Name: visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Vi står i gæld til forskning Federation FRABio og TisBio imaging platform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des assemblager Biomoléculaires) for at give den tekniske miljø bidrager til at opnå dette arbejde.

Bemærk: Flydende og fast ½ MS medier skal forberedes på forhånd som beskrevet i supplerende tabel 1.
1. anlægget kultur
<ol><li>
Kultur af 2 måneder gamle hør planter
	<ol>
<li>Så hør (Linum usitatissimum L.) frøene i plastic Potter bruger potning kompost.</li>
		<li>Vokse hør i vækst kamre ved 22 ° C med en lysperiode på 16 h/8 h dag/aften.</li>
		<li>Udstyre planter med lodrette støtte efter 1 måned og vokse, indtil de er 2 måneder gammel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur af 2 uger gamle hør stiklinger
	<ol>
<li>Pak 12 hørfrø i et stykke ost klud og lave med en elastik til at gøre en bylt. Bemærk: Udfør de næste trin under sterile forhold under en laminar flow stinkskab.</li>
		<li>Placer frø bundle i en tidligere autoklaveres 250 mL glasflaske.</li>
		<li>Tilføje 70 mL af 70% EtOH i flasken og forsigtigt røre i 1 minut.</li>
		<li>Fjern forsigtigt EtOH ved dekantering mens bundtet i flasken.</li>
		<li>Der tilsættes 100 mL 2% natriumhypochlorit og omrøres forsigtigt i 10 min.</li>
		<li>Fjern natriumhypochlorit løsning ved dekantering mens bundtet i flasken.</li>
		<li>Gentag trin 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>Tilsættes 100 mL sterilt ultrarent vand og omrøres i 1 min.</li>
		<li>Gentag trin 1.2.8 3 gange, på at øge den føres tid for hvert skyl (5, 10 og 15 min).</li>
		<li>Varm solid ½ MS medium, hæld det i en steril kultur plantekasse til en højde på 2 cm og lad det køle ned indtil størkning.</li>
		<li>Fint sted hver frø på solid medium ved hjælp af steril pincet.</li>
		<li>Lukke boksen sterile.</li>
		<li>Overføre boksen til en vækst kammer ved 22 ° C med en lysperiode på 16 h/8 h dag/nat og vokse hør stiklinger i 2 uger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metaboliske indarbejdelse af kemiske journalister
Bemærk: Tre eksperimentelle modeller er præsenteret nedenfor: i) metaboliske mærkning af stilken tværsnit, ii) hele stilke og iii) plante stiklinger. Hver protokol præsenteres for en biologisk replikat og mængder, der kan tilpasses til antallet af nødvendige biologiske replikater. Monolignol solutions er fremstillet af stamopløsninger, der er gjort som beskrevet i tabel 2 før eksperimentet. De stamopløsninger kan lagres flere måneder ved-20 ° C. Den HAZ: GALK eller H:G proportioner kan justeres for at passe alle custom-made eksperimentelle design.
<ol><li>Kemiske reporter iblanding i 2 måneder gamle hør stilk tværsnit
	<ol>
<li>Forberede en 300 µL kemiske reporter opløsning indeholdende 10 µM af GALK og 10 µM af HAZ i sterile ½ MS lage.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK løsning og overføre det til et godt af en 48-godt plade med en mikropipette.</li>
		<li>Forberede en 300 µL negativ kontrol opløsning indeholdende 10 µM g og 10 µM h i sterile ½ MS lage.</li>
		<li>Vortex H/G løsning og overføre det til et andet godt af den samme 48-godt plade.</li>
		<li>Skær stilken af en 2 måned-forhenværende hørplanten på 10 cm over jorden niveau ved hjælp af en ny barberblad.</li>
		<li>Fint forberede 50 freehand tværgående tværsnit af stænglen ved hjælp af barberblad (ca 150-250 µm tykt).</li>
		<li>Umiddelbart Placer tværsnit i flydende sterile ½ MS medium i et urglas.</li>
		<li>Inspicér visuelt og vælg intakt hele tværsnit og tilfældigt distribuere 10 af dem i den godt fyldte med HAZ/GALK løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.1.8 for de godt fyldt med H/G løsning (som negativ kontrol).</li>
		<li>Gentag trin 2.1.8 for en tredje godt fyldt med 300 µL af ½ MS medium (som baggrund kontrol til at justere fluorescens grundlinjen i den efterfølgende databehandling af konfokalmikroskopi billeder).</li>
		<li>Inkuber plade i kontinuerlig lys i et vækst kammer ved 20 ° C i 20 timer.</li>
		<li>Fjerne monolignol løsningen i hver brønd med en mikropipette.</li>
		<li>Tilsæt 500 µL af ½ MS medium til hver brønd, omrøres forsigtigt i 10 min og fjerne denne skylning løsning med en mikropipette. Gentag 4 gange og gå videre til BLISS mærkning straks (afsnit 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Kemiske reporter iblanding i 2 måneder gamle hør hele stilke
	<ol>
<li>Forbered en 5 mL kemiske reporter opløsning indeholdende 10 µM af GALK og 10 µM af HAZ i sterile ½ MS lage.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK løsning og overføre det til en 20 cm høje glas test tube med en pipette.</li>
		<li>Forbered en 5 mL negativ kontrol opløsning indeholdende 10 µM g og 10 µM h i sterile ½ MS lage.</li>
		<li>Vortex H/G løsning og overføre det til en 20 cm høje glas test tube.</li>
