Name: visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Vi står i skuld till den forskning Federation FRABio och TisBio imaging plattform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des assemblage Biomoléculaires) för att tillhandahålla den tekniska miljön bidrar till att uppnå detta arbete.

Obs: Flytande och fasta ½ MS media måste förberedas i förväg som beskrivs i kompletterande Tabell1.
1. planta kultur
<ol><li>
Kultur i 2 månader gammal linplantan
	<ol>
<li>Så lin (Linum usitatissimum L.) fröer i plastkrukor med planteringsjord.</li>
		<li>Odla lin i tillväxt kamrarna på 22 ° C med en fotoperiod av 16 h/8 h dag/natt.</li>
		<li>Utrusta växter med vertikalt stöd efter 1 månad och växa tills de är 2 månader gammal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kulturen i 2 veckor gamla lin plantor
	<ol>
<li>Wrap 12 linfrön i en bit ost tyg och fäst med ett gummiband att göra en bunt. Obs: Utföra nästa steg under sterila förhållanden under laminärt luftflöde spiskåpa.</li>
		<li>Placera den utsäde bunten i en tidigare Ånghärdad 250 mL glasflaska.</li>
		<li>Tillsätt 70 mL 70% EtOH i flaskan och försiktigt rör om i 1 min.</li>
		<li>Ta försiktigt bort EtOH genom dekantering medan bunten i flaskan.</li>
		<li>Tillsätt 100 mL 2% natriumhypoklorit och rör försiktigt i 10 min.</li>
		<li>Ta bort natriumhypokloritlösningen genom dekantering medan bunten i flaskan.</li>
		<li>Upprepa steg 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>Tillsätt 100 mL Sterilt ultrarent vatten och rör om i 1 min.</li>
		<li>Upprepa steg 1.2.8 3 gånger, på att öka skölja tiden för varje sköljning (5, 10 och 15 min).</li>
		<li>Värma fast ½ MS medium, häll den i en steril plant kultur låda till en höjd av 2 cm och låt den svalna tills stelning.</li>
		<li>Försiktigt placera varje frö på fast substrat med steril pincett.</li>
		<li>Stäng rutan sterila.</li>
		<li>Överföra rutan till en tillväxt kammare vid 22 ° C med en fotoperiod av 16 h/8 h dag/natt och odla lin plantor 2 veckor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metaboliska införlivandet av kemiska reportrar
Obs: Tre experimentella modeller presenteras nedan: i) metabola märkning av stem tvärsnitt, ii) hela stammar och iii) växt plantor. Varje protokoll presenteras för en biologisk replikera och kvantiteter kan anpassas till antalet nödvändiga biologiska replikat. Monolignol lösningar är beredda från stamlösningar som görs som beskrivs i tabell 2 före experimentet. Stamlösningar kan förvaras flera månader vid-20 ° C. Den HAZ: GALK eller h proportioner kan justeras för att passa alla skräddarsydda experimentella konstruktioner.
<ol><li>Kemiska reporter införlivande i 2 månader gammal lin stem tvärsnitt
	<ol>
<li>Bered en 300 µL kemiska reporter som innehåller 10 µM av GALK och 10 µM för HAZ i flytande sterila ½ MS-medium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK lösning och överföra den till en brunn i en 48-well platta med en mikropipett.</li>
		<li>Bered en 300 µL negativa kontrollen som innehåller 10 µM g och 10 µM h i flytande sterila ½ MS-medium.</li>
		<li>Vortex H/G lösning och överföra den till en andra borrning av samma 48-väl plattan.</li>
		<li>Skär av stjälken av en 2 månader gammal lin anläggning på 10 cm ovanför markytan med en nya rakblad.</li>
		<li>Försiktigt förbereda 50 freehand övergripande tvärsnitt av stammen med rakbladet (cirka 150-250 µm tjock).</li>
		<li>Placera omedelbart ottomotorer i flytande sterila ½ MS-medium i ett urglas.</li>
		<li>Inspektera visuellt och välj intakt hela tvärsnitt för att slumpmässigt fördela 10 av dem i den väl fyllda med HAZ/GALK lösning.</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.8 för den väl fyllda med H/G lösning (som negativ kontroll).</li>
		<li>Upprepa steg 2.1.8 för tredje väl fylld med 300 µL av ½ MS medium (som bakgrund kontroll att justera fluorescens baslinjen under efterföljande behandling av konfokalmikroskopi bilder).</li>
		<li>Inkubera plattan i kontinuerlig ljus i en tillväxt kammare vid 20 ° C för 20 h.</li>
		<li>Ta bort den monolignol lösningen i varje brunn med en mikropipett.</li>
		<li>Tillsätt 500 µL ½ MS medium i varje brunn, rör försiktigt i 10 min och ta bort detta sköljning lösning med en mikropipett. Upprepa 4 gånger och fortsätt att BLISS märkning omedelbart (avsnitt 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Kemiska reporter införlivande i 2 månader gammal lin hela stjälkar
	<ol>
<li>Bered en 5 mL kemiska reporter som innehåller 10 µM av GALK och 10 µM för HAZ i flytande sterila ½ MS-medium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK lösning och överföra det till en 20 cm hög glas test tube med en pipett.</li>
		<li>Bered en 5 mL negativa kontrollen som innehåller 10 µM g och 10 µM h i flytande sterila ½ MS-medium.</li>
		<li>Vortex H/G lösning och överföra det till en 20 cm hög glas test tube.</li>
