Name: visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Vi står i gjeld til forskning Federation FRABio og TisBio tenkelig plattformen (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des samlinger Biomoléculaires) for å gi teknisk miljø bidrar til å oppnå dette arbeid.

Merk: Flytende og fast ½ MS media må være forberedt på forhånd som beskrevet i supplerende tabell 1.
1. plant kultur
<ol><li>
Kultur for 2 måneder gammel Lin planter
	<ol>
<li>Så Lin (Linum usitatissimum L.) frø i plast potten med potting kompost.</li>
		<li>Vokse Lin i vekst kammer på 22 ° C med en fotoperiode av 16 h/8 h dag/natt.</li>
		<li>Utstyre planter med vertikal støtte etter 1 måned og vokse til de er 2 måneder gammel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur av 2 uke gamle Lin frøplanter
	<ol>
<li>Pakk 12 flax frø i en stykke ost klut og fikse med en gummi band å en bunt. Merk: Utføre de neste trinnene under sterile forhold under laminær strømning avtrekksvifte.</li>
		<li>Plass frø bunt i en glassflaske for tidligere autoklaveres 250 mL.</li>
		<li>Legge til 70 mL 70% EtOH i flasken og forsiktig røres i 1 minutt.</li>
		<li>Nøye fjerne EtOH ved decantation mens bunt i flasken.</li>
		<li>Legge til 100 mL 2% natriumhypokloritt og røres forsiktig i 10 min.</li>
		<li>Fjerne natriumhypokloritt løsningen ved decantation mens bunt i flasken.</li>
		<li>Gjenta trinn 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>Legge til 100 mL steril ultrapure vann og røres i 1 minutt.</li>
		<li>Gjenta trinn 1.2.8 3 ganger, på å øke skyllingsprosess tiden for hver skylling (5, 10 og 15 min).</li>
		<li>Varm solid ½ MS medium, hell den i et sterilt anlegget kultur boks til en høyde på 2 cm og la den avkjøles før størkning.</li>
		<li>Delikat plassere hvert frø på solid mediet bruker sterilt tang.</li>
		<li>Lukke sterilt.</li>
		<li>Overføre boksen til en vekst kammer på 22 ° C med en fotoperiode av 16 h/8 h dag/natt og vokse Lin seedlings i 2 uker.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metabolske innlemmelse av kjemiske journalister
Merk: Tre eksperimentelle modeller presenteres nedenfor: i) metabolske merking av stammen tverrsnitt, ii) hele stammer og iii) plante planter. Hver protokoll er presentert for en biologisk replikere og mengder kan tilpasses antall nødvendige biologiske gjentak. Monolignol løsninger er forberedt fra lager løsninger som er laget som beskrevet i tabell 2 før eksperimentet. Lager løsninger kan lagres flere måneder på 20 ° C. Den HAZ: GALK eller H:G proporsjoner kan justeres for å passe alle skreddersydd eksperimentell design.
<ol><li>Kjemisk reporter innlemmelse i 2 måneder gammel Lin stilk tverrsnitt
	<ol>
<li>Forberede en 300 µL kjemiske reporter løsning som inneholder 10 µM av GALK og 10 µM av HAZ i flytende sterilt ½ MS medium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK løsning og overføre den til en brønn av en 48-vel plate med brønnene.</li>
		<li>Forberede en 300 µL negativ kontrolløsning som inneholder 10 µM g og 10 µM h i flytende sterilt ½ MS medium.</li>
		<li>Vortex H/G av løsningen og overføre den til en ny brønn av samme 48-vel plate.</li>
		<li>Kuttet stammen av en 2 måneder gammel Lin anlegg på 10 cm over jord nivå ved hjelp av en ny barberblad.</li>
		<li>Delikat forberede 50 Frihånd tverrgående tverrsnitt av stammen bruker barberblad (ca 150-250 µm tykk).</li>
		<li>Umiddelbart plassere tverrsnitt i flytende sterilt ½ MS medium i en se glass.</li>
		<li>Visuelt inspisere og velg intakt hele tverrsnitt og tilfeldig distribuere 10 av dem i godt fylt med HAZ/GALK løsning.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.1.8 for godt fylt med H/G løsning (som negativ kontroll).</li>
		<li>Gjenta trinn 2.1.8 for tredje godt fylt med 300 µL av ½ MS medium (som bakgrunn kontroll som justerer grunnlinjen fluorescens under etterfølgende data behandling av AC confocal mikroskopi bilder).</li>
		<li>Inkuber platen i kontinuerlig lys i en vekst kammer ved 20 ° C i 20 h.</li>
		<li>Fjern monolignol løsningen i hver brønn med brønnene.</li>
		<li>Legge til 500 µL av ½ MS medium i hver brønn, røres forsiktig i 10 min og fjerne dette skylling løsning med brønnene. Gjenta 4 ganger og videre til BLISS merking umiddelbart (del 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Kjemisk reporter innlemmelse i 2 måneder gammel Lin hele stammer
	<ol>
<li>Forbered en 5 mL kjemiske reporter løsning som inneholder 10 µM av GALK og 10 µM av HAZ i flytende sterilt ½ MS medium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK løsning og overføre det til en 20-cm høye glass test rør med en pipette.</li>
		<li>Forbered en 5 mL negativ kontrolløsning som inneholder 10 µM g og 10 µM h i flytende sterilt ½ MS medium.</li>
		<li>Vortex H/G av løsningen og overføre det til en 20-cm høye glass test rør.</li>