		<li>Forberede et tredje glas reagensglas med 5 mL af ½ MS medium (som baggrund kontrol til at justere fluorescens grundlinjen i den efterfølgende databehandling af konfokalmikroskopi billeder).</li>
		<li>Skær stilken af en 2 måned-forhenværende hørplanten på 10 cm over jorden niveau ved hjælp af en ny barberblad. Kassér rodsystem og nederste del af stænglen og gå videre til det næste trin med den øverste del af plante stænglen.</li>
		<li>Fordyb i bunden af hele skæres stilken i rør indeholdende HAZ/GALK løsning. Anbring stilken i sin inkubation umiddelbart efter fjernelse af rodsystemet for at forhindre udtørring. Bemærk: Hvis metoden anvendes til yngre/ældre planter og/eller andre arter, volumen af monolignol løsninger skal justeres efter størrelsen / alder af anlægget og diameteren af sin stængel.</li>
		<li>Tillægge en lodret støtte til at holde det lige stilken.</li>
		<li>Forsegle glasrør med parafilm at undgå fordampning af løsningen.</li>
		<li>Gentag trin 2.2.6-2.2.9 for en negativ kontrolprøve med H/G løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.2.6-2.2.9 for fluorescens baggrund kontrolprøve indeholdende ½ MS medium.</li>
		<li>Inkuber hver stængel for 20 h i kontinuerlig lys ved hjælp af en neon lys.</li>
		<li>Efter 20 h metaboliske vedtægter, fjerne stilken inkuberes i HAZ/GALK løsning og skyl det med ½ MS medium.</li>
		<li>Skære og kassér bunden 1 cm af stilken med et barberblad og derefter forberede en 1 cm høje cylinder fra bunden af den resterende stilk.</li>
		<li>Omhyggeligt forberede 20 freehand tværgående tværsnit (ca 150-250 µm tykt) fra denne cylinder og læg dem straks i et urglas og fyldt med ½ MS medium.</li>
		<li>Sætte 500 µL af ½ MS medium i et godt af en 48-godt plade.</li>
		<li>Inspicér visuelt og vælg intakt hele tværsnit og tilfældigt distribuere 10 af dem i brønden fyldt med ½ MS løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.2.13-2.2.17 for den negative kontrol stilk inkuberes med H/G løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.2.13-2.2.17 til fluorescens baggrund kontrol stilk inkuberes med ½ MS medium.</li>
		<li>Fjern forsigtigt løsningen i hver brønd med en mikropipette.</li>
		<li>Tilsæt 500 µL af ½ MS medium til hver brønd, omrøres forsigtigt i 10 min og fjerne denne skylning løsning med en mikropipette. Gentag 4 gange og gå videre til BLISS mærkning straks (afsnit 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Kemiske reporter iblanding i 2 uger gamle hør stiklinger Bemærk: Følgende trin alt foregår under sterile forhold.<ol>
<li>Forbered en 2 mL kemiske reporter opløsning indeholdende 10 µM af GALK og 10 µM af HAZ i sterile ½ MS lage.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK løsning og overføre det til en 20 cm høje glas test tube med en pipette.</li>
		<li>Forbered en 2 mL negativ kontrol opløsning indeholdende 10 µM g og 10 µM h i sterile ½ MS lage.</li>
		<li>Vortex H/G løsning og overføre det til en 20 cm høje glas test tube.</li>
		<li>Forberede en tredje 20 cm høje glas reagensglas indeholder 2 mL af ½ MS medium (som baggrund kontrol til at justere fluorescens grundlinjen i den efterfølgende databehandling af konfokalmikroskopi billeder).</li>
		<li>Forsigtigt fjerne en 2 uge gamle hør sætteplante fra solid ½ MS medium med en lang pincet (afsnit 1.2. ovenfor).</li>
		<li>Forsigtigt overføre sætteplante til røret indeholder HAZ/GALK løsning, at sikre, at dens rødder er nedsænket i løsningen.</li>
		<li>Luk glasrør med en plastik hætte til at undgå fordampning.</li>
		<li>Gentag trin 2.3.6-2.3.8 for negative kontrol tuben med H / G løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.3.6-2.3.8 for fluorescens baggrund kontrol tube indeholder ½ MS medium.</li>
		<li>Inkuber hver sætteplante i kontinuerlig lys i et vækst kammer i 20 timer ved 20 ° C.</li>
		<li>Forsigtigt fjerne sætteplante inkuberes i HAZ/GALK løsning og skyl det med ½ MS medium.</li>
		<li>Fint forberede 20 freehand tværsnit (ca 150-250 µm tykt) af hypocotyl.</li>
		<li>Sætte 500 µL af ½ MS medium i et godt af en 48-godt plade.</li>
		<li>Inspicér visuelt og vælg intakt hele tværsnit og tilfældigt distribuere 10 af dem i brønden fyldt med ½ MS løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.3.12-2.3.15 for den negative kontrol sætteplante inkuberes med H/G -løsning.</li>
		<li>Gentag trin 2.3.12-2.3.15 til fluorescens baggrund kontrol sætteplante inkuberes med ½ MS medium.</li>
		<li>Fjern forsigtigt løsningen i hver brønd med en mikropipette.</li>
		<li>Tilsæt 500 µL af ½ MS medium til hver brønd, omrøres forsigtigt i 10 min og fjerne denne skylning løsning med en mikropipette. Gentag 4 gange og gå videre til BLISS mærkning straks (afsnit 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. dobbelt fluorescens mærkning af plante tværsnit prøver af SPAAC og CuAAC
Bemærk: Den LYKSALIGHED mærkning protokol er ens for alle 3 eksperimentelle modeller (afsnit 2).
