Name: characterization of tumor cells using a medical wire for capturing circulating tumor cells: a 3d approach based on immunofluorescence and dna fish
Uploaded: 2017-12-21T15:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH at JoVE.com

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+different+methods+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+in+mice+with+lung+metastasis.">Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis.</a> Oncol. Rep. , 1-8 (2017).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).</li><li>Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+significance+of+circulating+tumor+cells+in+cancer.">Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).</li><li>Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTC+enumeration+and+characterization:+moving+toward+personalized+medicine.">CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine.</a> Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).</li><li>Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell+lung+cancer+patients:+a+meta-analysis.">Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis.</a> PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).</li><li>Maemondo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gefitinib+or+Chemotherapy+for+Non?Small-Cell+Lung+Cancer+with+Mutated+EGFR.">Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR.</a> N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+versus+Chemotherapy+in+Advanced+ALK+-Positive+Lung+Cancer.">Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).</li><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Costa, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Experience+With+Crizotinib+in+Patients+With+Advanced+ALK+-Rearranged+Non-Small-Cell+Lung+Cancer+and+Brain+Metastases.">Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases.</a> J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).</li><li>Fischer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+leukapheresis+enables+reliable+detection+of+circulating+tumor+cells+of+nonmetastatic+cancer+patients.">Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).</li><li>Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+enumeration+and+phenotyping+of+CTC.">Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC.</a> Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).</li><li>Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR+20th+Anniversary+Commentary:+Paving+the+Way+for+Circulating+Tumor+Cells.">CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).</li><li>Theil, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+new+CellCollector+to+isolate+circulating+tumor+cells+from+the+blood+of+patients+with+different+stages+of+prostate+cancer+and+clinical+outcomes+-+A+proof-of-concept+study.">The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study.</a> PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

В этом документе в первый раз, метод, объединяющий иммунофлюоресценции окрашивание и ДНК рыбы, для использования с функционализированных проволоки было предложено. Метод был вызван иммуно-ДНК рыбы. Этот метод был разработан для одновременной идентификации предполагаемого ЦОК на 3D провод на основе фенотипические параметры, такие как позитивность для EpCAM (событие 1) и для облегчения обнаружения молекулярных изменений, таких как ALK гена статус ( Мероприятие 2). Одновременной идентификации двух событий позволяет обнаружить их совместного локализации. Следовательно этот подход может быть адаптирована для выявления и описания ЦОК, полученных из крови больных раком. Потенциальные последствия брюшинного компонентов и лейкоцитов на процедуре окрашивание не вмешиваться в обычно процедура. В частности данные, приведенные в литературе указывается, что брюшинного компоненты и лейкоцитов не влияют иммунофлюоресценции окрашивания клеток, придает провода, важным шагом для определения фактической CTCs1,15.
Яркости флуоресценции иммуно-ДНК рыбы немного менее заметно, чем традиционные immunophototyping пробирного и является результатом высокой температуры, необходимой для assay рыбы. Однако все еще заметна иммунофлюоресценции пятнать. Например слабый сигнал до сих пор обнаружить в низкой EpCAM выражая клеток линии, NCIH1975. Высокой температуры, необходимой для assay рыба является основным сдерживающим фактором в выборе правой флюрохром, связаны с антитела. В этом протоколе антитела должны увязываться на термостабильным флюрохром для того, чтобы терпеть температура денатурации ДНК. Например из-за флюрохром деградации, вызванной высокой температуры в этой обстановке фикоэритрин, термочувствительных флюрохром, не рекомендуется. Флуоресцеин Изотиоцианаты является хорошим выбором и часто общей флюрохром, работающих на зонды рыбы. Это очень плохой на стандартные 2D поддерживает сигнал аутофлюоресценция иммуно-ДНК рыбы. На поддержку проволока полимерный слой может вызвать незначительные аутофлюоресценция сигнал, особенно на красный канал. В отличие от 2D фон aspecific фонового сигнала заметные на проводе, но существенно не влияет на ядрах идентификации или клетки характеристика.
Микроскоп оценку провода является гораздо более fatiguing, чем на 2D поддержки из-за пределов оптический микроскоп в чтении на поверхности 3D структуры с цилиндрической формы. Однако эти трудности могут быть преодолены Вращающийся держатель проводов и получения изображений, которые преимущественно локализуются вдоль средней линии провода. Держатель проводов позволяет вращение 360 ° провода. После уделялось ядер, изменения флюоресценции каналы не обязательно полностью сосредоточиться на целевой области. По этой причине важно сосредоточить внимание на внутренний клеточной целевой области.
Эта техника может быть адаптирована для обнаруживать и определять характеристики клеток на различных видов 3D поддерживает. Она также может быть возможно использование различных антител и зонды рыбы. При выборе использования различных антител, флюрохром термостойкость и уровень экспрессии антигена целевой на клеточной мембраны являются важными факторами для рассмотрения. Также могут быть окрашены внутри цитоплазматического антигены. При зонды с использованием различных видов рыб, важно проверить, что данные характеристики для процедуры денатурации и подготовить клеток для рыб пробирного соответственно.