		<li>Forberede en tredje test røret som inneholder 5 mL av ½ MS medium (som bakgrunn kontroll som justerer grunnlinjen fluorescens under etterfølgende data behandling av AC confocal mikroskopi bilder).</li>
		<li>Kuttet stammen av en 2 måneder gammel Lin anlegg på 10 cm over jord nivå ved hjelp av en ny barberblad. Forkaste rotsystem og nedre del av stilken og videre til neste trinn med den øvre delen av anlegget stammen.</li>
		<li>Senk bunnen av hele kuttet stammen i røret som inneholder HAZ/GALK løsning. Plass stammen i sin inkubasjon løsning umiddelbart etter fjerning av root-systemet for å hindre det tørker. Merk: Hvis metoden brukes til yngre/eldre planter og/eller andre arter, volumet av monolignol løsninger må justeres i henhold til størrelsen / alder av anlegget og diameteren på sin stamme.</li>
		<li>Fest stammen til en vertikal støtte for å holde den rett.</li>
		<li>Forsegle glassrør med parafilm å unngå fordampning av løsningen.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.2.6-2.2.9 for negativ kontroll prøven med H/G av løsningen.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.2.6-2.2.9 for fluorescens bakgrunn kontroll prøven som inneholder ½ MS medium.</li>
		<li>Inkuber hver stamme på 20 h i kontinuerlig lys med neonlyset.</li>
		<li>Etter 20 h metabolske selskap, fjerne stammen ruges i HAZ/GALK løsning og skyll den med ½ MS medium.</li>
		<li>Kuttet og forkaste nederste 1 cm av stammen med et barberblad og deretter forberede en 1 cm høy sylinder fra bunnen av gjenværende stammen.</li>
		<li>Nøye forberede 20 Frihånd tverrgående tverrsnitt (ca 150-250 µm tykk) fra denne sylinder og plassere dem umiddelbart i en se glass fylt med ½ MS medium.</li>
		<li>Sett 500 µL av ½ MS medium i en brønn av en 48-vel plate.</li>
		<li>Visuelt inspisere og velg intakt hele tverrsnitt og tilfeldig distribuere 10 av dem i brønnen fylt med ½ MS løsning.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.2.13-2.2.17 for negativ kontroll stammen inkubert med H/G løsning.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.2.13-2.2.17 for fluorescens bakgrunn kontroll stammen inkubert med ½ MS medium.</li>
		<li>Nøye fjerne løsningen i hver brønn med brønnene.</li>
		<li>Legge til 500 µL av ½ MS medium i hver brønn, røres forsiktig i 10 min og fjerne dette skylling løsning med brønnene. Gjenta 4 ganger og videre til BLISS merking umiddelbart (del 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Kjemisk reporter inkorporering 2 uke gamle Lin seedlings Merk: Følgende er alle gjennomført under sterile forhold.<ol>
<li>Forberede en 2 mL kjemiske reporter løsning som inneholder 10 µM av GALK og 10 µM av HAZ i flytende sterilt ½ MS medium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK løsning og overføre det til en 20 cm høye glass test rør med en pipette.</li>
		<li>Forberede en 2 mL negativ kontrolløsning som inneholder 10 µM g og 10 µM h i flytende sterilt ½ MS medium.</li>
		<li>Vortex H/G av løsningen og overføre det til en 20 cm høye glass test rør.</li>
		<li>Forberede en tredje 20-cm høye glass reagensglasset med 2 mL ½ MS medium (som bakgrunn kontroll som justerer grunnlinjen fluorescens under etterfølgende data behandling av AC confocal mikroskopi bilder).</li>
		<li>Delikat fjerne en 2-uke-gamle Lin frøplante fra solid ½ MS mediet med en lang pinsett (delen 1.2. over).</li>
		<li>Forsiktig overføre frøplante til røret som inneholder HAZ/GALK løsning, sikre at røttene er nedsenket i løsningen.</li>
		<li>Lukk glassrør med plasthetten å unngå fordampning.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.3.6-2.3.8 for negativ kontroll røret med H / G av løsningen.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.3.6-2.3.8 for fluorescens bakgrunn kontroll røret som inneholder ½ MS medium.</li>
		<li>Inkuber hver frøplante i kontinuerlig lys i en vekst kammer for 20t på 20 ° C.</li>
		<li>Delikat fjerne frøplante ruges i HAZ/GALK løsning og skyll den med ½ MS medium.</li>
		<li>Delikat forberede 20 Frihånd tverrsnitt (approximatively 150-250 µm tykk) av hypocotyl.</li>
		<li>Sett 500 µL av ½ MS medium i en brønn av en 48-vel plate.</li>
		<li>Visuelt inspisere og velg intakt hele tverrsnitt og tilfeldig distribuere 10 av dem i brønnen fylt med ½ MS løsning.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.3.12-2.3.15 for negativ kontroll frøplante inkubert med H/G løsning.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.3.12-2.3.15 for fluorescens bakgrunn kontroll frøplante inkubert med ½ MS medium.</li>
		<li>Nøye fjerne løsningen i hver brønn med brønnene.</li>
		<li>Legge til 500 µL av ½ MS medium i hver brønn, røres forsiktig i 10 min og fjerne dette skylling løsning med brønnene. Gjenta 4 ganger og videre til BLISS merking umiddelbart (del 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. dobbel fluorescens merking av anlegget tverrsnitt prøver av SPAAC og CuAAC
NOTE Det lykke merking protokollen er identiske for alle 3 eksperimentelle modeller (inndeling 2).