		<li>Förbereda ett tredje glas provrör innehållande 5 mL ½ MS medium (som bakgrund kontroll att justera fluorescens baslinjen under efterföljande behandling av konfokalmikroskopi bilder).</li>
		<li>Skär av stjälken av en 2 månader gammal lin anläggning på 10 cm ovanför markytan med en nya rakblad. Kassera rotsystem och nedre delen av stammen och fortsätt till nästa steg med den övre delen av växten stammen.</li>
		<li>Sänk ned basen av hela skär stammen i röret som innehåller HAZ/GALK lösning. Placera stammen i dess inkubation lösning omedelbart efter borttagning av rotsystemet för att förhindra den från att torka. Obs: Om metoden används för yngre/äldre anläggningar eller andra arter, volymen av monolignol lösningar måste justeras beroende på storlek / ålder av anläggningen och dess stam diameter.</li>
		<li>Fäst stammen en vertikalt stöd att hålla den rak.</li>
		<li>Försegla glasröret med parafilm att undvika avdunstning av lösningen.</li>
		<li>Upprepa steg 2.2.6-2.2.9 för det negativa kontrollprovet med H/G lösning.</li>
		<li>Upprepa steg 2.2.6-2.2.9 för fluorescens bakgrund kontrollprovet som innehåller ½ MS medium.</li>
		<li>Inkubera varje stam för 20 h i kontinuerlig ljus med en neon ljus.</li>
		<li>Efter 20 h metabola bolagsordning, ta bort stammen inkuberas i HAZ/GALK lösningen och skölj med ½ MS medium.</li>
		<li>Skär och kassera botten 1 cm av stjälken med ett rakblad och sedan förbereda en 1 cm hög cylinder från basen av återstående stammen.</li>
		<li>Noggrant förbereda 20 freehand tvärgående tvärsnitt (cirka 150-250 µm tjock) från denna cylinder och placera dem omedelbart i ett urglas fyllt med ½ MS medium.</li>
		<li>Lägga 500 µL av ½ MS medium i ett väl 48-bra platta.</li>
		<li>Inspektera visuellt och välj intakt hela tvärsnitt och slumpmässigt fördela 10 av dem i väl fylld med ½ MS lösning.</li>
		<li>Upprepa steg 2.2.13-2.2.17 för negativ kontroll stammen inkuberas med H/G lösningen.</li>
		<li>Upprepa steg 2.2.13-2.2.17 för fluorescens bakgrund kontroll stammen inkuberas med ½ MS medium.</li>
		<li>Ta försiktigt bort lösningen i varje brunn med en mikropipett.</li>
		<li>Tillsätt 500 µL ½ MS medium i varje brunn, rör försiktigt i 10 min och ta bort detta sköljning lösning med en mikropipett. Upprepa 4 gånger och fortsätt att BLISS märkning omedelbart (avsnitt 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Kemiska reporter införlivande i 2 veckor gamla lin plantor Obs: Följande steg alla utförs under sterila förhållanden.<ol>
<li>Bered en 2 mL kemiska reporter som innehåller 10 µM av GALK och 10 µM för HAZ i flytande sterila ½ MS-medium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK lösning och överföra det till en 20 cm höga glas test tube med en pipett.</li>
		<li>Bered en 2 mL negativa kontrollen som innehåller 10 µM g och 10 µM h i flytande sterila ½ MS-medium.</li>
		<li>Vortex H/G lösning och överföra det till en 20 cm höga glas test tube.</li>
		<li>Förbereda ett tredje 20 cm hög glas provrör innehållande 2 mL ½ MS medium (som bakgrund kontroll att justera fluorescens baslinjen under efterföljande behandling av konfokalmikroskopi bilder).</li>
		<li>Försiktigt bort en 2 veckor gamla lin fröplanta från solid ½ MS mediet använder en lång par pincett (avsnitt 1.2. ovan).</li>
		<li>Försiktigt flytta plantan till röret som innehåller HAZ/GALK lösning, som säkerställer att dess rötter är nedsänkt i lösningen.</li>
		<li>Stäng glasröret med ett plastlock att undvika avdunstning.</li>
		<li>Upprepa steg 2.3.6-2.3.8 för negativ kontroll röret med H / G lösning.</li>
		<li>Upprepa steg 2.3.6-2.3.8 för fluorescens bakgrund kontroll röret som innehåller ½ MS medium.</li>
		<li>Inkubera varje planta i kontinuerlig ljus i en tillväxt kammare för 20 h vid 20 ° C.</li>
		<li>Ta försiktigt bort plantan inkuberas i HAZ/GALK lösningen och skölj med ½ MS medium.</li>
		<li>Försiktigt förbereda 20 freehand tvärsnitt (approximativt 150-250 µm tjock), hypocotyl.</li>
		<li>Lägga 500 µL av ½ MS medium i ett väl 48-bra platta.</li>
		<li>Inspektera visuellt och välj intakt hela tvärsnitt och slumpmässigt fördela 10 av dem i väl fylld med ½ MS lösning.</li>
		<li>Upprepa steg 2.3.12-2.3.15 för negativ kontroll plantan inkuberas med H/G lösningen.</li>
		<li>Upprepa steg 2.3.12-2.3.15 för fluorescens bakgrund kontroll plantan inkuberas med ½ MS medium.</li>
		<li>Ta försiktigt bort lösningen i varje brunn med en mikropipett.</li>
		<li>Tillsätt 500 µL ½ MS medium i varje brunn, rör försiktigt i 10 min och ta bort detta sköljning lösning med en mikropipett. Upprepa 4 gånger och fortsätt att BLISS märkning omedelbart (avsnitt 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. dubbla fluorescens märkning av växtprover tvärsnitt genom SPAAC och CuAAC
Obs: BLISS märkning protokoll är identiska för alla 3 experimentella modeller (avsnitt 2).