ЦОК представляют собой ключевой шаг раковых клеток распространение1. Их присутствие в периферической крови больных ассоциируется с (метастазов) рецидива и болезнь прогрессии2,3. КТК изоляции и характеристика от крови больных раком — это тип неинвазивные жидкого биопсии. В последние годы становится все более очевидным, что мониторинг прогрессии и реакции опухоли на различные процедуры с использованием такого рода анализ обеспечивает важной клинической информации4,5. Жидкий биопсии еще более полезным, когда операция не является возможным или когда первичной опухоли не доступен, то есть, для не biopsiable поражений. Следовательно этот подход является перспективным в конкретных рака параметры, такие как метастатического НМРЛ, где было показано присутствие CTCs иметь отрицательные прогностические роль6. НМРЛ это опухоль, особенно от целевых терапевтических подходов7,8,9 , призванных действовать на определенных молекул (молекулярных целей) известный участвовать в росте, прогрессии, и распространение болезни. Следовательно необходима обнаружения конкретных целей во время болезни. КТК расследование является чрезвычайно интересным диагностический подход для выявления и мониторинга наркотиков целей без необходимости для первичного или метастатической тканей. Например обнаружение транслокации гена ALK в клетках НМРЛ связан с чувствительностью к crizotinib, конкретной целенаправленной терапии10. Однако в настоящее время обнаружения ALK транслокации выполняется только на тонкоигольной пунктаты или небольших биопсий; в результате без опухоль ткани ALK анализ не является возможным. ЦОК являются потенциальной альтернативой опухоли на основе ткани расследований и представляют собой весьма перспективным компаньон диагностический подход.
Несмотря на их потенциальное значение ЦОК по-прежнему являются предметом большой дискуссии среди исследований, главным образом из-за их редкости (1-10 клеток/мл периферической крови11). Текущие жидкость биопсии методы используют ограниченное количество крови (т.е., 1-30 мл)12,13, но это создает ситуацию субоптимальные чувствительности для обнаружения CTCs. Следовательно, заслуживает проведения исследований для нахождения подходов и разработке устройств для выполнения КТК целевой жидких биопсий на больший объем периферической крови.
Альтернативные устройства, функционализированных медицинская проволока (см. Таблицу материалы), был разработан преодолеть ограничения отбора проб крови и получить более представительным анализ ЦОК. Этот функционализированных проволока является одобренный CE медицинской устройство, которое захватывает CTCs непосредственно из крови больных раком1. Он состоит из 16-см длиной нержавеющей стальной проволоки (рис. 1a) с длиной 2 см функционализированных наконечником с 0,2 мкм толстый слой золота покрытием. В свою очередь слой покрывается 1-5 мкм толщиной поликарбоксилата гидрогеля страте ковалентно в сочетании с антитела, направленные против EpCAM, один из наиболее широко выраженная антигенов на поверхности CTCs14. Функционализированных кончик проволоки вводится в вену руки пациента и остается в положении по крайней мере 30 минут. Этот подход позволяет изоляции ЦОК в естественных условиях, непосредственно в периферической крови и экран около 1,5-3,0 Л крови (примерно 300-fold больше, чем объем, используемый для альтернативных подходов)1.
Pantel и др. продемонстрировали эффективность этого подхода в изоляции CTCs прямо в руки Вены больных раком легкого15. Они исполнили проволока иммунофлюоресценции окрашивания для выявления ЦОК, с использованием обычных антитела, направленные против EpCAM и Пан Цитокератины и CD45 лейкоцитарной обнаружения. Провод был рассмотрен под микроскоп оптический флуоресценции15. Авторы показали, что устройство было возможность изолировать ЦОК, но они не расследовать любые связанные с терапии целей, таких как ALK транслокации.
Представленный метод направлен на выявление предполагаемых ЦОК в НМРЛ клеточных линий на основе фенотипические параметров, например, EpCAM позитивность и наличие молекулярных биомаркеров, например состояние ALK (рис. 1b). Эта процедура 3-дн длинней сочетает в себе функционализированных проволоки и иммунофлюоресценции, окрашивание с ДНК флуоресценции -in situ-гибридизации (ДНК рыбы), названный иммуно-ДНК-рыба. Учитывая, что CTCs редких сущности, преимуществом этого протокола является что CTCs можно охарактеризовать на же проволоки терминах иммунофенотипических функций и перераспределения ДНК.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol</td>
			<td style="width:144px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:123px;"># 414605</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td># 1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)&#160;</td>
			<td>Medicago</td>
			<td># 09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># 534064-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100 Detergent</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td># 1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RUBBERCEMENT</td>
			<td>Royal Talens</td>
			<td># 95306500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Vysis 20X SSC (66g)</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.&#160;</td>
			<td># 30-804850</td>
			<td style="width:289px;">powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td># 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H20</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XT ALK BA</td>
			<td>MetaSystems Probes</td>
			<td># D-6001-100-OG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI, FluoroPure grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td># D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td># S36973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EpCAM-FITC (clone: HEA-125)</td>
			<td>Mitenyi</td>
			<td># 130-080-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro tubes M-Tube18</td>
			<td>Gilupi Nanomedizin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Detektor CANCER01 EpCAM</td>
			<td>Gilupi Nanomedizin</td>
			<td></td>
			<td>Functionalized wire</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAR FROST Microscope Slides</td>
			<td>Knittel GL&#196;SER</td>
			<td>VS1117# 076FKB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SecureSlip Silicone Supported Coverglass</td>
			<td>GRACE BIO-LABS</td>
			<td># 104112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>BR 4.11.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-QiMc</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of tumor cells using a medical wire for capturing circulating tumor cells: a 3d approach based on immunofluorescence and dna fish