<ol><li>
Stamme-forfremmet indeholder-alkyn Cycloaddition (SPAAC) mærkning
	<ol>
<li>Forberede 1 mL af en SPAAC løsning indeholdende 5 µM af DBCO-PIND4-5/6-carboxyrhodamine 110 i sterile ½ MS lage. Vortex løsningen og holde det i mørke.</li>
		<li>Efter den sidste vask trin af den metaboliske indarbejdelse protokol [2.1.13, 2.2.21 eller 2.3.19 afhængigt af den valgte eksperimentelle design], Fjern ½ MS medium og tilsæt 300 µL af opløsningen SPAAC pr. brønd med en mikropipette.</li>
		<li>Skjold 48-godt plade fra lys dækker med aluminiumsfolie eller ved at placere det i en boks.</li>
		<li>Blidt røre pladen på et rysteapparat i 1 timer i mørke ved stuetemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kobber-katalyseret indeholder-alkyn Cycloaddition (CuAAC) mærkning
	<ol>
<li>Vask hver godt 4 gange som beskrevet i trin 2.1.13 samtidig holde pladen i mørke.</li>
		<li>Forberede 1 mL af en CuAAC løsning indeholdende 2,5 mM natrium Ascorbat, 0,5 mM CuSO4 og 5 µM i 5-TAMRA-PIND3-indeholder i sterile ½ MS lage. Vortex løsningen og holde det i mørke. Bemærk: Denne CuAAC løsning skal være frisk fremstillede før brug og kan ikke gemmes mere end et par dage ved 4 ° C.</li>
		<li>Fjerne ½ MS medium i hver brønd og direkte tilsættes 300 µL af opløsningen CuAAC pr. brønd med en mikropipette.</li>
		<li>Blidt røre pladen på et rysteapparat i 1 timer i mørke ved stuetemperatur.</li>
		<li>Fjerne den CuAAC løsning ved hjælp af en mikropipette.</li>
		<li>Med en mikropipette, tilsættes 500 µL af ½ MS, rør rundt i mørke i 10 min. derefter fjerne denne vask løsning. Gentag to gange.</li>
		<li>Tilsættes 500 µL af 7:3 MeOH/vand opløsning, rør i mørke for 1 h derefter fjerne løsningen Forsigtig: Methanol er giftigt ved kontakt med huden eller ved indånding, og er udpeget som et humant carcinogen. Dens udnyttelse kræver kemiske fume emhætter og handsker.</li>
		<li>Tilsættes 500 µL af ½ MS, rør rundt i mørke i 10 min. derefter fjerne løsningen. Gentag 4 gange.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montering af prøver på mikroskop Slides
<ol><li>Sted 5 dråber montering medium på en glas objektglas.</li>
	<li>Deponere omhyggeligt hver HAZ/GALKmarkeret tværsnit på diaset.</li>
	<li>Anvende neglelak på to modsatte sider af dias.</li>
	<li>Dække diaset med en coverslip. Vær omhyggelig med at undgå luftbobler.</li>
	<li>Fjern overskydende montering medium ved hjælp af en køkkenrulle.</li>
	<li>Forsegle prøven med neglelak på alle 4 sider. Lad negle lak tørt ved stuetemperatur (ca. 30 min.).</li>
	<li>Gentag trin 4.1-4.6 for negativ kontrol H/G tværsnit.</li>
	<li>Gentag trin 4.1-4.6 for fluorescens baggrund kontrol tværsnit.</li>
	<li>Gem dias ved 4 ° C i mørke indtil observation under en Konfokal mikroskop. Bemærk: Forberedt dias kan opbevares i flere uger til flere måneder afhængig af kvaliteten af forberedelsen. Hvis en ny observation er efter opbevaring, sikre, at prøverne ikke har tørret op.</li>
</ol>5. billede erhvervelse af fluorescens konfokalmikroskopi
<ol><li>Slå alle nødvendige enheder af konfokalmikroskopi systemet i den rigtige rækkefølge efter fabrikantens anvisninger.</li>
	<li>Vælg den ønskede målsætning med maksimal numerisk blænde og tilpasset excitations- og bølgelængder (f.eks., mål 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescence kanal: λex 405 nm, λem 450 nm /25; SPAAC HAZ kanal: λex 488 nm, λem 525 nm /25; CuAAC GALK kanal: λex 561 nm, λem 595 nm /25; sekventiel tilstand).</li>
	<li>Vælg de ønskede parametre for generation af billeder i softwaren (12 - eller 16-bit kræves, pixelstørrelse tilpasses Nyquist kriterium).</li>
	<li>Placere HAZ/GALK dias på stadiet mikroskop og Placer prøve under mål linse.</li>
	<li>Observere og find den ønskede region af plantevæv.</li>
	<li>
Erhverve høj kvalitet Konfokal billeder af dobbelt mærket HAZ/GALK prøve.