<ol><li>
Stam-främjade natriumazid-alkynen cykloadditionen (SPAAC) märkning
	<ol>
<li>Förbereda 1 mL av en SPAAC lösning som innehåller 5 µM DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110 i flytande sterila ½ MS-medium. Vortex lösningen och hålla den i mörker.</li>
		<li>Efter sista diska steg av metabola inkorporering protokollet [2.1.13, 2.2.21 eller 2.3.19 beroende på den valda experimentell designen], ta bort ½ MS medium och tillsätt 300 µL SPAAC lösning per brunn med en mikropipett.</li>
		<li>Sköld 48-väl plattan från ljus av täcka med aluminiumfolie eller genom att placera den i en låda.</li>
		<li>Rör försiktigt ner plattan på en mekanisk skakapparat för 1 h i mörker vid omgivande temperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Koppar-katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC) märkning
	<ol>
<li>Tvätta vart väl 4 gånger som beskrivs i steg 2.1.13 samtidigt hålla plattan i mörkret.</li>
		<li>Förbereda 1 mL av en CuAAC lösning som innehåller 2,5 mM natriumaskorbat, 0,5 mM CuSO4 och 5 µM 5-TAMRA-PEG3-natriumazid i flytande sterila ½ MS-medium. Vortex lösningen och hålla den i mörker. Obs: Denna CuAAC lösning måste beredas före användning och kan inte lagras mer än ett par dagar vid 4 ° C.</li>
		<li>Ta bort ½ MS mediet i varje brunn och Lägg direkt till 300 µL CuAAC lösning per brunn med hjälp av en mikropipett.</li>
		<li>Rör försiktigt ner plattan på en mekanisk skakapparat för 1 h i mörker vid omgivande temperatur.</li>
		<li>Ta bort den CuAAC lösningen med hjälp av en mikropipett.</li>
		<li>Med hjälp av en mikropipett, tillsätt 500 µL av ½ MS, rör i mörkret för 10 min sedan bort denna tvättlösningen. Upprepa två gånger.</li>
		<li>Tillsätt 500 µL av en 7:3 MeOH/vatten-lösning, rör i mörkret för 1 h sedan bort lösningen FÖRSIKTIGHET: Metanol är giftigt vid hudkontakt eller inandning, och utses som cancerframkallande. Dess utnyttjande kräver kemiska dragskåp och handskar.</li>
		<li>Tillsätt 500 µL av ½ MS, rör i mörkret för 10 min sedan bort lösningen. Upprepa 4 gånger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montering av prover på Mikroskop glider
<ol><li>Placera 5 droppar monteringsmedium på ett glas objektglas.</li>
	<li>Insättning noga varje HAZ/GALKtaggade tvärsnitt i bilden.</li>
	<li>Applicera nagellack på två motsatta sidor av bilden.</li>
	<li>Täcka bilden med ett täckglas. Var noga med att undvika luftbubblor.</li>
	<li>Ta bort överflödigt monteringsmedium med en pappershandduk.</li>
	<li>Försegla provet med nagellack på alla 4 sidor. Låt nageln lack torrt vid rumstemperatur (ca 30 min).</li>
	<li>Upprepa steg 4.1-4.6 för negativ kontroll H/G ottomotorer.</li>
	<li>Upprepa steg 4.1-4.6 för fluorescens bakgrund kontroll ottomotorer.</li>
	<li>Lagra bilder vid 4 ° C i mörker tills observation under en confocal Mikroskop. Obs: Beredda bilder kan lagras i flera veckor till flera månader beroende på kvaliteten på förberedelserna. Om en ny observation är att göras efter lagring, se till att proverna inte har torkat upp.</li>
</ol>5. bild förvärvandet av fluorescens konfokalmikroskopi
<ol><li>Aktivera alla nödvändiga enheter av systemets konfokalmikroskopi i rätt ordning enligt tillverkarens anvisningar.</li>
	<li>Välj det önskade målet med maximal numerisk bländare och anpassad magnetisering och utsläpp våglängder (t.ex. mål 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescens kanal: λex 405 nm, λem 450 nm /25; SPAAC HAZ kanal: λex 488 nm, λem 525 nm /25; CuAAC GALK kanal: λex 561 nm, λem 595 nm /25; sekventiell läge).</li>
	<li>Väljer du önskade parametrar för generering av bilder i programvaran (12 - eller 16-bitars krävs, pixelstorlek anpassas till Nyquistkriteriet).</li>
	<li>Placera i HAZgALK bilden på Mikroskop scenen och placera provet under objektivet.</li>
	<li>Observera och hitta önskad region i växt vävnaden.</li>
	<li>
Förvärva confocal bilder av hög kvalitet av dubbelt märkt HAZgALK provet.