<ol><li>
Belastning forfremmet merking Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC)
	<ol>
<li>Forberede 1 mL av en SPAAC løsning som inneholder 5 µM DBCO-pinne4-5/6-carboxyrhodamine 110 i flytende sterilt ½ MS medium. Vortex løsningen og holde den i mørket.</li>
		<li>Etter siste vask trinnene av metabolske innlemmelse protokollen [2.1.13, 2.2.21 eller 2.3.19 avhengig av den valgte eksperimentell designen], fjerne ½ MS mediet og legger 300 µL SPAAC løsningen per godt med brønnene.</li>
		<li>Skjerme 48-vel platen fra lys dekker med aluminiumsfolie eller ved å plassere den i en boks.</li>
		<li>Forsiktig røre platen på en mekanisk shaker 1t i mørket ved omgivelsestemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kobber-katalysert merking Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC)
	<ol>
<li>Vask hver også 4 ganger som beskrevet i trinn 2.1.13 mens platen i mørket.</li>
		<li>Forberede 1 mL av en CuAAC løsning som inneholder 2,5 natrium ascorbate, 0,5 mM CuSO4 og 5 µM 5-TAMRA-pinne3-azide i flytende sterilt ½ MS medium. Vortex løsningen og holde den i mørket. Merk: Denne CuAAC løsningen må være nylagde før bruk og kan ikke lagre mer enn noen få dager på 4 ° C.</li>
		<li>Fjern ½ MS mediet i hver brønn og legge til 300 µL CuAAC løsningen per godt med brønnene.</li>
		<li>Forsiktig røre platen på en mekanisk shaker 1t i mørket ved omgivelsestemperatur.</li>
		<li>Fjerne den CuAAC løsningen ved hjelp av brønnene.</li>
		<li>Bruker brønnene, legge 500 µL av ½ MS, rør i mørket 10 min og deretter fjerne vask løsningen. Gjenta to ganger.</li>
		<li>Legge til 500 µL av en 7:3 MeOH/vann løsning, rør i mørket 1t deretter fjerne løsningen FORSIKTIG: Metanol er giftig ved hudkontakt eller innånding, og er utpekt som et menneskelig karsinogen. Dens utnyttelse krever kjemiske røyk hetter og hansker.</li>
		<li>Legge 500 µL av ½ MS, rør i mørket 10 min og deretter fjerne løsningen. Gjenta 4 ganger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montering av prøver på mikroskopet lysbilder
<ol><li>Sted 5 dråper montering mediet på en barometer microscope skyve.</li>
	<li>Innskudd nøye hver HAZ/GALKmerket tverrsnitt på lysbildet.</li>
	<li>Bruke neglelakk på to motstående sider av lysbildet.</li>
	<li>Dekk lysbildet med en dekkglassvæske. Være forsiktig for å unngå luftbobler.</li>
	<li>Fjern overflødig montering medium med tørkepapir.</li>
	<li>Forsegle prøven med neglelakk på alle 4 sider. La neglen lakk tørr ved romtemperatur (ca 30 min).</li>
	<li>Gjenta trinn 4.1-4.6 for negativ kontroll H/G tverrsnitt.</li>
	<li>Gjenta trinn 4.1-4.6 for fluorescens bakgrunn kontroll tverrsnitt.</li>
	<li>Lagre lysbilder på 4 ° C i mørket til observasjon under AC confocal mikroskop. Merk: Ferdige lysbilder kan lagres i flere uker til flere måneder avhengig av preparatet. Hvis en ny observasjon skal gjøres etter lagring, sikre at prøvene ikke har tørket opp.</li>
</ol>5. bildeopptak ved fluorescens AC Confocal mikroskopi
<ol><li>Slå på alle nødvendige enheter av AC confocal mikroskopi systemet i riktig rekkefølge i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Velg ønsket målsettingen med maksimal numeriske blenderåpning og tilpasset eksitasjon og utslipp bølgelengder (f.eks obj. 60 x, na 1.2. Autofluorescence kanal: λex 405 nm, λem 450 nm /25; SPAAC HAZ småkanal: λex 488 nm, λem 525 nm /25; CuAAC GALK kanal: λex 561 nm, λem 595 nm /25; sekvensiell modus).</li>
	<li>Velg ønsket parameterne for generering av bilder i programvaren (12 - eller 16-biters nødvendig pikselstørrelsen tilpasset Nyquist kriteriet).</li>
	<li>Plasserer HAZ/GALK lysbildet på mikroskopet scenen og plasser prøven under linsen.</li>
	<li>Observere og finne ønsket område av anlegget vev.</li>
	<li>
Hente høykvalitets AC confocal bilder av dobbelt merket HAZ/GALK prøven.
