيق كانت عموما أقل معرفة من 2D دعم. تلوين ابكام كان مرئياً. وكانت كيه مسبار إشارات أقل معرفة ولكن ما زال يعكس حالة كيه المتوقعة (الشكل 3). وأظهرت النتائج أن تلطيخ الفلورة لا تتداخل مع إشارات "الأسماك الحمض النووي". المسابير المهجنة على وجه التحديد مع أهدافها. خط الخلية NCI-H3122 أظهرت شاذة مركز جينات كيه (الشكل 3b)، على النقيض من NCI-H1975، مع جين كيه نوع البرية (الشكل 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig1.jpg"> 
الشكل 1 : فونكتيوناليزيد الأسلاك، ترتيب التخطيطي لكية المسابير كسر حدة، المخطط للأنماط المتوقعة لإعادة ترتيب كيه، وحامل الخاصة. () الأحمر مربعات تسليط الضوء على ثلاثة أجزاء رئيسية من الأسلاك: فونكتيوناليزيد نصيحة وسلك سداده، ونصيحة فونكتيوناليزيد الأمم المتحدة. نصيحة فونكتيوناليزيد هو الجزء الأكثر حساسية من الأسلاك، ويجب أن لا يلمس أثناء التعامل مع تجنب مفرزة الخلية أو الضرر. (ب) كل من المسابر الأخضر والأحمر على التوالي الربط بتسلسل المنبع والمصب من المكاني للجينات كيه (على اليسار). على اليمين، تظهر أنماط اكسيمبليفيكاتيفي ترتيبات كيه. الإشارات الحمراء والخضراء ومسلم المشارك في الخلايا الطبيعية؛ فصل الإشارات الخضراء والحمراء تشير إلى كيه الجينات كروموسوم فاصل (إزفاء الجين كيه) وإشارة واحدة أخضر-أورانج كولوكاليزيشن (الخلية الشاذة-1). إشارة حمراء واحدة واشارتين خضراء تشير إلى فقدان إشارة حمراء واحدة، مما يوحي إزفاء وحذف (الخلية الشاذة-2). (ج) سلك حامل؛ مربعات حمراء تسليط الضوء على المجالات التي تحتاج إلى الرعاية عند التعامل مع السلك أثناء التحليل المجهري. السلك يمكن الخضوع لإجراء تحليل 360 ° عن طريق تحويل محور دوار. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig2.jpg"> 
الشكل 2 : فحص الأسماك المناعية-الحمض النووي في 2D الدعم (ساترة)- (، ب) NCI-H1975 الخلايا إيجابية ضعيفة ابكام. وكانت إشارات فيتك ابكام ملموس. المسابر البرتقالي والأخضر لكية فاصل-عدا متراكبة، تؤكد حالة WT الجينات كيه في خط الخلية NCIH1975. خلايا عرض اثنين أو أكثر من الإشارات المزدوجة كانت موجودة بسبب ما انيوبلويدي. (ج، د) في السطر خلية NCIH3122 الإعراب عن ابكام عالية، كانت إشارات الفلورة مشرق، التي قد تبرز في تقاطعات خلية خلية. الأسماك تحليلات الحذف المؤكدة من الجينات كيه، نموذجية من هذا خط الخلية. وتبين الأسهم الحمراء واحد المسابير الخضراء (دون تحقيقات البرتقال المقابلة)، مما يعكس حذف الجينات كيه. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig3.jpg"> 
الشكل 3: "الأسماك" المناعية-الحمض النووي الاعتداء باستخدام السلك فونكتيوناليزيد كدعم 3D- () ممثل صورة خلايا NCI-H1975 على السلك. على الرغم من أن الشكل الثلاثي الأبعاد للخلايا بالأسلاك تجعل من الصعب على الحصول على الصور تماما في التركيز، إشارة ابكام أيضا مرئية في كافة الخلايا. (ب) ممثل الصورة من الخلايا NCI-H3122 على السلك. وأظهرت تحقيقات كيه الجينات الحذف (الأسهم الحمراء)، كما سبق أن ينظر في 2D دعم. الإشارات الخلفية مرئية على الأرجح بسبب وجود طبقة البوليمر. بيد أنه لم يؤثر إلى حد كبير خلية التحليل تحديد الهوية أو الأسفار. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>المخزن المؤقت</td>
			<td>تكوين</td>
			<td>ملاحظة</td>
			<td>الأرصدة</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>خلية كاملة الثقافة المتوسطة</td>
			<td>ربمي 1640 + 2 مم الجلوتامين + 5-10% مصل بقرى الجنين (FBS).</td>
			<td></td>
			<td>ربمي: 4 درجة مئوية؛ الجلوتامين، FBS:-20 درجة مئوية</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الجسم المضاد ديلويشن المخزن المؤقت</td>
			<td>1% جيش صرب البوسنة، X-100 تريتون 0.3% في برنامج تلفزيوني 1 x</td>
			<td></td>
			<td>ختم الرايت مع الفيلم المختبر.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x حل التعاون بين بلدان الجنوب</td>
			<td>م 3 كلوريد الصوديوم، سترات صوديوم 300 مم حله في ddH20</td>
			<td>تصفية الحل ودرجة الحموضة = 7.0 +/-0.1 مع HCl</td>
			<td>ختم الرايت مع الفيلم المختبر.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 × الحل SSC</td>
			<td>تمييع الأسهم 20 x SSC في المقطر ح2س</td>
			<td>تصفية الحل ودرجة الحموضة = 7.0 +/-0.1 مع HCl</td>
			<td>الرايت</td></tr></tbody></table>ختم مع الفيلم المختبر.
		
		<tr>
			<td>2 × SSC + 0.05% توين 20 الحل</td>
			<td>تمييع الأسهم 20 × التعاون بين بلدان الجنوب في المقطر ح2س + 0.05% 20 توين</td>
			<td>تصفية الحل ودرجة الحموضة = 7.0 +/-0.1 مع HCl</td>
			<td>ختم الرايت مع الفيلم المختبر.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI الحل 30 نانومتر</td>
			<td>تمييع ميكرومتر الأسهم 1.43 في برنامج تلفزيوني 1 x</td>
			<td></td>
			<td>-20 درجة مئوية في حالة الظلام جاهزة للاستخدام اليكووتي</td>
		</tr>
	

الجدول 1: وصفات الحلول.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH at JoVE.com

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي

نقدم نهجاً جديداً لتمييز الخلايا السرطانية. نحن جنبا إلى جنب الفلورة مع الحمض النووي فلوري-في الموقع-التهجين تقييم الخلايا التي استولت عليها سلك طبي فونكتيوناليزيد قادر على في فيفو إثراء ريادية مباشرة من دم المريض.

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

القبض على وإطلاق قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية من الدم

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...