	<ol>
<li>Välj mest fluorescerande planet i z-axeln.</li>
		<li>Justera vinst, offset och laser power att uppnå optimal signal distribution längs hela grå nivå intervallet för varje kanal (autofluorescens, HAZ och GALK). Samma parametrar måste tillämpas för alla följande förvärv.</li>
		<li>Starta förvärvet av den valda bilden och spara filen. Upprepa för varje relevant område i provet. Obs: 3D Z-stack rekonstruktioner kan också förvärvas vid behov.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Med samma inställningar, förvärva bilder av otaggade prov endast inkuberas i ½ MS att bestämma autofluorescens (fluorescens bakgrund kontroll som beskrivs i avsnitt 2).</li>
	<li>Med samma inställningar, förvärva bilder för de negativa kontrollprover inkuberas med infödda monolignoler H/G för att fastställa icke-specifik fluorophore vidhäftning till provet.</li>
	<li>Tillämpa data behandling till förvärvade bilder till subtrahera bakgrunden autofluorescens signaler i både H/G negativ kontroll bilder och HAZgALK bilder.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+biological+discovery.">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li><li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+in+living+systems.">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li><li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy:+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways.">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li><li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy.">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li><li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery,+architecture,+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls.">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li><li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification.">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li><li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls.">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls.">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems.">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li><li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li><li>Weng, J. -. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis.">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li><li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+lignins:+harnessing+the+plasticity+of+lignification.">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li><li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+way+for+lignin+valorisation:+recent+advances+in+bioengineering,+biorefining+and+catalysis.">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li><li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines.">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans.">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li><li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid.">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li><li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry.">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering.">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter.">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li><li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLISS:+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants.">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li><li>del R&#237;o, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Som tidigare nämnts är dubbel märkning BLISS protokollet presenteras i denna uppsats en av de första exemplen på en SPAAC/CuAAC kombination i vivo12,23. Varje steg var noggrant optimerad och valideras, och det är mycket viktigt att den ordning i vilken de två klicka kemi märkning reaktioner sker sekventiellt respekteras (dvs. SPAAC först, följt av CuAAC). Alla cross-kontroller visade att varje märkning steg är specifik när protokollet BLISS är tillämpad23 : utför det SPAAC steget först leder till den mycket chemoselective märkning av HAZ natriumazid funktioner genom den cyclooctyne-functionalized fluorophore genom en [3 + 2] cykloadditionen reaktion med snabb kinetik. När HAZ enheter är märkta, kan det CuAAC steget nödvändiggör copper(I) katalyseras aktivering av GALK terminal alkyner att generera triazol länkar genom reaktion med natriumazid-fluor 545 sond utföras. I kontrast, omvänd ordning (dvs. CuAAC först, följt av SPAAC) bör inte användas eftersom det leder till enhet GALK och HAZ cross-koppling, som konkurrerar med fluorophore ligering och inducerar en dramatisk förlust av signal . Det är också viktigt att betona behovet av de mellanliggande tvätt steg för att undvika icke-specifik färgning.
Vi har visat att vår metod kan tillämpas på olika biologiska experiment mönster. BLISS märkning protokoll tillämpades först till freehand tvärsnitt av lin stjälkar (ca 150-250 µm tjocka) som tidigare skär och inkuberas med de klick-klar monolignoler. Även denna konstruktion har fördelen att minimera de nödvändiga mängder kemiska reporter (som inkubation Rökgasvolymerna minskas) och underlätta produktionen av statistiska replikat, är det inte, strängt taget, ett in vivo -system och i vissa fall kanske inte återspeglar alla aspekter av verkliga plats-temporal lignification dynamics. I en andra försöksplanering anpassade vi därför BLISS protokollet till en metod som tidigare användes för att studera införlivandet av radiomärkt monolignoler i furu och gingko27. I denna strategi, rötterna och stammen av anläggningen är fysiskt åtskilda och basen av hela stammen inkuberas i monolignol lösningen i vad kan dubbas metoden 'blomvas'. Efter att ha lämnat stjälkarna i önskad (inkubationstid), är tvärsnitt cut och BLISS protokollet utförs. Detta tillät oss att visa att de modifierade monolignoler transporteras genom levande stammen och införlivas i växande lignin polymerer inom cellväggarna och (ii) att lokalisering mönstret var i huvudsak identisk med tvärsnitt tillvägagångssätt. Denna typ av experiment har fördelen som utförs i en riktig levande växt / levande cell närma möjliggör längre experiment och mer ingående studier, men kräver större mängder kemiska reporter. Slutligen användes också protokollet BLISS med lin växt plantor, som representerar en riktig levande växt modell där kemiska reportrar måste tas upp genom rötterna innan den transporteras upp stammen. Medan denna modell har den klara fördelen utförs i levande växter, i praktiken, det är begränsat till unga plantor och lämpar sig inte riktigt för att utreda lignification dynamik i äldre anläggningar av praktiska skäl (lång inkubationstid, förhöjda (mängd kemiska reportrar). Ändå, dessa tre experiment mönster är kompletterande och alla har sina för- och nackdelar när det gäller praktiska aspekter och biologiska betydelse beroende på vilken typ av biologiska frågan besvaras.
Utvecklats för att studera lignification dynamiken i lin, våra protokoll är mycket anpassningsbar, inte bara när det gäller biologiska experiment design, men också när det gäller dess tillämpning på andra växtarter och organ/vävnader. Exempelvis kan BLISS enkelt överföras till Arabidopsis eller släktena Populus som är mer mottagliga för studier med knock-out eller knock-down mutanter för olika gener. I princip kan dubbla märkning studier med vår metod också utökas till andra biomolekyler med två distinkta modifierade prekursorer av växten cellväggen polymerer - inklusive alla tre huvudsakliga monolignoler eller deras metaboliska prekursorer samt av olika monosackarider som utgör matrisen polysackarid. Sedan starten har har bioorthogonal kemi faktiskt främst utvecklats för att utreda glycans/polysackarider genom metaboliska oligosackarid engineering (MOE)4,5,17,28, men förvånansvärt har förekommit endast mycket få program att plantera biologi hittills7,8,9,10,11,12. När det gäller kompatibilitet av reaktioner var studiet av lignin verkligen ett komplicerat fall att lösa som båda kemiska reportrar införlivas i samma nätstruktur polymeren. Möjligheten att omärkt HAZ-GALK korslänk bildandet var den stora frågan att övervinna på grund av den rumsliga närheten av GALK och HAZ enheter inom 3D struktur av lignin23, en begränsning som inte kan finnas om de två kemiska reportrarna inte införlivas i samma typ av biopolymer eller i samma geografiska region av någon viss cell.