	<ol>
<li>Vælg den mest fluorescerende fly i z-aksen.</li>
		<li>Justere gevinst, forskydning og laser power at opnå optimalt signal distribution langs hele grå niveau intervallet for hver kanal (autofluorescence, HAZ og GALK). De samme parametre skal gælde for alle følgende erhvervelser.</li>
		<li>Lancere erhvervelse af det valgte billede og gemme filen. Gentag for hver relevant område af prøven. Bemærk: 3D Z-stakken rekonstruktioner kan også erhverves, hvis nødvendigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruger de samme indstillinger, erhverve billeder af ukodede prøve kun udruget i ½ MS at bestemme autofluorescence (Fluorescens baggrund kontrol som beskrevet i afsnit 2).</li>
	<li>Bruger de samme indstillinger, erhverve billeder for negative kontrolprøver inkuberes med indfødte monolignols H/G til at bestemme ikke-specifik fluorophore vedhæftning til prøven.</li>
	<li>Gælde data behandling til de erhvervede billeder at trække baggrund autofluorescence signaler i både H/G negativ kontrol billeder og HAZ/GALK billeder.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+biological+discovery.">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li><li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+in+living+systems.">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li><li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy:+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways.">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li><li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy.">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li><li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery,+architecture,+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls.">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li><li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification.">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li><li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls.">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls.">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems.">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li><li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li><li>Weng, J. -. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis.">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li><li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+lignins:+harnessing+the+plasticity+of+lignification.">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li><li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+way+for+lignin+valorisation:+recent+advances+in+bioengineering,+biorefining+and+catalysis.">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li><li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines.">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans.">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li><li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid.">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li><li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry.">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering.">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter.">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li><li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLISS:+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants.">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li><li>del R&#237;o, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Som tidligere nævnt er den dobbelte mærkning BLISS protokollen præsenteret i dette papir en af de første eksempler på en SPAAC/CuAAC kombination i vivo12,23. Hvert skridt var grundigt optimeret og valideret, og det er meget vigtigt, at den rækkefølge, hvori de to klik kemi mærkning reaktioner udføres sekventielt overholdes (dvs. SPAAC først, efterfulgt af CuAAC). Alle tværs-kontrol viste, at hver mærkning skridt er specifikke når BLISS-protokollen er anvendt23 : udføre SPAAC trin først fører til meget chemoselective mærkning af HAZ indeholder funktioner af den cyclooctyne-functionalized fluorophore gennem en [3 + 2] cycloaddition reaktion med hurtig kinetik. Når HAZ enheder er markeret, er det CuAAC skridt nødvendiggør kobber (i) katalyseret aktivering af GALK terminal Alkyner at generere triazoler links ved reaktion med indeholder-fluor 545 sonden, kan gennemføres. I kontrast, den omvendte rækkefølge (dvs. CuAAC først, efterfulgt af SPAAC) bør ikke anvendes, da det fører til GALK og HAZ enhed cross-kobling, som konkurrerer med fluorophore ligatur og inducerer en dramatisk tab af signal . Det er også vigtigt at understrege nødvendigheden af de mellemliggende vask skridt til at undgå uspecifik farvning.
Vi har vist, at vores metode kan anvendes på forskellige biologiske eksperiment designs. BLISS mærkning protokol blev første gang anvendt på Frihånd tværsnit af hør stilke (ca. 150-250 µm tykt), der tidligere blev skåret og inkuberes med klik-klar monolignols. Selv om dette design har fordelen at minimere de nødvendige mængder af kemiske reporter (som inkubation diskenheder er reduceret) og at fremme produktionen af statistiske replikater, det er ikke strengt taget en in vivo -system og i nogle tilfælde, kan ikke afspejle alle aspekter af virkelige spatio-temporal lignification dynamics. I en anden eksperimentel design tilpasset vi derfor BLISS protokol til en metode, der tidligere blev brugt til at studere indarbejdelse af radiolabeled monolignols i fyrretræ og gingko27. I denne tilgang, rødder og stængel af planten er fysisk adskilt og bunden af hele stammen er udruget i monolignol-løsningen i hvad kan blive døbt 'blomstervase' tilgang. Efter at have forladt stilke den ønskede (inkubationstiden), er tværsnit cut og BLISS protokollen udføres. Dette tillod os at vise (i) at de modificerede monolignols transporteres gennem levende stilken og er indarbejdet i voksende lignin polymerer i cellevægge og (ii) at lokalisering mønster var det væsentlige identisk med tværsnit tilgang. Denne type af eksperiment udmærker sig ved at være udført i en rigtig levende plante / levende celle tilgang tillader længere eksperimenter og mere dybtgående undersøgelser, men kræver større mængder af kemiske reporter. Endelig, BLISS protokollen blev også brugt med hørplanten frøplanter, der repræsenterer en rigtig levende plante model hvor de kemiske journalister skal blive absorberet gennem rødderne inden den transporteres op stilken. Mens denne model har den klare fordel af at være udførte i levende planter, i praksis, det er begrænset til unge frøplanter og er ikke rigtig egnet til at undersøge lignification dynamics i ældre planter af praktiske grunde (lang inkubationstid tid, forhøjet mængden af kemiske journalister). Alligevel, disse tre eksperiment designs er komplementære og alle har deres fordele og ulemper med hensyn til praktiske aspekter og biologiske betydning afhængigt af biologiske spørgsmål skal besvares.
Udviklet for at studere lignification dynamik i hør, vores protokol er yderst fleksibel, ikke kun med hensyn til biologiske eksperimentdesign, men også med hensyn til dets anvendelse til andre plante arter og organer/væv. For eksempel, kan BLISS nemt overføres til Arabidopsis eller Populus slægter, der er mere åbne over for undersøgelser med knock-out eller knock-down mutanter for forskellige gener. I princippet, kan dobbelt mærkning undersøgelser med vores tilgang også udvides til at omfatte andre biomolekyler ved hjælp af to forskellige modificerede prækursorer i plant cell wall polymerer - herunder alle tre vigtigste monolignols eller deres metaboliske prækursorer såvel som forskellige monosaccharider, der udgør matrixen polysaccharid. Siden starten, er bioorthogonal kemi faktisk hovedsagelig udviklet for at undersøge glycans/polysaccharider gennem metaboliske oligosaccharid engineering (MOE)4,5,17,28, men overraskende der har kun været meget få programmer til at plante biologi hidtil7,8,9,10,11,12. Med hensyn til foreneligheden af reaktionerne var undersøgelse af lignin faktisk en kompleks sag til at løse, som begge kemiske journalister er indarbejdet i den samme retikulerede polymer. Muligheden for uden etiket HAZ-GALK cross-link dannelse var det store problem at overvinde på grund af geografisk nærhed af GALK og HAZ enheder i 3D struktur af lignin23, en begrænsning, der ikke kan være til stede hvis de to kemiske reportere ikke er indarbejdet i den samme type for polymer eller i samme geografiske område for enhver given celle.
I et bredere anvendelsesområde kunne BLISS metode hovedsagelig anvendes på enhver tofarvede fluorescens billeddannelse undersøgelse i bakteriel eller animalske modeller ved hjælp af to forskellige kemiske reportere forsynet med en indeholder og terminal alkyn tag, henholdsvis.