	<ol>
<li>Velg mest fluorescerende flyet i z-aksen.</li>
		<li>Justere gevinst, forskyvning og laser makt å oppnå optimal signal utbredelsesområde langs hele grå nivå området for hver kanal (autofluorescence, HAZ og GALK). De samme parameterne må brukes for alle følgende oppkjøp.</li>
		<li>Start oppkjøpet av det valgte bildet og lagre filen. Gjenta for hver relevante området av utvalget. Merk: 3D Z stabel Rekonstruksjoner kan også erverves om nødvendig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruker samme innstillinger, hente bilder av ukodede prøve bare ruges i ½ MS å fastslå hvilket autofluorescence (fluorescens bakgrunn kontroll som beskrevet i del 2).</li>
	<li>Bruker samme innstillinger, hente bilder for negativ kontroll prøvene inkubert med innfødte monolignols H/G å avgjøre ikke-spesifikk fluorophore vedheft til prøven.</li>
	<li>Bruke data behandling ervervet bildene for å trekke fra bakgrunnen autofluorescence signaler i både H/G negativ kontroll bilder og HAZ/GALK bilder.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+biological+discovery.">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li><li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+in+living+systems.">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li><li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy:+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways.">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li><li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy.">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li><li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery,+architecture,+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls.">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li><li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification.">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li><li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls.">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls.">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems.">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li><li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li><li>Weng, J. -. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis.">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li><li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+lignins:+harnessing+the+plasticity+of+lignification.">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li><li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+way+for+lignin+valorisation:+recent+advances+in+bioengineering,+biorefining+and+catalysis.">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li><li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines.">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans.">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li><li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid.">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li><li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry.">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering.">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter.">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li><li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLISS:+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants.">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li><li>del R&#237;o, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Som tidligere nevnt er dobbelt merking BLISS protokollen presenteres i dette dokumentet en av de første eksemplene på en SPAAC/CuAAC kombinasjonen i vivo12,23. Hvert trinn var grundig optimalisert og godkjent, og det er svært viktig at ordren der de to klikke kjemi merking reaksjoner utføres sekvensielt blir respektert (dvs. SPAAC først, etterfulgt av CuAAC). Alle kryss-kontroller viste at steg merking er bestemt når BLISS protokollen er anvendt23 : utfører SPAAC trinnet først fører til svært chemoselective merking av HAZ azide funksjoner av den cyclooctyne-functionalized fluorophore gjennom en [3 + 2] cycloaddition reaksjon med rask kinetics. Når HAZ enheter er kodet, kan det CuAAC trinnet nødvendiggjør copper(I) katalysert aktivering av GALK terminal alkynes til å generere triazole koblinger ved reaksjon med azide-fluor 545 proben utføres. I kontrast, omvendt rekkefølge (dvs. CuAAC først, etterfulgt av SPAAC) bør ikke brukes som det fører til GALK og HAZ kryss-kobling, som konkurrerer med fluorophore hemorroider og induserer dramatiske tap av signal . Det er også viktig å understreke nødvendigheten av mellomliggende vask trinnene for å unngå ikke-spesifikk farging.
Vi har vist at vår metode kan brukes på ulike biologisk eksperiment design. BLISS merking protokollen ble først brukt Frihånd tverrsnitt av lin stammer (ca 150-250 µm tykk) som var tidligere kuttet og inkubert med Klikk-klar monolignols. Selv om denne utformingen har fordelen av minimere nødvendig antall kjemiske reporter (som inkubasjon volumer reduseres) og tilrettelegge produksjon av statistiske gjentak, det er ikke strengt tatt et i vivo system og i noen tilfeller kanskje ikke reflektere alle aspekter av ekte spatio-temporale lignification dynamics. I andre eksperimentell design tilpasset vi derfor BLISS protokollen til en metode som tidligere ble brukt til å studere inkorporering av radiolabeled monolignols i furu og gingko27. I denne tilnærmingen, røttene og stammen av anlegget er fysisk atskilt og bunnen av hele stammen er ruges i monolignol løsningen i hva kan være kalt 'blomst vase' tilnærming. Etter forlater av stilkene ønsket (inkubasjon) tiden, er tverrsnitt kuttet og BLISS protokollen utføres. Dette tillot oss å (i) at de endrede monolignols transporteres gjennom levende stammen og er innlemmet i voksende lignin polymerer i cellen vegger og (ii) at lokalisering mønsteret var i hovedsak identisk med tverrsnitt tilnærming. Denne typen eksperiment har fortjeneste av utføres i en ekte levende anlegg / levende celle tilnærming tillater lengre eksperimenter og mer grundige studier, men krever større mengder av kjemiske reporter. Til slutt, BLISS protokollen ble også brukt av lin anlegget, som representerer en virkelig levende anlegg modell der kjemiske journalistene må bli absorbert gjennom røttene før de blir transportert opp stammen. Mens denne modellen har klar fordel av utføres i levende planter i praksis det er begrenset til unge frøplanter og er ikke veldig egnet for å undersøke lignification dynamikk i eldre planter av praktiske årsaker (lang incubation tid, opphøyet antallet av kjemiske journalister). Likevel, disse tre eksperiment design er komplementære og alle har sine fordeler og ulemper praktiske aspekter og biologisk betydning avhengig av biologiske spørsmålet må besvares.
Utviklet for å studere lignification dynamikken i Lin, våre protokollen er svært tilpasningsdyktige, ikke bare i biologisk eksperiment design, men også i sin søknad til andre plante arter og organer/vev. For eksempel kan BLISS enkelt overføres til Arabidopsis eller Populus slektene som er mer mottakelig for studier med bank-out eller sammenleggbare mutanter for ulike gener. I prinsippet kan dobbelt merking studier med vår tilnærming også utvides til andre biomolecules ved hjelp av to forskjellige endret forløpere for anlegget cellen vegg polymerer - inkludert alle tre viktigste monolignols eller metabolske forgjengere samt ulike monosaccharides som utgjør polysakkarid matrix. Siden starten, er bioorthogonal kjemi faktisk hovedsaklig utviklet for å undersøke glykaner/polysakkarider gjennom metabolske oligosaccharide engineering (MOE)4,5,17,28 men overraskende det har vært bare svært få programmer til å plante biologi så langt7,8,9,10,11,12. Inne pris av forenlighet av reaksjoner var studiet av lignin faktisk en komplisert sak å oppklare idet begge kjemiske journalister er innlemmet i den samme reticulated polymer. Muligheten for umerkede HAZ-GALK krysskobling formasjon var det stort problemet å overvinne på grunn av romlige nærheten GALK og HAZ enheter i 3D struktur av lignin23, en begrensning som ikke kan vises hvis to kjemiske journalistene ikke inkluderes i den samme typen Research eller i den samme romlige regionen i en gitt celle.