I större omfattning kan BLISS metodiken i huvudsak tillämpas på alla två-färg fluorescens bildtagningsstudie i bakterie- eller animaliska modeller med två distinkta kemiska reportrar uthärda en natriumazid och terminal alkynen tag, respektive.

Under de senaste två decennierna, kemiska reporter strategin har vuxit fram som en kraftfull två-stegs metod för att undersöka de dynamics och funktioner för icke-genetiskt kodade biomolekyler. 1 , 2 , 3 i denna strategi en syntetisk analog av biomolecule intresse med en liten modulering – kemiska reporter – först metaboliseras av den levande organismen, och sedan en kemisk sond (t.ex., en fluorophore för fluorescens konfokalmikroskopi imaging) är kovalent kopplad till bolagiserade reporter via bioorthogonal Klicka på kemi. Sonden måste reagera snabbt och specifikt med den introducerade kemisk modifieringen samtidigt vara inert till någon biomolekyler som är närvarande i levande system. På många sätt övervinner denna metod begränsningarna av vanliga bioconjugation tekniker med hjälp av mycket specifika Klicka kemi nering vilket ger möjlighet att spåra metaboliter eller biomakromolekyler som tidigare otillgängliga i levande system4,5,6.
Trots den snabb växande populariteten för denna kraftfulla metod i bakteriell och djurs celler är rapporter som beskriver dess användning i växtbiologi förvånansvärt få och långt mellan7,8,9,10, 11,12. Vi var särskilt intresserade av att tillämpa denna strategi i växter att studera bildandet av lignin, en av de vanligaste biopolymerer på planeten och en viktig del av lignocellulosa biomassa. 13 , 14 lignin är en fenol polymer som spelar en viktig strukturell och skyddande roll i utvecklingen och livet av högre växter.
Den allmänt består av tre 4-hydroxyphenylpropanoid beståndsdelarna: H (p- hydroxifenyl), G (guaiacyl) och S (syringyl) enheter respektive härrör från tre 'monolignoler' (p- coumaryl, coniferyl och sinapyl alkoholer) som är syntetiseras via den phenylpropanoid vägen i cytoplasman i cellen (figur 1). Efter att ha förts till cellväggen, monolignoler oxideras med radikaler av peroxidaser eller laccases varefter de genomgår renodlat kemiskt radikala koppling reaktioner att polymerisera till lignin polymerer, en process som kallas lignification. 15 , 16 även om lignins starkt påverkar de industriella valorizationen av många vegetabiliska produkter, det vetenskapliga samfundet ännu en lång väg att gå för att dechiffrera de intrikata mekanismer som reglerar lignification.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Figur 1: lignification processen i växtceller. Monolignoler är biosyntetiseras från fenylalanin i cytosolen. Efter att ha förts till cellväggen, monolignoler oxideras med radikaler av peroxidaser eller laccases varefter de genomgår renodlat kemiskt radikala koppling reaktioner att polymerisera till lignin polymerer, en process som kallas lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Även rapporter om användningen av bioorthogonal reaktioner för glykananalys är talrika,2,3,17 deras applikationsexempel till andra typer av biomolekyler är färre. Användning av bioorthogonal kemi för lignin bioimaging var bara nyligen uppfunnen av Tobimatsu et al. 8 i Arabidopsis thaliana att tillhandahålla information om införlivandet av coniferyl alkohol surrogat till lignin polymeren där den bildar G andelar,8,9 vilket visar bevis på koncept som kemiska reporter strategier är tillämpliga i detta sammanhang. Användning av CuAAC också illustrerades med ett derivat med olika coniferyl i alkohol ett par månader senare av Bukowski et al. 9 dock lignin innehåller också H och S enheter och en djupare förståelse för den lignification processen kräver mer kunskap om hur alla monolignoler inlemmas i polymeren och vilka faktorer kan styra dess sammansättning. Nya framsteg inom detta område är för närvarande beroende av utvecklingen av effektiva metoder för att spåra flera kemiska reportrar samtidigt i levande system. Även om några artiklar om glycans har grunden i senaste åren18,19,fortfarande20,21,22, dubbel märkning metoder en stor utmaning i bioorthogonal kemi. Om en reproducerbar singel-märkning Klicka protokollet är svårt att utveckla, sedan dubbla märkning metoder som kräver optimering parallellt två ömsesidigt är kompatibla bioorthogonal reaktioner på två separata kemiska reportrar ännu svårare. Några exempel som banade väg för denna aspekt används en kombination av stam-främjade natriumazid-alkynen cykloadditionen (SPAAC) och alkene-tetrazine omvänd elektroniska efterfrågan Diels-Alder (DAinv) reaktioner för att studera glycans i djurceller. Men, vi trodde att bioorthogonality DAinv reaktionen inte kan garanteras i denna ansökan på grund av de strukturella funktionerna av lignin (som består av elektron-rika substituerade cinnamyl-typ monomerer som kan reagera med elektron-fattiga Diener såsom de tetrazine sonder används i DAinv reaktioner) och att detta kan generera icke-specifik märkning. Dessutom DAinv reaktionen kräver kemiska handtag som är syntetiskt svåra att tillgång, som är skrymmande och lipofila därmed höja möjligheten som graden av införlivandet, transporter eller lokalisering av kemikalien reporter i vivo kan påverkas. Eftersom vi ansåg att den sistnämnda aspekten var särskilt relevant när det gäller en klick kemi strategi för att studera lignification, vi valde en annan riktning och utvecklat ett Bioorthogonal ligatur Imaging sekventiella strategi (BLISS) använder en kombination av Strain-Promoted natriumazid-alkynen cykloadditionen (SPAAC) och koppar katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC) invivo. 23