I de seneste to årtier fremstod kemiske reporter strategi som en kraftfuld to-trins metode til at undersøge den dynamik og funktioner af ikke-genetisk kodet biomolekyler. 1 , 2 , 3 i denne strategi en syntetisk analog af biomolekyle af interesse med et lille graduering- kemiske reporter – først metaboliseres af den levende organisme, og derefter en kemisk sonde (fx., en fluorophore til fluorescens Konfokal mikroskopi imaging) er kovalent kædet sammen indarbejdet reporter via bioorthogonal Klik kemi. Sonden skal reagere hurtigt og specielt med den indførte kemiske modifikation samtidig være inert til enhver biomolekyler i det levende system. På mange måder overvinder denne metode begrænsningerne af almindelige bioconjugation teknikker ved hjælp af meget specifikke Klik kemi ligations hvilket giver mulighed for at spore metabolitter eller biomacromolecules, der var tidligere utilgængelige i levende systemer4,5,6.
Trods den hurtig voksende popularitet af denne kraftfuld metode i bakteriel og animalske celler er rapporter, der beskrev dets anvendelse i Plantebiologi overraskende få og langt imellem7,8,9,10, 11,12. Vi var især interesseret i at anvende denne strategi i planterne at studere dannelsen af lignin, en af de mest udbredte Biopolymerer på planeten og en større komponent af lignocellulose biomasse. 13 , 14 lignin er et phenolforbindelser polymer, der spiller en afgørende strukturel og beskyttende rolle i udvikling og liv i højere planter.
Det generelt består af tre 4-hydroxyphenylpropanoid fraspaltning: H (p- hydroxyphenyl), G (guaiacyl) og Sørensen (syringyl) enheder henholdsvis stammer fra tre 'monolignols' (p- coumaryl, coniferyl og sinapyl alkoholer), der syntetiseres via phenylpropanoid vej i cytoplasma af celle (figur 1). Efter eksporteres til cellens væg, monolignols oxideres til radikaler af peroxidases eller laccases efter som de undergår rent kemisk radikale koblingsreaktioner at polymerisere på lignin polymerer, en proces, der kaldes lignification. 15 , 16 selv om Arabinose kraftigt påvirker den industrielle revalorisering af mange plante-afledte produkter, det videnskabelige samfund har stadig en lang vej at gå for at dechifrere de indviklede mekanismer, der regulerer lignification.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Figur 1: lignification processen på planteceller. Monolignols er biosynthesized fra phenylalanin i cytosol. Efter eksporteres til cellens væg, monolignols oxideres til radikaler af peroxidases eller laccases efter som de undergår rent kemisk radikale koblingsreaktioner at polymerisere på lignin polymerer, en proces, der kaldes lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Selv om rapporterne om brug af bioorthogonal reaktioner glycan analyse er talrige,2,3,17 deres applikationseksempler til andre typer af biomolekyler er færre. Brug af bioorthogonal kemi til lignin bioimaging formål var først for nylig pioneered af Tobimatsu et al. 8 i Arabidopsis thaliana at give oplysninger om integreringen af coniferyl alkohol surrogater i lignin polymer hvor det danner G enheder,8,9 således demonstrere proof of concept, kemiske reporter strategier er relevant i denne sammenhæng. Brugen af CuAAC blev også illustreret ved hjælp af en anden coniferyl alkohol afledede et par måneder senere af Bukowski mfl. 9 men lignin også indeholder H og S enheder og en dybere forståelse af lignification-processen kræver mere viden om, hvordan alle monolignols er indarbejdet i polymeren og hvilke faktorer kan kontrollere dens sammensætning. Nye fremskridt inden for dette felt afhænger i øjeblikket udvikling af effektive metoder til at spore flere kemiske reportere samtidigt i levende systemer. Selvom et par artikler om glycans har lagt grundstenen i de seneste år18,19,20,21,22, dobbelt mærkning tilgange er fortsat en stor udfordring i bioorthogonal kemi. Hvis en reproducerbar mærkning af enkelt klik protokol er svært at udvikle, derefter dobbelt mærkning tilgange, der kræver optimering i tandem af to gensidigt er kompatible bioorthogonal reaktioner på to separate kemiske journalister endnu sværere. De få eksempler, der var pioner for dette aspekt anvendes en kombination af stamme-forfremmet indeholder-alkyn cycloaddition (SPAAC) og Alken-tetrazine inverse elektroniske efterspørgsel Diels-elletræ (DAinv) reaktioner til at studere glycans i animalske celler. Men vi troede, at bioorthogonality af DAinv reaktionen ikke kunne garanteres i dette program på grund af de strukturelle egenskaber af lignin (som består af elektron-rige substituerede cinnamyl-type monomerer, der kan reagere med elektron-fattige Diener såsom tetrazine sonder anvendes i DAinv reaktioner) og at dette kan generere non-specifik mærkning. Desuden DAinv reaktion kræver kemiske håndtag, som er syntetisk vanskelige adgang, samt at være voluminøse og lipofile derved øge muligheden for at satsen for iblanding, transport og/eller lokalisering af kemiske reporter i vivo kan blive påvirket. Da vi mente, at det sidstnævnte aspekt særlig relevant for en klik kemi tilgang til at studere lignification, vi valgte en anden retning og udviklet en Bioorthogonal ligatur Imaging sekventielle strategi (LYKSALIGHED) ved hjælp af en kombination af Strain-Promoted indeholder-alkyn Cycloaddition (SPAAC) og kobber katalyseret indeholder-alkyn Cycloaddition (CuAAC) in vivo. 23