I en bredere omfang kan BLISS metodikken i hovedsak brukes til alle to farger fluorescens tenkelig studie i bakterielle eller dyr modeller med to forskjellige kjemiske journalister bærer en azide og terminal alkyne tag, henholdsvis.

De siste to tiårene, har kjemiske reporter strategien framstått som en kraftig to-trinns metode for å undersøke dynamikk og funksjoner av ikke-genetisk kodet biomolecules. 1 , 2 , 3 i denne strategien en syntetisk analog av biomolecule rundt med en liten moduleringshjul- kjemiske reporter -først metaboliseres den levende organismen, og deretter en kjemisk sonde (f.eks., en fluorophore til fluorescens AC confocal mikroskopi imaging) er covalently knyttet til innarbeidet reporteren via bioorthogonal Klikk kjemi. Proben må reagere raskt og spesielt introdusert kjemiske endringen samtidig inaktivt overfor noen biomolecules i levende system. På mange måter løser denne metoden begrensningene av vanlige bioconjugation teknikker gjennom bruk av svært spesifikke Klikk kjemi ligations og dermed gir mulighet til å spore metabolitter eller biomacromolecules som var tidligere utilgjengelige i levende systemer4,5,6.
Til tross for den rask voksende populariteten til denne kraftige metoden i bakteriell og dyreceller er rapporter beskriver bruken i anlegget biologi overraskende få og langt mellom7,8,9,10, 11,12. Vi var spesielt interessert i å bruke denne strategien i planter å studere dannelsen av lignin, en av de vanligste biopolymers på planeten og en viktig komponent i lignocellulosic biomasse. 13 , 14 lignin er en Flavanolene polymer som spiller en viktig strukturelle og beskyttende rolle i utvikling og liv for høyere planter.
Det består vanligvis av tre 4-hydroxyphenylpropanoid moieties: H (p- hydroxyphenyl), G (guaiacyl) og S (syringyl) enheter henholdsvis avledet fra tre 'monolignols' (p- coumaryl, coniferyl og sinapyl alkoholer) som er syntetisert via phenylpropanoid veien i cytoplasma i cellen (figur 1). Etter eksportert til cellen vegg, er monolignols oksidert til radikale av peroxidases eller laccases som de gjennomgå rent kjemiske radikale kopling reaksjoner på danner lignin polymerer, en prosess kalt lignification. 15 , 16 men Ligniner sterkt påvirker den industrielle valorization mange plante-avledet produkter, det vitenskapelige samfunnet har fortsatt en lang vei å gå for å dechiffrere de intrikate mekanismene regulere lignification.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Figur 1: lignification prosessen i anlegget celler. Monolignols er biosynthesized fra fenylalanin i stoffer. Etter eksportert til cellen vegg, er monolignols oksidert til radikale av peroxidases eller laccases som de gjennomgå rent kjemiske radikale kopling reaksjoner på danner lignin polymerer, en prosess kalt lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Selv om rapporter om bruk av bioorthogonal reaksjoner for glycan analyse er mange,2,3,17 deres program til andre typer biomolecules er mindre. Bruk av bioorthogonal kjemi for lignin bioimaging formål var bare nylig utviklet av Tobimatsu et al. 8 i Arabidopsis thaliana å gi informasjon om innlemmelse av coniferyl alkohol surrogater i lignin polymer danner G enheter,8,9 dermed demonstrere konseptutprøvingen som kjemisk reporter strategier gjelder i denne sammenheng. Bruk av CuAAC var også illustrert med et annet coniferyl alkohol derivat noen måned senere av Bukowski et al. 9 men lignin også inneholder H og S og en dypere forståelse av lignification krever mer kunnskap om hvordan alle monolignols er innlemmet i polymer og hvilke faktorer kan kontrollere komposisjonen. Nye fremskritt innen dette feltet er for tiden avhenger av utviklingen av effektive metoder for å spore flere kjemiske journalister samtidig i levende systemer. Selv om noen artikler på glykaner har lagt grunnlaget i årene18,19,er20,21,22, dobbelt merking tilnærminger en stor utfordring bioorthogonal kjemi. Hvis en reproduserbar single-merking Klikk protokoll er vanskelig å utvikle, deretter doble merking tilnærminger som krever optimalisering parallelt til to gjensidig er kompatible bioorthogonal reaksjoner på to separate kjemiske journalister enda vanskeligere. De få eksemplene som utviklet dette aspektet brukt en kombinasjon av belastning forfremmet azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) og alken-tetrazine omvendt elektronisk etterspørsel Diels-Alder (DAinv) reaksjoner for å studere glykaner i dyreceller. Men tenkte vi at bioorthogonality av DAinv reaksjonen ikke kan garanteres i dette programmet på grunn av strukturfunksjonene av lignin (som består av rikt substituerte cinnamyl-type monomerer som kan reagere med elektron-fattige pekere som tetrazine sonder i DAinv reaksjoner) og at dette kan generere uspesifisert merking. I tillegg DAinv reaksjonen krever kjemiske håndtakene som syntetisk vanskelig å tilgang, samt store og lipofile og dermed øke muligheten for at frekvensen av innlemmelse, transport og/eller lokalisering av kjemiske reporter i vivo kan påvirkes. Som vi vurdert at det siste aspektet var særlig relevant i en klikk kjemi tilnærming for å studere lignification, vi valgte en annen retning og utviklet en Bioorthogonal Ligation Imaging sekvensiell strategi (lykke) ved hjelp av en kombinasjonen av Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) og kobber Catalysed Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC) i vivo. 23