Циркулирующих клеток опухоли (CTCs) связаны с бедными выживания в лечении метастатического рака. Их идентификации, фенотипа и генотипирования может привести к более глубокому пониманию опухоли неоднородность и таким образом облегчить отбор пациентов для лечения персонализированные. Однако это затрудняется из-за редкости ЦОК. Мы представляем новаторский подход для выборки большого количества крови пациента и получения информации о присутствия, фенотип и Джин транслокации ЦОК. Этот метод сочетает в себе иммунофлюоресценции окрашивание и ДНК люминесцентные -монолитного-гибридизации (ДНК рыбы) и на основе функционализированных медицинская проволока. Этот провод является инновационным устройством, которое позволяет в естественных условиях изоляции CTCs от большого объема периферической крови. Объем крови, проверяются администрацией 30-мин провода — примерно 1,5-3 л Чтобы продемонстрировать целесообразность такого подхода, эпителиальных клеток сцепления молекул (EpCAM) выражение и транслокация гена ALK были определены в не небольшие клеток легких рака легкого (НМРЛ) клеточных линий захвачен функционализированных проволоки и Витражи с иммуно ДНК рыбы подход. Нашей главной задачей было выполнить пробу на 3D структуры, функционализированных провода и определить иммуно фенотипа и рыбы сигналов на этой поддержки, с помощью обычных флуоресцентным микроскопом. Полученные результаты показывают, что ловить CTCs и анализа их фенотипа и хромосомная перестановка может потенциально представляют собой новый компаньон диагностический подход и предоставляют инновационные стратегии для улучшения персонализированных лечения рака.