Disse to reaktioner er faktisk de to vigtigste bioorthogonal Klik reaktioner, der har været anvendt til dato, og især i de få eksempler på lignin imaging, blev for nylig offentliggjort. 8 , 9 vores dobbelt mærkning strategi muliggør brug af en indeholder gruppe på én monolignol reporter og en terminal alkyn på den anden side to kemiske håndtag, der er i) ureaktivt mod biologisk relevante strukturer og ii) meget lille i størrelse (figur 2 ). Som følge, virkningen af disse syntetiske ændringer på de fysisk-kemiske egenskaber af biomolekyle under undersøgelse er minimeret dermed reducere eventuelle uoverensstemmelser mellem de unaturlige og naturlige monolignol substrater med hensyn til transport og metabolisme priser under trinnet metaboliske indarbejdelse. Selv om kombinationen af SPAAC og CuAAC synes meget intuitive ved første øjekast, er det til vores viden kun det andet eksempel af dobbelt mærkning ved hjælp af denne strategi og den første ansøgning om strukturer end glycans. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Figur 2: LYKSALIGHED dobbelt mærkning strategi. Kemiske reportere HAZ og GALK er mærket analoger af de indfødte H og G monolignols. De indgår først i de voksende lignin polymerer af cellevægge af eksogen fodring (trin 1). Cyclooctyne - og indeholder-functionalized fluorescerende sonder er derefter sekventielt forbundet til de indbyggede journalister ved bioorthogonal Klik kemi: SPAAC reaktion (trin 2) er meget specifik i HAZ enheder og efterfølges af en CuAAC reaktion ( trin 3) der er specifikke for GALK enheder (trin 3), således at de specifikke lokalisering af begge journalister uafhængigt i samme prøve. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Vi først udviklet og valideret indeholder-markeret monolignol reporter HAZ (surrogat p- coumaryl alkohol) og forløber lignin H enheder og derefter udtænkt den LYKSALIGHED dobbelt mærkning strategi, hvor det bruges sammen med den tidligere rapporteret alkyn-tagged GALK,9 (surrogat coniferyl alkohol) og forløber lignin G enheder. I denne reproducerbare protokol udviklet og testet i hør, er en økonomisk vigtige plantearter, dobbelt metaboliske indarbejdelse af HAZ og GALK i lignin først opnået inden sekventielle SPAAC/CuAAC mærkning. Her, er tagged HAZ enheder først specielt mærket via SPAAC ligatur af en cyclooctyne-functionalized fluorophore, efterfulgt af CuAAC-medieret ligatur af en anden fluorescerende sonden på mærket GALK enheder. Denne metode blev brugt til at undersøge dynamikken i lignification processer inden for plante cellevægge og kan blive anvendt i vivo at dæmme op for tværsnit, bor stængler samt frøplanter af forskellige plantearter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% sodium hypochlorite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm high glass tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Schott glass bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/6-TAMRA-PEG3-Azide</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-AZ109-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheese cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost containing clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coniferyl alcohol (G)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MFCD00002922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-A127-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1,5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flax seeds (L. usitatissimum L.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G&#8482; Slide Mounting Medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF-Plant Climatics</td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Angelantoni Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta plant culture box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old seedling culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaryl alcohol (H)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>FC145653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical support</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for liquid and solid &#189; MS medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

Lignin er en af de mest udbredte Biopolymerer på planeten og en større komponent af lignocellulose biomasse. Denne phenol polymer spiller en afgørende strukturel og beskyttende rolle i udvikling og liv i højere planter. Selv om de indviklede mekanismer regulere lignification processer i vivo kraftigt påvirker den industrielle revalorisering af mange plante-afledte produkter, har det videnskabelige samfund stadig en lang vej at gå for at dechifrere dem. I en enkel tre-trins arbejdsproces giver dobbelt mærkning protokollen præsenteres heri bioimaging undersøgelser af aktivt lignifying zoner af plantevæv. Det første trin består i den metaboliske indarbejdelse af to uafhængige kemiske reportere, surrogater af de to oprindelige monolignols, der giver anledning til lignin H - og G-enheder. Efter iblandingen i voksende lignin polymerer, er hver reporter derefter specielt mærket med sin egen fluorescerende sonde via en sekventiel kombination af bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klik reaktioner. Kombineret med lignin autofluorescence, denne metode fører til, at generation af trefarvet lokalisering kort over lignin inden for plante cellevægge Konfokal Fluorescens mikroskopi og giver præcis geografisk information om tilstedeværelsen eller fraværet af aktive lignification maskiner på omfanget af plantevæv, celler og forskellige cellevæg lag.