Disse to reaksjoner er faktisk de to viktigste bioorthogonal Klikk reaksjoner som er brukt hittil, og særlig i eksempler av lignin imaging som ble nylig publisert. 8 , 9 våre dobbel merking strategi muliggjør bruk av en azide moiety på en monolignol reporter og en terminal alkyne, to kjemiske håndtak som er i) unreactive mot biologisk relevante strukturer og ii) svært små i størrelse (figur 2 ). Som et resultat, virkningen av disse syntetiske endringer i biomolecule under studien mekanisk-egenskaper er minimert dermed redusere mulig avvik mellom unaturlig og naturlig monolignol substrater i transport og metabolization priser under metabolske innlemmelse trinnet. Selv kombinasjonen av SPAAC og CuAAC synes svært intuitivt ved første øyekast, er det vi vet bare det andre eksemplet dobbelt merking med denne strategien og den første søknaden på strukturer enn glykaner. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Figur 2: BLISS dobbelt merking strategi. Kjemisk journalister HAZ og GALK er merket analogs av den opprinnelige H og G monolignols. De er først innlemmet i de voksende lignin polymerer av cellen vegger av eksogene mate (trinn 1). Cyclooctyne - og azide-functionalized fluorescerende sonder er deretter sekvensielt samskrevet til innarbeidet journalistene av bioorthogonal Klikk kjemi: SPAAC reaksjonen (trinn 2) er svært spesifikke HAZ enheter og følges av en CuAAC reaksjonen ( Trinn 3) som er bestemt av GALK enheter (trinn 3), slik at den bestemte lokaliseringen av begge journalister uavhengig i samme utvalget. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Vi først utviklet og godkjent azide-merket monolignol reporter HAZ (surrogat p- coumaryl alkohol) og forløper lignin H enheter, og deretter utviklet av BLISS dobbel merking strategi der det brukes sammen med den tidligere rapporterte alkyne-merket GALK,9 (surrogat coniferyl alkohol) og forløper lignin G enheter. I denne reproduserbar protokollen utviklet og testet i Lin, oppnås en økonomisk viktige plantearter, dobbelt metabolske kommisjonsforordning HAZ og GALK lignin først før sekvensiell SPAAC/CuAAC merking. Her merket merket HAZ enheter først spesielt via SPAAC ligation av en cyclooctyne-functionalized fluorophore, etterfulgt av CuAAC-mediert ligation av en andre fluorescerende sonde på merket GALK enheter. Denne metoden ble brukt til å undersøke dynamikken i lignification prosesser innenfor anlegget celle vegger og kan være brukt i vivo å demme tverrsnitt, lever stammer som planter av forskjellige plantearter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% sodium hypochlorite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm high glass tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Schott glass bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/6-TAMRA-PEG3-Azide</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-AZ109-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheese cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost containing clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coniferyl alcohol (G)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MFCD00002922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-A127-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1,5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flax seeds (L. usitatissimum L.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G&#8482; Slide Mounting Medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF-Plant Climatics</td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Angelantoni Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta plant culture box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old seedling culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaryl alcohol (H)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>FC145653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical support</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for liquid and solid &#189; MS medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

Lignin er en av de vanligste biopolymers på planeten og en viktig komponent i lignocellulosic biomasse. Dette fenoliske polymer spiller en viktig strukturelle og beskyttende rolle i utvikling og liv for høyere planter. Selv om de intrikate mekanismene regulere lignification prosesser i vivo sterkt påvirke den industrielle valorization av mange plante-avledet produkter, har det vitenskapelige samfunnet fortsatt en lang vei å gå for å dechiffrere dem. I en enkel tretrinns arbeidsflyt kan doble merking protokollen presenteres her bioimaging studier av aktivt lignifying soner av anlegget vev. Det første trinnet består i metabolske inkorporering av to uavhengige kjemiske journalister, surrogater av de to opprinnelige monolignols som gir opphav til lignin H - og G-enheter. Etter innlemmelse i voksende lignin polymerer, er hver reporter deretter spesielt merket med en egen fluorescerende sonde via en sekvensiell kombinasjon av bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klikk reaksjoner. Kombinert med lignin autofluorescence, dette fører til generering av tre farger lokalisering kart av lignin innenfor anlegget cellen vegger av fluorescens AC confocal mikroskopi og gir presis romlig informasjon om tilstedeværelse eller fravær av aktive lignification maskiner i omfanget av anlegg vev, celler og ulike cellevegg lag.