С помощью описанной выше процедуры можно выполнить assay иммуно-ДНК рыбы на CTCs (или других эквивалентных клетки), обогащенные функционализированных проволоки. Прежде чем настраивать этот протокол, совместимости двух методов был решительным (иммуно флуоресценции с рыбой) на стандартные 2D поддерживает. Были выбраны две различных клеточных линий НМРЛ, выражая EpCAM (обязательно придерживаться провода, в сочетании с антителами против EpCAM). Они имеют иной статус ALK, который полезно для тестирования различных стартовых условий. Во-первых, NCI-H1975, у гены ALK дикого типа (WT), в то время как второй, NCI-H3122, характеризуется ALK транслокации.
Была использована система брейк Помимо обнаружения гена ALK для assay рыбы. Система состоит из двух зондов, один гибридизировать в проксимальных регион в пределах ALK 2p 23 и один гибридизировать дистальнее ALK (зеленый) (оранжевый). На 2D опоры иммуно-ДНК рыбы представили четкие сигналы как антитела, так и зонд (рис. 2). В частности оба мобильных линий показали четкой локализации EpCAM мембраны. Кроме того, зонд сигналы появились яркие и острые: клетки NCI-H1975 показало перекрытия оранжевый и зеленый зонды, подтверждающий статус wildtype гена ALK (Рисунок 2a, b). И наоборот NCI-H3122 клеток показали перекрытие сигналов и одного зелеными точками, отражая удаление гена ALK (рис. 2 c, d). При выполнении анализа иммуно-ДНК рыбы на 3D поддержки функционализированных проволока, антител и зонд сигналы были обычно менее определенными, чем на 2D поддержку. Окрашивание EpCAM был виден. ALK зонд сигналы были менее определены, но по-прежнему отражает состояние ожидаемого ALK (рис. 3). Результаты показали, что иммунофлюоресценции окрашивания не вмешиваться ДНК рыбы сигналов. Зонды гибридизированных конкретно с их целями. Линии клетки NCI-H3122 показал аберрантных статус гена ALK (рис. 3b), в отличие от NCI-H1975, с геном ALK дикого типа (рис. 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig1.jpg"> 
Рисунок 1 : Функционализированных проволока, схема расположения ALK апарт брейк зондов, схема предполагаемой структуры ALK перегруппировки и специальных держатель. () красный выделить три основные части провода: функционализированных кончика, проволока пробка и ООН функционализированных наконечник. Кончик функционализированных является самой деликатной частью провода и не должны быть затронуты во время обращения во избежание мобильный отряд или повреждения. (b) зеленый и красный зонды соответственно привязку к последовательности вверх и вниз по течению от локусам гена ALK (слева). Справа отображаются exemplificative узоры ALK договоренностей. Красный и зеленый Сопредседатель локализация сигналов на нормальные клетки; раздельный зеленый и красный сигналы указывают ALK гена хромосома перерыв (транслокации гена ALK) и один зеленый оранжевый colocalization сигнала (аберрантных клеток-1). Один красный сигнал и два зеленых сигналы указывают на потерю одного красного сигнала, предлагая транслокация и удаления (аберрантных клеток-2). (c) провод держателя; красные коробки выделить области, где уход необходим при обработке провода во время анализа в микроскопии. Провод можно пройти анализ 360 °, повернув ротатора. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig2.jpg"> 
Рисунок 2 : Пробирного иммуно-ДНК рыбы на поддержка 2D (coverslip). (, b) NCI-H1975 клеток слабо положительный для EpCAM. EpCAM FITC сигналы были заметны. Оранжевый и зеленый зонды ALK брейк-отдельно перекрываются, подтверждающий статус WT ALK гена в NCIH1975 линии клеток. Клетки, отображение более двух спаренных сигналы присутствовали вследствие их анеуплоидии. (c, d) В высокой линии клеток выразить EpCAM NCIH3122 иммунофлюоресценции сигналы были яркими, которая была акцентирована в ячейке развязок. РЫБЫ анализ подтвердил удаления гена ALK, типичных для этой линии клеток. Красные стрелки показывают один зеленый зонды (без соответствующего оранжевый зонды), отражающие ALK гена удаления. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig3.jpg"> 
Рисунок 3: Иммуно-ДНК рыбы пробирного используя функционализированных провод как поддержка 3D. () представитель изображение NCI-H1975 клеток на проволоку. Хотя трудно приобрести полностью фокус изображения 3D форма клеток на проводе, EpCAM сигнал хорошо видна во всех клетках. (b) представитель изображение NCI-H3122 клеток на проволоку. ALK зондов показала гена удаления (красные стрелки), как ранее видели на поддержка 2D. Видимые фон сигналы были скорее всего объясняется наличие слоя полимера. Однако это не затрагивает значительно анализа идентификации или флуоресценции клеток. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Буфер</td>
			<td>Состав</td>
			<td>Примечание</td>
			<td>Запасы</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ячейки, полной питательной среды</td>
			<td>Глютамин RPMI 1640 + 2 мм + 5-10% плода бычьим сывороточным (ФБС).</td>
			<td></td>
			<td>RPMI: 4 ° C; Глютамин, ФБС:-20 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Антитела Diluition буфера</td>
			<td>BSA 1%, 0,3% Тритон X-100 в однократном ПБС</td>
			<td></td>
			<td>RT. печать с лабораторией фильм.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC решение</td>
			<td>3 M хлорид натрия, цитрат натрия 300 мм, растворенных в ddH20</td>
			<td>Фильтр раствор и рН = 7.0 +/-0.1 с HCl</td>
			<td>RT. печать с лабораторией фильм.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,4 x SSC решение</td>
			<td>Разбавить фондовой 20 x SSC в дистиллированной H2O</td>
			<td>Фильтр раствор и рН = 7.0 +/-0.1 с HCl</td>
			<td>RT.</td></tr></tbody></table>Печать с лабораторией фильм.
		