Dessa två reaktioner är verkligen de två huvudsakliga bioorthogonal Klicka på reaktioner som har använts hittills, och närmare bestämt i de få exemplen på lignin imaging som nyligen publicerades. 8 , 9 vår dubbel märkning strategi möjliggör användning av en natriumazid biexponentiellt på en monolignol reporter och en terminal alkynen å andra sidan, två kemiska handtag som är i) föga reaktivt mot biologiskt relevanta strukturer och ii) mycket liten i storlek (figur 2 ). Som ett resultat, effekterna av dessa syntetiska modifieringar på fysikalisk-kemiska egenskaperna hos biomolecule under studie minimeras vilket minskar eventuella skillnader mellan de onaturliga och naturliga monolignol substratesna när det gäller transport och metabolisering priser under metabola införlivande steg. Även om kombinationen av SPAAC och CuAAC verkar mycket intuitiv vid första anblicken, är det att vår kunskap bara det andra exemplet av dubbla märkningen med denna strategi och den första ansökningen på strukturer än glycans. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Figur 2: BLISS dubbel märkning strategi. Kemiska reportrar HAZ och GALK är märkta analoger av den infödda H och G monolignoler. De först införlivas i de växande lignin polymererna av cellväggar av exogena utfodring (steg 1). Cyclooctyne - och natriumazid-functionalized fluorescerande sonder är sedan sekventiellt sammanskrivna att bolagiserade reportrar av bioorthogonal Klicka på kemi: SPAAC reaktionen (steg 2) är mycket specifika HAZ enheter och följs av en CuAAC reaktion ( steg 3) som är specifikt GALK enheter (steg 3), vilket möjliggör specifika localizationen av båda reportrar självständigt i samma prov. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Vi först konstruerade och validerade natriumazid-taggade monolignol reporter HAZ (surrogat p- coumaryl alkohol) och föregångare av lignin H enheter och sedan utarbetat den BLISS dubbel märkning strategi där det används parallellt med den tidigare rapporterade alkynen-märkta GALK,9 (surrogat coniferyl alkohol) och föregångare av lignin G-enheter. I detta reproducerbara protokoll utvecklas och testas i lin, uppnås en ekonomiskt viktig växtarter, dubbla metabola införlivande av HAZ och GALK lignin först före sekventiell SPAAC/CuAAC märkning. Här, märkta märkta HAZ enheter först särskilt via den SPAAC ligation av en cyclooctyne-functionalized fluorophore, följt av CuAAC-medierad ligering av en andra fluorescerande sond på märkta GALK enheter. Denna metod användes för att undersöka dynamiken av lignification processer i växternas cellväggar och kan vara tillämpad i vivo att hejda tvärsnitt, living stjälkar samt plantor av olika växtarter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% sodium hypochlorite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm high glass tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Schott glass bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/6-TAMRA-PEG3-Azide</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-AZ109-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheese cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost containing clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coniferyl alcohol (G)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MFCD00002922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-A127-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1,5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flax seeds (L. usitatissimum L.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G&#8482; Slide Mounting Medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF-Plant Climatics</td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Angelantoni Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta plant culture box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old seedling culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaryl alcohol (H)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>FC145653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical support</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for liquid and solid &#189; MS medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

Lignin är en av de vanligaste biopolymerer på planeten och en viktig del av lignocellulosa biomassa. Denna fenoliska polymer spelar en viktig strukturell och skyddande roll i utvecklingen och livet av högre växter. Även om de intrikata mekanismer som reglerar lignification processer i vivo starkt påverkar de industriella valorizationen av många vegetabiliska produkter, har det vetenskapliga samfundet fortfarande en lång väg att gå för att dechiffrera dem. I ett enkelt arbetsflöde i tre steg gör dubbel märkning protokollet presenteras häri bioimaging studier av aktivt lignifying zoner av växt vävnader. Det första steget består i metabola införlivandet av två oberoende kemiska reportrar, ersättningar för de två inhemska monolignoler som ger upphov till lignin H - och G-enheter. Efter inblandning i växande lignin polymerer, är varje reporter sedan specifikt märkt med egen fluorescerande sond via en sekventiell kombination av bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klicka reaktioner. Kombinerat med lignin autofluorescens, detta synsätt leder till generation av tre färger lokalisering kartor av lignin i växternas cellväggar av confocal fluorescensmikroskopi och ger exakt rumslig information på närvaro eller frånvaro av aktiva lignification maskiner på omfattningen av växt vävnader, celler och olika cellväggen lager.