Ved hjelp av presentert BLISS protokollen syntetisk monolignol analogs og bioorthogonal Klikk kjemi, er det mulig å visualisere dynamikken i lignification prosessen i levende planter. I motsetning til etablerte teknikker for lignin mål visualisering (som histochemical flekker, immunolocalization eller autofluorescence), dette "dobbel klikk" protokollen utelukkende lignin produsert de novo under metabolske inkorporering gå og skiller den fra den eksisterende lignin av utvalget med trippel kanal mobil bildebehandling av AC confocal fluorescens mikroskopi (Figur 3). H AZ-enheter registreres bruker bølgelengdene eksitasjon og utslipp av DBCO-pinne4-5/6-carboxyrhodamine 110 er spesielt klikket på azide funksjoner innlemmet HAZ molekylene i SPAAC trinn (λex 501 nm /λem 526 nm, grønne kanalen), mens GALK-enheter registreres på samme måte på de karakteristiske bølgelengdene av azidefluor 545 sonden er spesielt klikket på innarbeidet terminal alkyne kodene i G ALK under CuAAC trinn (λex 546 nm /λem 565 nm, røde kanalen). den tredje kanalen tilsvarer eksisterende lignin, som oppdages ved hjelp av sin iboende autofluorescence ved 405 nm (blå kanal). Dette fører til generasjon av tre farger lokalisering kart av lignin innenfor anlegget celle vegger som gir presis romlig informasjon om tilstedeværelse eller fravær av aktive lignification maskiner mellom ulike vev av et organ (figur 3A ), mellom ulike celletyper samme vev (figur 3B-C) og annen vegg lag av samme celle (figur 3D). Med andre ord, tillater denne metoden oss å markere og spesielt lokalisere webområdene 'aktiv' lignification (HAZ og GALK kanaler) ved å skille dem fra soner der lignin ble dannet på en tidligere Utviklingsstadium anlegg (autofluorescence kanal). I tillegg sensitiviteten av teknikken er dramatisk forbedret i forhold til autofluorescence, og mye mindre mengder fersk syntetisert lignin kan være oppdaget (figur 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Figur 3: Imaging av innarbeidet monolignol kjemiske journalister i Lin stammer. (A) halvparten av en hånd-laget tverrgående del av en lin stilk, rekonstruert bilde. (B) nærbilde av de første lag av skille vedvev. Venstre panel: lignin autofluorescence (blå, 405 nm), midtre panelet: fusjonerte lignin autofluorescence (blått) og HAZ fluorescens (grønn, 526 nm) kanaler, høyre panel: fusjonerte lignin autofluorescence (blå) og GALK fluorescens (rød, 565 nm) kanaler. Pilen viser første merkede cellen vegg fra cambium illustrerer økt følsomhet av BLISS sammenlignet med autofluorescence. (C) merking i ulike celle sekundære vedvev og (D) lukke opp på sekundære vedvev celler illustrerer merking variasjoner i forskjellige lag av samme cellen vegg. Venstre panel: fusjonerte lignin autofluorescence (blått) og HAZ fluorescens (grønn, 526 nm) kanaler, midtre panelet: fusjonerte lignin autofluorescence (blå) og GALK fluorescens (rød, 565 nm) kanaler, høyre panelet: fusjonerte lignin autofluorescence (blå), HAZ (grønn) og GALK (rød) fluorescens kanaler. HAZ og GALK co lokalisering er avbildet i gult. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Kjemisk reporter strategier som metoden BLISS presenteres her eller én-merking prosedyrene tidligere publisert av Tobimatsu et al. 8 kan derfor gi en mye finere studie enn tidligere tilgjengelig metoder som negative eller histochemical flekker samtidig svært enkelt å implementere. For eksempel Figur 4 illustrerer at signalet intensiteten for HAZ/GALK innlemmelse i fiber tracheids/skip (FT) av lin sekundære vedvev er svært høy i første par cellen vegger fra cambium men gradvis nedgang i eldre celler. Denne profilen er motsatt av autofluorescence og angir den maksimale lignification er raskt nådd i de første to til tre FT celle lagene fra cambium. I kontrast, ray (R) celler vises fortsette lignification til mye senere stadier av deres utvikling som HAZ/GALK innlemmelse er mye mer konstant i veggene i alle celler fra cambium til margen. Det er ikke overraskende at FT og R celletyper vise kontrast lignification dynamikk, siden disse celletyper har ulike biologiske roller med tilknyttede forskjeller i sine utviklingsmessige program. FTs er faktisk langstrakt rør som modne og dø raskt, etterlot død tomme celler med tykk lignified vegger som spiller viktige roller i både mekanisk støtte og vertikal transport av vann og mineraler, mens smale radene av R celler som komponere vedvev stråler er levende i deres eldre og fungerende tilstand uten tykk lignified vegger.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Figur 4: celle-spesifikke monolignol reporter innlemmelse i Lin vedvev. Bright-feltet AC confocal mikroskopi syn (A) en del av et Frihånd tverrsnitt fra en lin stamme. Rosa (ray parenchyma celler, R) og gul (fiber tracheid celler, FT) piler indikerer vektorer som spenner fra sonen cambial mot margen og skannet for lignin autofluorescence ved 405 nm (B), HAZ fluorescens på 526 nm (C) og G ALK fluorescens på 565 nm (D). (E) visning av den sekundære vedvev. Venstre panel: fusjonerte lignin autofluorescence (blå), HAZ (grønn) og GALK (rød) fluorescens kanaler. HAZ og GALK co lokalisering er avbildet i gult. Høyre panel: Mactac sekundære vedvev struktur i Lin stammen. V, beholder; FT, fiber tracheid; R, ray parenchyma cellen. Dette tallet har blitt endret fra Lion et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