		<tr>
			<td>2 x SSC + 0,05% раствор анимации 20</td>
			<td>Разбавить складе 20 x SSC в дистиллированной H2O + 0,05% 20 анимации</td>
			<td>Фильтр раствор и рН = 7.0 +/-0.1 с HCl</td>
			<td>RT. печать с лабораторией фильм.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI раствор 30 Нм</td>
			<td>Разбавить фондовой 1,43 мкм в однократном ПБС</td>
			<td></td>
			<td>-20 ° C в темное состояние готов к использованию aliquote</td>
		</tr>
	

Таблица 1: Рецепты решений.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH at JoVE.com

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Характеристика опухолевых клеток с помощью медицинская проволока для захвата циркулирующих клеток опухоли: 3D подход, основанный на иммунофлюоресценции и ДНК рыбы

Мы представляем новый подход к характеризуют опухолевых клеток. Мы объединили иммунофлюоресценции с ДНК люминесцентные -монолитного-гибридизации оценить клетки, захвачен функционализированных медицинская проволока, способны в vivo обогащения CTCs непосредственно из крови пациента.

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Захват и Выпуск Жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток из крови

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Создание колонизации Assay легких для циркулирующих визуализации опухолевых клеток в тканях легких

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Обнаружение и мониторинг опухолев, связанных с циркуляцией ДНК в биожидкости пациентов

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...