Klik på kemi ved hjælp af præsenteres BLISS protokollen vedrørende syntetiske monolignol analoger og bioorthogonal, er det muligt at visualisere dynamikken i lignification processen i levende planter. I modsætning til etablerede teknikker for lignin mål visualisering (såsom histokemiske farvning, immunolocalization eller autofluorescence), dette 'dobbelt klik' protokollen udelukkende lignin produceret de novo under den metaboliske iblanding trin og adskiller den fra de allerede eksisterende lignin i eksemplet med triple-kanal cellulære billeddannelse af Konfokal Fluorescens mikroskopi (figur 3). H AZ-enheder registreres ved hjælp af excitations- og bølgelængder af DBCO-PIND4-5/6-carboxyrhodamine 110, der er specifikt klikkede ind på indeholder funktioner indarbejdet HAZ molekyler i SPAAC trin (λex 501 nm /λem 526 nm-, grøn kanal), mens GALK-enheder registreres ligeledes på de karakteristiske bølgelængder af den azidefluor 545 sonde, der er specifikt klikkede ind på indarbejdet terminal alkyn tags af G ALK under CuAAC trin (λex 546 nm /λem 565 nm, rød kanal); den tredje kanal svarer til allerede eksisterende lignin, der påvises ved hjælp af dens iboende autofluorescence ved 405 nm (blå kanal). Denne fremgangsmåde fører til generation af trefarvet lokalisering maps af lignin inden for plante cellevægge, der leverer præcis geografisk information om tilstedeværelsen eller fraværet af aktive lignification maskiner mellem forskellige væv i et organ (figur 3A ), mellem forskellige celletyper inden for den samme væv (figur 3B-C) og inden for forskellige muren lag af den samme celle (figur 3D). Med andre ord, tillader denne metode os at fremhæve og specifikt lokalisere 'aktive' lignification sider (HAZ og GALK kanaler) ved at differentiere dem fra zoner hvor lignin blev dannet på et tidligere udviklingstrin plante (autofluorescence kanal). Derudover følsomheden af teknikken er dramatisk forbedret i forhold til autofluorescence, og meget mindre mængder af frisk syntetiserede lignin kan blive opdaget (figur 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Figur 3: Imaging af indarbejdet monolignol kemiske journalister i hør stængler. (A) halvdelen af en håndlavet tværgående del af en hør stilk, rekonstruerede billede. (B) Næroptagelse af de første lag af at differentiere vedvævet. Venstre panel: lignin autofluorescence (blå, 405 nm), midterste panel: fusioneret lignin autofluorescence (blåt) og HAZ fluorescens (grøn, 526 nm) kanaler, højre panel: fusioneret lignin autofluorescence (blå) og GALK fluorescens (rød, 565 nm) kanaler. Pilen angiver den første mærket cellevæg fra cambium illustrerer den øget følsomhed af BLISS sammenlignet med autofluorescence. (C) mærkningsbestemmelserne i forskellige celle typer af sekundære vedvævet og (D) tæt op på sekundære vedvævet celler illustrerer de mærkning variationer i forskellige lag af den samme cellevæg. Venstre panel: fusioneret lignin autofluorescence (blåt) og HAZ fluorescens (grøn, 526 nm) kanaler, midterste panel: fusioneret lignin autofluorescence (blå) og GALK fluorescens (rød, 565 nm) kanaler, ret panel: fusioneret lignin autofluorescence (blå), HAZ (grøn) og GALK (rød) Fluorescens kanaler. HAZ og GALK Co lokalisering er afbildet i gul. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Kemiske reporter strategier såsom metoden BLISS præsenteres her eller single-mærkning procedurer tidligere udgivet af Tobimatsu et al. 8 kan derfor tillade en meget finere undersøgelse end tidligere tilgængelige metoder såsom immuno- eller histokemiske farvning samtidig være meget enkle at gennemføre. For eksempel, figur 4 illustrerer at signal intensitet HAZ/GALK indarbejdelse i fiber trakeiderne/fartøjer (FT) af den hør sekundære vedvævet er meget høj i de første par cellevægge fra cambium men gradvis aftager i ældre celler. Denne profil er modsat, at af autofluorescence og angiver den maksimale lignification nås meget hurtigt i de første to til tre FT cellelag fra cambium. Derimod ray (R) celler ser ud til at fortsætte lignification til meget senere faser af deres udvikling som HAZ/GALK indarbejdelse er langt mere konstant i væggene i alle cellerne hos cambium sagopalmer. Det er ikke overraskende, at FT og R celletyper vise kontrast lignification dynamics, da disse celletyper har forskellige biologiske roller med tilhørende forskelle i deres udviklingsmæssige program. FTs er nemlig aflangt rør, der modnes og dø hurtigt, forlader døde tomme celler med tykke lignificerede mure, som spiller afgørende roller i både mekanisk støtte og lodret transport af vand og mineraler, mens de smalle rækker af R celler, komponere i vedvævet stråler er i live i deres modne og funktionelle tilstand uden at have tykke lignificerede vægge.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Figur 4: celle-specifikke monolignol reporter indarbejdelse i hør vedvævet. Bright-felt Konfokal mikroskopi Se (A) en del af en frihånd tværsnit fra en hør stilk. Pink (ray parenkym celler, R) og gul (fiber tracheid celler, FT) pilene indikerer vektorer, der strækker sig fra den cambial zone mod sagopalmer og scannet for lignin autofluorescence ved 405 nm (B), HAZ fluorescens på 526 nm (C) og G ALK fluorescens ved 565 nm (D). (E) visning af den sekundære vedvævet. Venstre panel: fusioneret lignin autofluorescence (blå), HAZ (grøn) og GALK (rød) Fluorescens kanaler. HAZ og GALK Co lokalisering er afbildet i gul. Højre panel: skematisk illustration af den sekundære vedvævet struktur i hør stilken. V, fartøjet; FT, fiber tracheid; Rasmussen, ray parenkym celle. Dette tal er blevet ændret fra løve et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Desuden giver brug af to adskilte kemiske reportere svarer til H - og G-enheder med to bioorthogonal reaktioner i BLISS-protokollen mere kvantitative resultater opnås. Multipleksede mærkning strategier såsom BLISS kunne give yderligere indsigt om kontrol med monolignol indarbejdelse nøgletal i forskellige betingelser og kan bidrage til afkodning af den undvigende lignification proces. Hvis de relative procentdele af H, G og S monolignols i Arabinose er faktisk meget forskellige arter, væv, alder eller miljømæssige forhold af anlægget, er de indviklede mekanismer, der regulerer denne sammensætning stadig ikke helt forstået. Den dobbelte mærkning teknologi repræsenterer en kraftfuld måde at undersøge nogle af de parametre, der