Med hjälp av presenterade BLISS protokollet som omfattar syntetiska monolignol analoger och bioorthogonal Klicka på kemi, är det möjligt att visualisera dynamiken i den lignification processen i levande växter. Till skillnad från etablerade tekniker för lignin riktar visualisering (såsom histochemical färgning, immunolocalization eller autofluorescens), detta 'dubbel klicka' protokoll uteslutande det lignin som producerade de novo under metabola inkorporeringen steg och skiljer den från redan existerande ligninet av provet med triple-kanal cellulär avbildning av confocal fluorescensmikroskopi (figur 3). H AZ-enheter upptäcks med hjälp av excitation och utsläpp våglängder av DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110 som klickas specifikt på natriumazid funktioner ingår HAZ molekyler under SPAAC steg (λex 501 nm /λem 526 nm, gröna kanalen), medan GALK-enheter identifieras på samma sätt vid de karakteristiska våglängderna av azidefluor 545 sonden som klickas specifikt på bolagiserade terminal alkynen taggar för G ALK under CuAAC steg (λex 546 nm /λem 565 nm, röd kanal); den tredje kanalen motsvarar befintliga lignin som upptäcks med hjälp av dess inneboende autofluorescens vid 405 nm (blå kanal). Detta synsätt leder till generation tre färger lokalisering kartor av lignin i växternas cellväggar som ger exakt rumslig information om förekomst eller avsaknad av aktiv lignification maskiner mellan olika vävnader av ett organ (figur 3A ), mellan olika celltyper inom samma vävnad (figur 3B-C) och inom olika väggen lager av samma cell (figur 3D). Med andra ord, tillåter denna metod oss att belysa och specifikt lokalisera 'aktiv' lignification webbplatser (HAZ och GALK kanaler) genom att skilja dem från zoner där lignin bildades vid en tidigare utvecklingsstadium växt (autofluorescens kanal). Dessutom tekniken känslighet förstärks dramatiskt jämfört med autofluorescens, och mycket mindre mängder av färska syntetiserade lignin kan vara upptäckt (figur 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Figur 3: avbildning av inbyggda monolignol kemiska reportrar i lin stjälkar. (A) hälften av ett handgjort övergripande avsnitt av en lin stam, rekonstruerad bild. (B) Närbild av de första lagrarna att differentiera xylem. Vänstra panelen: lignin autofluorescens (blå, 405 nm), mellersta panelen: samman lignin autofluorescens (blått) och HAZ fluorescens (grön, 526 nm) kanaler, högra panelen: samman lignin autofluorescens (blå) och GALK fluorescens (röd, 565 nm) kanaler. Pilen anger första märkt cellväggen från den cambium illustrerar BLISS jämfört med autofluorescens ökad känslighet. (C) märkning i olika cell typer av sekundärt xylem och (D) som närbild på sekundärt xylem celler som illustrerar de märkning variationerna i olika lager av samma cellväggen. Vänstra panelen: samman lignin autofluorescens (blått) och HAZ fluorescens (grön, 526 nm) kanaler, mellersta panelen: samman lignin autofluorescens (blå) och GALK fluorescens (röd, 565 nm) kanaler, höger panel: samman lignin autofluorescens (blå), HAZ (grön) och GALK (röd) fluorescens kanaler. HAZ och GALK samtidig lokalisering är avbildad i gult. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kemiska reporter strategier såsom BLISS metoden presenteras här eller de enda-märkning förfaranden som tidigare publicerats av Tobimatsu et al. 8 kan därför tillåta en mycket finare studie än tidigare tillgängliga metoder såsom immuno- eller histochemical färgning samtidigt som den är mycket enkel att genomföra. Exempelvis figur 4 illustrerar som signal intensiteten för HAZ/GALK införlivandet i fiber Trakeider/kärl (FT) av de lin sekundärt Xylemen är mycket hög i de första par cellväggarna från cambium men successivt minskar i äldre celler. Denna profil är motsatt den för autofluorescens och anger att maximal lignification uppnås mycket snabbt i de första två till tre FT cellskikt från kambium. Däremot ray (R) celler verkar fortsätta lignification till mycket senare stadier av deras utveckling som HAZ/GALK införlivandet är mycket mer konstant i väggarna i alla celler från cambium till märgen. Det är inte förvånande att FT och R celltyper Visa kontrasterade lignification dynamik, eftersom dessa celltyper har olika biologiska roller med associerade skillnader i deras utvecklings program. FTs är verkligen långsträckt rör som mogen och dör snabbt, lämnar döda tomma celler med tjocka lignifierad väggar som spelar viktiga roller i både mekaniskt stöd och vertikal transport av vatten och mineraler, medan de smala raderna av R celler som komponera Xylemen strålar är levande i sin mogna och funktionella tillstånd utan tjocka lignifierad väggar.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Figur 4: Cell-specifika monolignol reporter inkorporering i lin xylem. Bright-fältet konfokalmikroskopi Visa (A) en del av en freehand tvärsnitt från en lin stam. Rosa (ray parenkymet celler, R) och gult (fiber tracheid celler, FT) pilar indikerar vektorer som spänner från zonen cambial mot märgen och skannas för lignin autofluorescens vid 405 nm (B), HAZ fluorescens på 526 nm (C) och G ALK fluorescens vid 565 nm (D). (E) vy av den sekundärt Xylemen. Vänstra panelen: samman lignin autofluorescens (blå), HAZ (grön) och GALK (röd) fluorescens kanaler. HAZ och GALK samtidig lokalisering är avbildad i gult. Högra panelen: Schematisk illustration av sekundärt xylem strukturen i lin stammen. V, fartyg; FT, fiber tracheid; R, ray parenkymet cell. Denna siffra har ändrats från Lion o.a. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Dessutom kan användningen av två distinkta kemiska reportrar motsvarande till H - och G-enheter med två bioorthogonal reaktioner i protokollet BLISS mer kvantitativa resultat ska erhållas. Multiplexed märkning strategier såsom BLISS kan ge ytterligare insikter om kontroll av monolignol inkorporering nyckeltal i olika förhållanden och kan bidra till dechiffrera den svårfångade lignification-processen. Om den relativa andelen H, G och S monolignoler i lignins är verkligen mycket varierande beroende på art, vävnad, ålder eller miljöförhållanden av anläggningen, förstås intrikata mekanismerna som reglerar denna komposition fortfarande inte helt. Den dubbla märkning tekniken representerar ett kraftfullt sätt att undersöka några av de parametrar som reglerar lignin sammansättning. Till exempel varierande HAZ: Gmed BLISS baserat påALK tillät oss att visa att lignin sammansättning i sekundärt xylem vävnader är direkt beroende av monolignol tillgänglighet inom cellväggarna, snarare än på peroxidas/BNCT specificitet (figur 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Figur 5: Effekten av ruvning lin Stem sektioner med olika procentsatser nyckeltal av HAZ och GALK. HAZ: GALK% nyckeltal ges ovanför varje stapel av siffror. Överst: samman HAZ och GALK kanaler. Botten: histogram som visar genomsnittliga fluorescensintensiteten hos HAZ och GALK för olika % nyckeltalen. Värdena uttrycks som medelvärdet av genomsnittlig fluorescensintensiteten grånivåer ± SD. skala bar = 100 µm. denna siffra har ändrats från Lion et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Lin odlas för dess bast fibrer (BF) som används för tillverkning av textilier, papper, lyx eller miljövänliga kompositmaterial. En viktig aspekt av deras industriella valorisering är att de innehåller mycket låga halter av lignin i sina cellväggar, som kännetecknas av en extremt tjock S2/G sekundär lager19,24. BLISS kan belysa lignification dynamics skillnader mellan de olika lagren av samma cellväggen. Figur 6A visar att HAZ och GALK reporter införlivandet är begränsade till cell hörn och mitten lamell/primära cellväggen hos vissa men inte alla bast fibrerna. Den totala avsaknaden av lignification i tjock bast fiber sekundär cell wall lager även när monolignol kemiska reportrar är exogent levereras avslöjar att deras hypolignified tillstånd uppstår från avsaknad av en molekylär miljö som är lämplig för enzymatiskt medierad oxidation och införlivande av monolignoler i en växande polymerkedja och att det inte är bara på grund av Transkriptionsreglering av monolignol biosyntes gener som tidigare rapporterade25. Denna observation också korrelerar väl med faktumen att lin peroxidas gener är uppreglerat i yttre stammen vävnader av lin kemiska lbf1 mutant som äger lignifierad bast fibrerna26.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Figur 6: BLISS belyser cellväggen underkonstruktion - eller lager-specifika skillnader. (A) vänstra panelen: ljusa-fältet bild av ett lin stem avsnitt. Cirkeln anger en fiber bunt. Högra panelen: närbild på bast fibrerna. Sammanslagna HAZ och GALK kanaler (med och utan ljus-fältet) visar att lignification är begränsad till cell hörn (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) och mitten lamell/primära cellväggen av vissa bast fibrerna. BF, bast fiber; Par, parenkymet cell; M, mitten lameller; P, primära cellväggen; S1, första lagret av sekundär cellvägg; S2/G, sekundär lager/gelatinös lager av sekundär cellvägg. (B) 2D skiva och 3D rekonstruktion av confocal z-stack zoom lin rot Endodermisen region. Casparian remsan (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) endast visar autofluorescens och inbegriper inte HAZ eller GALK. Den associerade fluorogram visar en GALK/hAZ anti korrelation: hög grön fluorescens är kopplat till låg röd signal (cortex) och vice versa (Endodermisen). Pericycle (P), Endodermisen (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Slutligen, denna två-färg metod kan också ge värdefull information om' lignification' cellväggen underordnade strukturer i olika utvecklingsstadier och i växten organ än stammen. Till exempel kännetecknas Endodermisen av lin rötter av förekomsten av ett Casparian band i dess radiella och tvärgående cellväggar under de tidiga stadierna av utveckling. Detta band av hydrofoba biopolymer, gjord av suberin eller lignin, hindrar vatten och lösta ämnen tas upp av roten kommer in passivt genom apoplast och tvingar dem att passera genom plasmamembranet via en symplastisk rutt och bidrar därmed till den selektivt upptag kapacitet av växternas rötter. När tillämpas på lin rötter, visade vår strategi att HAZ och GALK införlivas i tangentiell väggarna i endodermala cellerna såväl som i delar av de radiella väggarna där det Casparian bandet är frånvarande (figur 6B). Total avsaknad av monolignol reporter inkorporering i själva Casparian bandet tyder dock att det är mogen på denna utvecklingsstadier medan andra väggarna är fortfarande platsen för ytterligare biopolymer nedfall. Den rekonstruerade 3D-vy av en z-stack ger tydligt Casparian bandet till ljus. Intressant, väggarna i vissa kortikala celler som är angränsande till Endodermisen också visat sig kunna införliva HAZ prioriterat (därmed indikerar närvaron av lignin/suberin i lin rot cortex) men inte GALK. Samtidig lokalisering analys visade en anti korrelation mellan HAZ och GALK, som tyder på förekomsten av cell-specifika väggen struktur/enzymatisk maskiner i dessa två angränsande celltyper.
Kompletterande Tabell1: förberedelse av solid ½ MS Medium <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Tabell2: beredning av stamlösningar kemiska reporter <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, en dubbel märkning protokoll för att studera lignification dynamik, utvecklades. Reportrar och en sekventiell kombination av SPAAC och CuAAC bioorthogonal klicka med syntetiska monolignol reaktioner, denna metod banar vägen till djupgående analys av de faktorer som reglerar biogenes av lignins i planta.

Visualisera Lignification Dynamics i anläggningar med Klicka på kemi: dubbel märkning är BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysera Protein Dynamics Använda Hydrogen Exchange masspektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kvantitativa Proteomics Använda Reduktiv dimetylering för Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Unraveling Entropic Rate Accelerations Inducerad genom lösningsmedels Dynamisk i Membrane Enzymer

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

Kylningshastighet Beroende ellipsometri Mätningar som Bestäm Dynamisk av tunna glas- Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Kontinuerligt flöde kemi: Reaktion av Diphenyldiazomethane med p- Nitrobenzoic Acid

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Sondera strukturen och dynamiken i gränsskiktspänning vatten med Scanning Tunneling mikroskopi och spektroskopi

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna på ett effektivt sätt i växter

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

Nya tekniker för att observera strukturella dynamiken i Photoresponsive flytande kristaller

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...