I tillegg kan bruken av to forskjellige kjemiske journalister svarer til H - og G-enheter med to bioorthogonal reaksjoner i BLISS protokollen mer kvantitative resultater skal oppnås. Multiplekset merking strategier som BLISS kunne gi ytterligere innsikt om kontroll av monolignol innlemmelse prosenter i ulike forhold og kan bidra til å tyde den unnvikende lignification prosessen. Hvis de relative prosentene av H, G og S monolignols i Ligniner er faktisk svært variabel etter arter, vev, alder eller miljøforhold av anlegget, er intrikate mekanismer som regulerer denne komposisjonen fortsatt ikke helt forstått. Den doble benevner teknologien representerer en effektiv måte å undersøke noen av parameterne som regulerer lignin komposisjon. For eksempel varierer HAZ: GALK forholdet med lykke tillatt oss å demonstrere at lignin sammensetning sekundært vedvev vev er direkte avhengig monolignol tilgjengelighet i cellen vegger, og ikke på peroxidase/laccase spesifisitet (figur 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Figur 5: Effekten av rugende Lin Stem seksjoner med ulik prosentdel prosenter HAZ og GALK. HAZ: GALK% prosenter gis hver kolonne av tall. Topp: fusjonerte HAZ og GALK kanaler. Bunnen: histogrammer angir gjennomsnittlig fluorescens intensitet HAZ og GALK for ulike % forholdstallene. Verdiene uttrykkes som mener fluorescens intensiteten i gråtoner ± SD. skala bar = 100 µm. dette tallet har blitt endret fra Lion et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Lin er vokst for sin bast fiber (BF) som brukes til å produsere tekstiler, luksus papirer eller miljøvennlig komposittmaterialer. En viktig del av deres industrielle valorization er at de inneholder svært lave nivåer av lignin i sine cellevegger, som er preget av en veldig tykt S2/G sekundære lag19,24. LYKKE kan utheve lignification dynamics forskjeller mellom de forskjellige lagene i samme cellen vegg. Figur 6A viser at HAZ og GALK reporter innlemmelse er begrenset til Cellehjørner og midten lameller/primære cellevegg av noen, men ikke alle bast fiber. Totalt fravær av lignification i tykk bast fiber videregående cellen vegglaget selv når monolignol kjemiske journalister er exogenously levert avslører at deres hypolignified tilstand skyldes fravær av et molekylær miljø egnet for enzymatisk-mediert oksidasjon og inkorporering av monolignols en voksende polymer kjede, og at det ikke er bare på grunn av transcriptional regulering av monolignol biosyntesen gener som tidligere rapporterte25. Denne observasjonen også samsvarer godt med faktum at Lin peroxidase gener er opp-regulert i ytre stilk vev av lin kjemiske lbf1 mutant som besitter lignified bast fiber26.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Figur 6: BLISS høydepunkter cellevegg underkonstruksjonen - eller layer-spesifikk forskjellene. (A) venstre panel: lys-feltet bilde for en lin stammen. Sirkel angir en fiber bunt. Høyre panel: close up på bast fiber. Flettet HAZ og GALK -kanaler (med eller uten lyse felt) viser at lignification er begrenset til Cellehjørner (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) og midten lameller/primære cellevegg av noen bast fiber. BF, bast fiber; Pålydende, parenchyma cellen; M, midten lameller; P, primær cellevegg; S1, første laget av sekundær cellevegg; S2/G, sekundær lag/geléaktige lag av sekundær cellevegg. (B) 2D skive og 3D rekonstruksjon av AC confocal z stabel zoom Lin rot endodermis regionen. Casparian strip (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) bare viser autofluorescence og ikke innlemme HAZ eller GALK. Den tilknyttede fluorogram viser en GALK/HAZ anti-sammenheng: høy grønne fluorescens er knyttet til lav røde signalet (cortex) og omvendt (endodermis). Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Til slutt, denne to-farge metodikken kan også gi verdifull informasjon tilstan' lignification' cellevegg underlag i ulike utviklingsstadier og plante organer enn stammen. For eksempel er endodermis Lin røtter preget av eksistensen av et Casparian band i murene radial og tverrgående cellen under de tidlige stadiene av utviklingen. Dette bandet av hydrofobe Research, laget av suberin og/eller lignin, hindrer vann og solutes tatt opp med roten å passivt gjennom apoplast og tvinger dem til å passere gjennom plasma membranen via en symplastic-rute og dermed bidra til den selektiv opptak kapasitet til planterøttene. Når påføres Lin røtter, viste vår strategi at HAZ og GALK er innlemmet i tangentiell veggene av endodermal celler så vel som i deler av radial vegger hvor Casparian bandet er fraværende (figur 6B). Men indikerer totalt fravær av monolignol reporter innlemmelse i Casparian bandet selv at det er modne på denne utviklingsstadiet mens andre veggene er fortsatt stedet ytterligere Research program. Rekonstruerte 3D-visning av en z-stabel gir tydelig Casparian bandet lys. Interessant, veggene i noen kortikale celler ved siden av endodermis viste seg også i stand til å innlemme HAZ fortrinnsvis (og dermed indikerer tilstedeværelse av lignin/suberin i Lin rot cortex) men ikke GALK. Co lokalisering analyse viste en anti-korrelasjon mellom HAZ og GALK, som tyder på eksistensen av cellen-spesifikk veggen struktur/enzymatisk maskiner i disse to tilstøtende celletyper.
Ekstra tabell 1: Forberedelse av solid ½ MS Medium <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Ekstra tabell 2: utarbeidelse av kjemiske reporter lager løsninger <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

LYKKE, en dobbel merking protokoll for å studere lignification dynamikk, ble utviklet. Bruk syntetisk monolignol Klikk journalister og en sekvensiell kombinasjon av SPAAC og CuAAC bioorthogonal reaksjoner, denne metoden legger veien til dyptgående analyse av faktorene som regulerer biogenesis av Ligniner i planta.

Visualisere Lignification Dynamics i planter med Klikk kjemi: Dual merking er lykke!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysere Protein Dynamics Bruke Hydrogen Exchange-massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kvantitative Proteomikk Bruke Reduktiv Dimethylation for stabile isotoper Merking

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Rakne Entropic Rate Akselerasjon indusert av Solvent Dynamics i Membrane Enzymer

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

Kjøling hastighetsavhengige ellipsometry målinger for å bestemme Dynamics av ​​Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Kontinuerlig kjemi: Reaksjon av Diphenyldiazomethane med p- Nitrobenzoic syre

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Verifiserer strukturen og dynamikken i Interfacial vann med Scanning Tunneling mikroskopi og spektroskopi

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Co uttrykk for flere Chimeric fluorescerende Fusion proteiner på en effektiv måte i planter

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

Romanen teknikker for å observere strukturelle dynamikken i Photoresponsive flytende krystaller

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...