regulerer lignin sammensætning. For eksempel, varierende HAZ: GALK forholdet med BLISS tillod os at vise, at lignin sammensætning i sekundære vedvævet væv er direkte afhængig af monolignol tilgængelighed inden for cellevægge, snarere end på peroxidase/laccase specificitet (figur 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Figur 5: Effekten af inkubere hør stængel dele med forskellige procentdel ratio af HAZ og GALK. HAZ: GALK% nøgletal er givet ovenfor hver kolonne af tal. Top: fusioneret HAZ og GALK kanaler. Bund: histogrammer viser gennemsnitlige fluorescens intensiteten af HAZ og GALK for forskellige % nøgletal. Værdier udtrykkes som gennemsnittet af de gennemsnitlige fluorescens intensitet i grå niveauer ± SD. skala bar = 100 µm. dette tal er blevet ændret fra løve et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Hør er vokset til sin bast fibre (BF), der anvendes til fremstilling af tekstiler, luksus aviser eller miljøvenligt kompositmateriale. Et vigtigt aspekt af deres industrielle valorisering er, at de indeholder meget lave niveauer af lignin i deres cellevægge, som er karakteriseret ved en ekstremt tyk S2/G sekundære lag19,24. BLISS kan fremhæve lignification dynamics forskelle mellem de forskellige lag af den samme cellevæg. Figur 6A viser, at HansenAZ og GALK reporter indarbejdelse er begrænset til Cellehjørner og midterste plade/primære cellevæg af nogle men ikke alle bast fibre. Den totale mangel på lignification i tyk bast fiber secondary celle laget, selv når monolignol kemiske reportere er eksogent leveres afslører, at deres hypolignified tilstand skyldes fraværet af en molekylær miljø egnet til enzymatisk medierede oxidation og indarbejdelse af monolignols i en voksende polymer kæde, og at det ikke er bare på grund af transkriptionel regulering af monolignol biosyntesen gener som tidligere rapporteret25. Denne observation korrelerer også godt med faktum, at hør peroxidase gener er op-reguleret i de ydre stammen væv af hør kemiske lbf1 mutant, der besidder lignificerede bast fibre26.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Figur 6: BLISS fremhæver cellevæg underkonstruktionen eller lag specifikke forskelle. (A) venstre panel: lysfelt billede af en hør stilk sektion. Cirklen angiver en fiber bundt. Højre panel: tæt op på bast fibre. Flettet HAZ og GALK kanaler (med og uden lys-felt) viser, at lignification er begrænset til Cellehjørner (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) og midterste plade/primære cellevæg af nogle bast fibre. BF, bast fibre; PARI, parenkym celle; Møller, midterste plade; Pedersen, primære cellevæg; S1, første lag af sekundære cellevæg; S2/G, sekundære lag/geléagtige lag af sekundære cellevæg. (B) 2D skive og 3D rekonstruktion af Konfokal z-stakken zoom af hør root endodermis region. Casparian strip (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) kun viser autofluorescence og ikke indarbejde HAZ eller GALK. Den tilknyttede fluorogram viser en GALK/HAZ anti-korrelation: høje grønne Fluorescens er knyttet til lav røde signal (cortex) og vice-versa (endodermis). Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Endelig, denne to-farve metode kan også give værdifuld information på tilstanden' lignification' af cellevæggen delstrukturer, på forskellige udviklingsstadier og i anlæg organer end stilken. For eksempel er endodermis hør rødder karakteriseret ved eksistensen af et Casparian band i dets radial og tværgående cellevægge i de tidlige faser af udvikling. Dette band af hydrofobe polymer, fremstillet af suberin eller lignin, forhindrer vand og opløste stoffer tages op af roden fra indtastning passivt gennem apoplast og tvinger dem til at passere gennem plasma-membran via en symplastisk rute dermed bidrage til den selektiv optagelse kapacitet af planternes rødder. Når de påføres hør rødder, viste vores strategi, at HAZ og GALK er indarbejdet i de tangerer vægge af endodermal celler såvel som dele af de radiale vægge hvor Casparian band er fraværende (figur 6B). Dog angiver totalt fravær af monolignol reporter indarbejdelse i Casparian bandet selv, at det er modne på denne udviklingsstadiet mens de andre mure er stadig stedet for yderligere polymer deposition. Den rekonstruerede 3D-visning af en z-stak klart bringer Casparian band til lys. Interessant, væggene i nogle kortikale celler støder op til endodermis også viste sig i stand til at indarbejde HAZ fortrinsvis (dermed indikerer tilstedeværelsen af lignin/suberin i hør root cortex) men ikke GALK. Co lokalisering analyse viste en anti-korrelation mellem HAZ og GALK, der antyder eksistensen af celle-specifikke væg struktur/enzymatisk maskiner i disse to tilstødende celletyper.
Supplerende tabel 1: forberedelse af solid ½ MS Medium <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 2: forberedelse af kemiske reporter stamopløsninger <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, en dobbelt mærkning protokol for at studere lignification dynamics, blev udviklet. Ved hjælp af syntetiske monolignol Klik journalister og en sekventiel kombination af SPAAC og CuAAC bioorthogonal reaktioner, denne metode baner vejen for en dybdegående analyse af de faktorer, der regulerer Biogenese Arabinose i planta.

Visualisere Lignification Dynamics i planter med Klik på kemi: dobbelt mærkning er LYKSALIGHED!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kvantitative Proteomics anvendelse af reduktiv Dimethylation for mærkning med stabile isotoper

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Optrevling Entropiske Rate Acceleration induceret af Solvent Dynamics i Membrane Enzymer

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

Køling Rate Afhængige ellipsometri Målinger Bestem dynamikken i Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Kontinuert Flow kemi: Reaktion af Diphenyldiazomethane med p- Nitrobenzoic syre

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Sondering struktur og dynamik Interfacial vand med Scanning Tunneling Mikroskopi og spektroskopi

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Co udtryk for flere kimære fluorescerende Fusion proteiner på en effektiv måde i planter

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

Nye teknikker til at observere strukturdynamik Photoresponsive flydende krystaller

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...